Name: CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Lernen Sie CRISPR-Cas9-vermittelte Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafisch-Embryonen zur Modellierung von Long-QT-Syndrom-Varianten. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung mit visueller Detektion und Phänotypisierung.

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Diese Forschung wurde durch ein Canadian Institutes of Health Research Project Grant (T.W.C.) und Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants (T.W.C.) unterstützt.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Entwicklung präziser Genbearbeitungen mit CRISPR-Cas9 wird durch die geringe Effizienz von HDR-Mechanismen und deren effiziente Detektion herausgefordert. Hier wird ein CRISPR-Cas9-basierter Zwei-sgRNA-Exonersatzansatz beschrieben, der präzise Schnitte im Zebrafisch mit einfacher visueller Erkennung positiver Bearbeitungen erzeugt. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird durch die Erzeugung präziser Bearbeitungen im zkcnh6a-Gen nachgewiesen. Diese Arbeit zeigt, wie die Herzfunktion in geneditierten Zebrafischla...

CRISPR-basierte Gen-Editing-Strategien in Tiermodellen ermöglichen die Untersuchung genetisch vererbbarer Erkrankungen, Entwicklung und Toxikologie auf der Ebene des gesamten Organismus 1,2,3. Zebrafische bieten ein leistungsfähiges Modell, das in zahlreichen physiologischen Aspekten dem Menschen näher ist als murine oder humane Zellmodelle4. Eine breite Palette genetischer Werkzeuge und Strategien wurde im Zebrafisch sowohl für das Vorwärts-als auch für das umgekehrte genetische Screening6 verwendet. Umfassende genetische Kartierung und Annotation bei Zebrafischen haben Gen-Editing-Ansätze als primäre Technik zur Entwicklung gezielter Gen-Knockouts (KOs) und präziser Knock-Ins (KIs) erleichtert7.
Trotzdem ist die Erzeugung präziser KI-Bearbeitungen im Zebrafisch durch geringe Effizienz und die Schwierigkeit einer genauen Erkennung begrenzt. Obwohl Transkriptionsfaktor-ähnliche Effektornukleasen (TALENs) erfolgreich für KIs8 eingesetzt und optimiert wurden, bietet CRISPR eine verbesserte Gen-Editing-Strategie mit einfacherem sgRNA-Targeting. Zahlreiche Studien haben CRISPR verwendet, um präzise KIs im Zebrafisch 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 zu erzeugen, obwohl diese Bearbeitungen, die durch CRISPR-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur (HDR) erzeugt werden, tendenziell ineffizient mit geringem intrinsischem Erfolg sind. Raten, die eine Genotypisierung als primärer Screen erfordern 9,10,14,21. Dies zeigt die Notwendigkeit eines effizienten KI CRISPR-Systems im Zebrafisch sowie eines zuverlässigen Hochdurchsatzsystems zur Erkennung präziser Bearbeitungen.
Das Ziel dieser Studie war es, eine Plattform zur Erzeugung eines präzisen kardialen Gens KI in Zebrafischherzen mit einfacher und hochdurchsatzartiger Detektion erfolgreicher Bearbeitungen zu beschreiben. Es wird ein CRISPR-Cas9-basierter Zwei-sgRNA-Exonersatzansatz beschrieben, der auf einem TALEN-Ansatz8 basiert. Dieser Ansatz beinhaltet die Exzision der Zielsequenz unter Verwendung von Zwei-sgRNA-Guides und den Ersatz durch eine exogene Vorlagensequenz, die die interessierende KI sowie ein genetisch kodiertes intronisches Reportergen enthält (Abbildung 1). Die Integration eines genetisch kodierten fluoreszierenden Reporters in die intronische Zielgensequenz ermöglicht die effiziente Detektion positiver Edits. Anschließend wird eine Phänotypisierungsplattform zur Beurteilung der kardialen elektrischen Funktion in Zebrafischlarven zur nicht-invasiven Charakterisierung der Genvarianten beschrieben, die mit vererbtem LQTS assoziiert sind, einer kardialen elektrischen Störung, die Personen für den plötzlichen Herztod prädisponiert.
Diese Ansätze werden den Zugang zu und die Nutzung von Zebrafisch-KI-Genbearbeitungen verbessern, um Erbkrankheiten zu modellieren und biologische und physiologische Fragen wie die Kartierung von Genexpressionsmustern und die Entwicklungsregulation anzugehen. Da Zebrafischherzen bessere parallele humane kardiale elektrophysiologische Eigenschaften aufweisen als Mausmodelle, können sie als genetisch beherrschbares System für die Modellierung von Herzerkrankungen besonders attraktiv sein 7,22,23.

<table><tbody><tr><td>Program</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>TEFOR Infrastruktur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ENSEMBL</td><td>European Bioinformatics Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>Open Source (Github)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBiocalculator</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blackfly USB3 Kamera</td><td>Teledyne FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415C</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraktionskit</td><td>Omega Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAXIscript T7 Transkriptionskit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 5000 Inkubator</td><td>Barnstead Lab Line</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine T7 Ultra Transkriptionskit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ND1000 Spektralphotometer</td><td>Nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLI 100A Picoinjector</td><td>Harvard Gerät</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 305 Steroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini Sub Cell GT Elektrophoresesystem</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZebTec Zebrafischgehäuse System</td><td>Tecniplast</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SERVICES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gensynthese</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sanger Sequenzierung</td><td>Genewiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td>10&<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>beta; Kompetente Zellen</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X PCR-Puffer</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Nukleotidmischung</td><td>ABM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI Endonuklease mit Puffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI Endonuklease mit Puffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DR274 Plasmid (XL1 Blauer bakterieller Agarstab)</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI Endonuklease mit Puffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td> HEPES <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII Endonuklease mit Puffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLM3613 Plasmid (XL1 Blue </td><td>Addgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS-222 (Tricain)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKHR5 Plasmid (DH5&alpha; bakterieller Agar-Stab)</td><td>Addgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PmeI Endonuklease mit Puffer</td><td>NEB</td> SalI Endonuklease mit Puffer NEB <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligase mit Puffer</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE Puffer</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris Hydrochlorid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XhoI Endonuklease mit Puffer</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RECIPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td>Komponentenlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glühpuffer (pH 7,5-8,0)</td><td>10 mM Tris</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM</td><td>EDTA Sigma</td><td></td></tr><tr><td>E3 Medien (pH 7,2)</td><td>5 mM NaCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,17 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM CaCl2</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>0,33 mM MgSO4</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Injektionspuffer (pH 7,5)</td><td>20 mM HEPES</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>150 mM KCl</td><td>Sigma</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9-vermittelte präzise knock-in-bearbeitungen in zebrafischherzen

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) in Tiermodellen ermöglichen eine präzise genetische Manipulation zur Untersuchung physiologischer Phänomene. Zebrafische wurden als effektives genetisches Modell verwendet, um zahlreiche Fragen im Zusammenhang mit Erbkrankheiten, Entwicklung und Toxikologie auf der Ebene des gesamten Organs und des Organismus zu untersuchen. Aufgrund des gut annotierten und kartierten Zebrafischgenoms wurden zahlreiche Werkzeuge zur Gen-Editierung entwickelt. Die Wirksamkeit der Erzeugung und Leichtigkeit der Erkennung präziser Knock-In-Bearbeitungen mit CRISPR ist jedoch ein limitierender Faktor. Hier wird ein CRISPR-Cas9-basierter Knock-in-Ansatz mit dem einfachen Nachweis präziser Schnitte in einem Gen beschrieben, das für die kardiale Repolarisation verantwortlich ist und mit der elektrischen Störung Long QT Syndrome (LQTS) assoziiert ist. Dieser Zwei-Single-Guide-RNA-Ansatz (sgRNA) schneidet und ersetzt die Zielsequenz und verknüpft ein genetisch kodiertes Reportergen. Der Nutzen dieses Ansatzes wird durch die Beschreibung nicht-invasiver phänotypischer Messungen der kardialen elektrischen Funktion in Wildtyp- und geneditierten Zebrafischlarven demonstriert. Dieser Ansatz ermöglicht die effiziente Untersuchung krankheitsassoziierter Varianten in einem ganzen Organismus. Darüber hinaus bietet diese Strategie Möglichkeiten zum Einfügen exogener Sequenzen der Wahl, wie Reportergene, Orthologe oder Geneditoren.

Die erfolgreiche Verwendung dieses Zwei-sgRNA-Exonersatz-CRISPR-Ansatzes wird durch die Einführung und einfache Detektion einer präzisen Bearbeitung zur Entwicklung der LQTS-assoziierten Variante R56Q im zkcnh6a-Gen im Zebrafisch unterstrichen. Abbildung 6 zeigt repräsentative 3 dpf-Larven, die im einzelligen Embryostadium wie oben beschrieben mit CRISPR-Komponenten injiziert wurden. Abbildung 6A zeigt das Vorhandensein der YFP mVenus-Reportergenexpress...

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um präzise Knock-in-Bearbeitungen in Zebrafischembryonen mit der CRISPR-Cas9-Technologie zu ermöglichen. Eine Phänotypisierungspipeline wird vorgestellt, um die Anwendbarkeit dieser Techniken zur Modellierung einer Long-QT-Syndrom-assoziierten Genvariante zu demonstrieren.

CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Unser Protokoll bietet eine Pipeline für die präzise Integration und einfache visuelle Erkennung von CRISPR-Bearbeitungen sowie ein Beispiel für Post-Edit-Phänotypisierung. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die einfache CRISPR-Bearbeitungserkennung, die eine effiziente und vereinfachte Identifizierung erfolgreicher Bearbeitungen ermöglicht. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache Generierung und Charakterisierung von krankheitsassoziierten Varianten im Zebrafisch.Hier untersuchen wir das Long-QT-Syndrom. Folgestudien zu pharmazeutischen Therapien sind dann möglich. Beginnen Sie mit dem Entwurf von zwei sgRNA-Leitfäden, um die Knock-in-Zielortsequenz zu entfernen, indem Sie den Zebrafisch-Ortholog für das interessierende Gen identifizieren.Verwenden Sie Ensembl, um die Zielstelle innerhalb der interessierenden Gensequenz zu lokalisieren, einschließlich der Flankensequenz mit zwei Kilobasen, die zur Erstellung der Vorlage verwendet wurde. Verwenden Sie ein Design-Software-Tool wie CRISPOR und wählen Sie Danio Rerio-Spezies und Cas-Enzym aus. Für den Zwei-sgRNA-Ansatz wählen Sie eine sgRNA vor dem Zielexon und eine zweite sgRNA innerhalb des unmittelbaren Downstream-Introns.Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten sgRNAs eine hohe Spezifität und eine geringe vorhergesagte Off-Target-Bindung aufweisen. Verwenden Sie CRISPOR-Rankings, um Leitfäden mit minimaler Off-Target-Bindung zu identifizieren. Identifizieren Sie nun die wahrscheinlichsten potenziellen Off-Target-Stellen für die PCR-basierte Sanger-Sequenzierung der Genotypisierung.Nach der Auswahl der beiden sgRNAs erhalten Sie das umgekehrte Komplement für jeden, zwei komplementäre Oligos, die der Mutation vorausgehen, und zwei komplementäre Oligos stromabwärts der Mutation. Fügen Sie kompatible Restriktionsstellen auf jedem Oligo hinzu, um die Anleitung in das Plasmid Ihrer Wahl zu integrieren. Für die Integration der ausgewählten Führungssequenzen in das DR274-Plasmid erzeugen Sie einen Überhang mit einer BSA1-Restriktionsstelle mit fünf Primzahlen und konstruieren die BSA1-Erkennungsstellen an den fünf Hauptenden der Führungslinien.Als nächstes entwerfen Sie die exogene Vorlage für HDR im Zebrafisch, indem Sie zwei Sequenzfragmente auswählen, die das M-venöse YFP-Reportergen flankieren, das im PKHR5-Plasmid untergebracht ist. Teilen Sie die Vorlage in zwei Segmente, um sie auf beiden Seiten des M-venösen YFP-Reportergens einzufügen. Stellen Sie sicher, dass sich die geteilte Stelle in einem Intron befindet, um zu vermeiden, dass die Codierungssequenz unterbrochen wird.Integrieren Sie alle erforderlichen Modifikationen, die im Manuskript erwähnt werden, um das Klonen in das PKHR5-Plasmid zu erleichtern. Injizieren Sie die Embryonen etwa 40 Minuten nach der Befruchtung in das Einzellstadium. Nach drei Tagen Befruchtung betäuben Sie die Zebrafischlarve, indem Sie sie in eine 25-Millimeter-Petrischale mit 0,3% MS222 geben, bis sie ihren selbstaufrichtenden Reflex verlieren.Nach der Anästhesie die Larve in die Vertiefung einer 24-Well-Platte geben. Mit einem Mikroskop, das GFP oder YFP nachweisen kann, suchen Sie nach Reportergenfluoreszenz in den Augen der Larve. Nachdem Sie die Bilder der Larve aufgenommen haben, dokumentieren Sie das Vorhandensein oder Fehlen der Reportergenexpression.Um eine genaue und präzise HDR-Genbearbeitung zu bestätigen, führen Sie eine Genotypisierung durch, indem Sie die Larve drei Tage nach der Befruchtung betäuben, wie zuvor gezeigt, und die genomische DNA mit der Hotshot-Methode aus dem Schwanzclip isolieren. Fügen Sie den herausgeschnittenen Schwanzclip zu 15 Mikrolitern 25 Millimolar-Natriumhydroxid hinzu und inkubieren Sie ihn 20 Minuten lang bei 95 Grad Celsius, dann neutralisieren Sie ihn mit 1,5 Mikrolitern Tris-Salzsäure. Zentrifugieren Sie bei 13, 800 mal G für 30 Sekunden und behalten Sie den Überstand mit der extrahierten genomischen DNA.Erholen Sie sich die Larve in E3-Medien und bringen Sie sie in das Haltungssystem zurück, wenn weitere Studien beabsichtigt sind. Verwenden Sie die extrahierte genomische DNA als Vorlage, um PCR-basierte Sanger-Sequenzierung von On-Target- und potenziellen Off-Target-Sites durchzuführen. Stellen Sie sicher, dass das On-Target-Primer-Design die Mutationsstelle und die nächstgelegene sgRNA-Bindungsstelle erfasst.Entwerfen Sie einen separaten Sequenzierungsprimer, um den Übergang vom eingefügten Homologiearm und dem Zielgen zu erkennen, um die Integration in das interessierende Gen zu bestätigen. Entwerfen Sie Primer, um die drei wichtigsten potenziellen Off-Target-Standorte zu sequenzieren. Stellen Sie On- und Off-Target-Genotypisierung, Herzfrequenz, Perikarddimensionen, EKG-Phänotypisierung und Reportergendaten zusammen, die für jeden Zebrafisch identifizierbar sind.Die YFP M venöse Reportergenexpression wurde auf den Inseln beobachtet und fungierte als positiver Reporter für eine erfolgreiche Template-Integration. Es wurde festgestellt, dass Reportergen-positive Fische die präzise Bearbeitung G2A haben, die die R56Q-Variante in ZKCNH6A einführt. Die Messung der Perikarddimensionen als Verhältnis der Augenpartie ist hier dargestellt.Ein Trend der Bradykardie mit zunehmendem Perikardödem im Zusammenhang mit den Störungen der kardialen Repolarisation bei Zebrafischen wurde in den R56Q-Gen-editierten Larven beobachtet. EKG-Aufzeichnung von einem Zebrafischlarvenherz drei Tage nach der Befruchtung wird hier gezeigt. Der wichtigste Aspekt dieses Ansatzes ist das Leitliniendesign, wie es bei CRISPR-Verfahren häufig der Fall ist.Effektive Anleitungen sind für erfolgreiche CRISPR-Bearbeitungen unerlässlich. Alternative CRISPR-Methoden können befolgt werden, was mehr Präzision oder andere Funktionalitäten ermöglicht. Zusätzlich können große Gene eingefügt werden, wie z.B. ein primer Editierkomplex, der ein in vivo induzierbares Editiersystem bereitstellt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Eine einfache und effiziente Mikroinjektion Protokoll zur gen Bearbeitung im Channel Catfish Embryonen mit dem CRISPR/Cas9-System wird vorgestellt. In diesem Protokoll führen RNAs und Cas9 Protein wurden in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert. Dieses Protokoll wurde bestätigt durch zwei Channel Catfish immunvermittelte Gene ausschlagen.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

Gezielte Genom-Bearbeitung im Modellsystem Danio Rerio (Zebrafisch) wurde durch das Aufkommen von CRISPR-basierte Ansätze erheblich erleichtert. Hier beschreiben wir eine schlanke, robuste Protokoll für Erzeugung und Identifizierung von CRISPR-abgeleitete Unsinn Allele, die Heteroduplex Mobility Assay integriert und Identifizierung von Mutationen mit Next Generation Sequencing.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Ziel dieses Protokolls ist es, eine nahtlose CRISPR/Cas9-Bearbeitung des C. elegans-Genoms unter Verwendung von zusammengesetzten Ribonukleoproteinkomplexen und dem dpy-10-Co-CRISPR-Marker für das Screening zu ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von genetischen Modifikationen in C. elegans vorzunehmen, einschließlich Insertionen, Deletionen, Genersatz und Codon-Substitutionen.

CRISPR/Cas9-Editierung des C. elegans rbm-3.2-Gens mit dem dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker und Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer maternalen Mutante, das eine stabile zpc: cas9-Knock-in-Linie mit der Tol2-vermittelten Verabreichung von sgRNA-Expressionskassetten koppelt.

Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

Lernen Sie CRISPR-Cas9-vermittelte Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafisch-Embryonen zur Modellierung von Long-QT-Syndrom-Varianten. Diese Methode ermöglicht präzise Genomeditierung mit visueller Detektion und Phänotypisierung.

CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen

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