Name: Eine Plug-and-Display-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Bioengineering-Methode für äußere Membranvesikel als vielseitige Impfstoffplattform. Diese Technik ermöglicht die effektive Präsentation verschiedener Antigene zur Stärkung immunologischer Reaktionen.

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Diese Arbeit wurde vom Key Program der Chongqing Natural Science Foundation (No. cstc2020jcyj-zdxmX0027) und das Chinese National Natural Science Foundation Project (Nr. 31670936, 82041045).

1. Plasmidaufbau
<ol><li>Fügen Sie DNA, die die SpyCatcher-Sequenz (Supplementary File 1) kodiert, in ein Ampicillin-resistentes pThioHisA-ClyA-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Stellen BamH I und Sal I ein, um das Plasmid pThioHisA ClyA-SC nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren20.</li>
	<li>Ligate das synthetisierte SpyTag-RBD-Histag-Fusionsgen (Supplementary File 1) in ein pcDNA3.1-Plasmid (siehe Materialtabelle) zwischen den Standorten BamH I und EcoR I, um das Plasmid pcDNA3.1 RBD-ST nach einem zuvor veröffentlichten Bericht zu konstruieren19.</li>
</ol>2. OMV-SC Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie die ClyA-SC-Transformation mit den folgenden Schritten durch.<ol><li>5 μL pThioHisA ClyA-SC Plasmidlösung (50 ng/μL) zu 50 μL BL21 kompetentem Stamm geben, vorsichtig blasen und 30 min auf Eis abkühlen lassen.</li>
		<li>Die Lösung für 90 s in das Wasserbad bei 42 °C geben und dann sofort die gemischte Lösung für 3 min auf Eis legen.</li>
		<li>500 μL LB-Medium in die Bakteriensuspension geben und nach dem Mischen bei 220 U/min bei 37 °C für 1 h kultivieren.</li>
		<li>Die gesamte Umwandlung wird auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/ml, siehe Materialtabelle) und Kultur über Nacht bei 37 °C gelegt. HINWEIS: In nachfolgenden Experimenten wurde das Ampicillin in der gleichen Konzentration im Medium gehalten. Wenn nicht, kann dies zum Verlust von Plasmiden in den Bakterien führen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie für die OMV-SC-Produktion die folgenden Schritte aus.<ol><li>Eine einzelne Kolonie wird von der Platte isoliert (Schritt 2.1.4.) auf 20 ml LB (ampicillinresistentes) Medium und Kultur über Nacht bei 220 U/min bei 37 °C.</li>
		<li>Die Bakterienlösung (ab Schritt 2.2.1.) wird in 2 L Medium geimpft, bei 220 U/min, 37 °C für 5 h bis zum logarithmischen Wachstumsstadium kultiviert (der OD600nm liegt zwischen 0,6 und 0,8).</li>
		<li>Wenn der OD bei 600 nm der Bakterienlösung 0,6-0,8 erreicht, wird Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG, siehe Materialtabelle) hinzugefügt, um die Endkonzentration der Bakterienlösung auf 0,5 mM zu bringen, und dann über Nacht bei 220 U/min bei 25 °C kultiviert.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine OMV-SC-Reinigung durch.<ol><li>Zentrifugieren Sie die Bakterienlösung bei 7.000 x g bei 4 °C für 30 min.</li>
		<li>Filtern Sie den Überstand mit einem 0,22 μm Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer 100 kD Ultrafiltrationsmembran oder Hohlfasersäule (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Filtern Sie das Konzentrat durch einen 0,22-μm-Membranfilter, zentrifugieren Sie es dann bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h mit einer Ultrazentrifuge (siehe Materialtabelle) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.</li>
		<li>Resuspendieren Sie den Niederschlag mit PBS und lagern Sie ihn bei −80 °C. Die Lösung kann bei −80 °C langzeitstabil bleiben.</li>
	</ol></li>
</ol>3. RBD-ST Vorbereitung
<ol><li>Führen Sie die RBD-ST-Transfektion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Wählen Sie ein geeignetes eukaryotisches Expressionssystem (z. B. HEK293F) und kultivieren Sie die Zellen nach der Genesung über Nacht bei 130 U/min bei 37 °C.</li>
		<li>20 μL HEK293F-Zelllösung in den automatisierten Zellzähler geben (siehe Materialtabelle), die Anzahl der Zellen aufzeichnen, die Konzentration auf 1 x 106 Zellen/ml einstellen und dann die Zellen bei 130 U/min bei 37 °C für 4 h kultivieren.</li>
		<li>RBD-ST-Plasmid durch einen 0,22 μm Membranfilter filtern und 300 μg Plasmide in das Zellkulturmedium geben (siehe Materialtabelle), bis das Endvolumen 10 ml beträgt; 10 s schütteln.</li>
		<li>PEI (1 mg/ml, siehe Materialtabelle) im Wasserbad auf 65 °C erhitzen, 0,7 mL PEI mit 9,3 ml Zellkulturmedium mischen und 10 s intermittierend schütteln. HINWEIS: Schütteln Sie die Lösung nicht kräftig. Andernfalls können die entstehenden Blasen die Transfektionseffizienz beeinträchtigen.</li>
		<li>Plasmidlösung in die PEI-Lösung geben, die Mischung intermittierend 10 s schütteln und 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Die Mischung in 280 ml Zellkulturmedium geben und 5 Tage lang bei 130 U/min bei 37 °C kultivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine RBD-ST-Reinigung durch.<ol><li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 x g bei 25 °C für 20 min und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand aufzufangen.</li>
		<li>Füllen Sie die Säule mit 2 ml Ni-NTA-Agarose (siehe Materialtabelle) und waschen Sie sie 3x mit 3x PBS.</li>
		<li>Fügen Sie Imidazol (siehe Materialtabelle) in den Zellüberstand hinzu, um die Endkonzentration von 20 mM zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand 2x.</li>
		<li>Fügen Sie 3 Säulenvolumina (CV) PBS hinzu, die 20 mM Imidazol zum Waschen enthalten, und sammeln Sie die Waschfraktion.</li>
		<li>Gradientenelue mit 3 CV PBS mit niedrigen bis hohen Konzentrationen (z. B. 0,3 M, 0,4 M, 0,5 M) Imidazol; Elue 2x für jede Konzentration.</li>
		<li>Verwenden Sie SDS-PAGE21 , um den RBD-ST in verschiedenen Konzentrationsgradienten zu identifizieren.</li>
	</ol></li>
</ol>4. OMV-RBD Biokonjugation und Reinigung
<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit der BCA-Methode (siehe Materialtabelle).<ol><li>Die BSA-Standardproteinlösung wird in Serie von 2 mg/ml auf 0,0625 mg/ml verdünnt, die gereinigten OMV-SC und RBD-ST 10x verdünnt, und dann BCA-Arbeitslösungen A und B (im Assay-Kit enthalten) im Verhältnis 50:1 (v/v) gemischt.</li>
		<li>Verdünnte Proteinlösung (25 μL/Well) hinzufügen und mit BCA-Arbeitslösung mischen (200 μL/Well); Bei 37 °C 30 min inkubieren.</li>
		<li>Messen Sie die Absorption (OD) bei 562 nm jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve22.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine Biokonjugation von OMV-SC und RBD-ST durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Mischen Sie OMV-SC und RBD-ST in PBS im Verhältnis 40:1 (w/w).</li>
		<li>Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht bei 15 U/min bei 4 °C zu mischen. HINWEIS: Verschiedene Antigene können in unterschiedlichen Anteilen reagieren. Man könnte verschiedene Reaktionsverhältnisse basierend auf den Eigenschaften des Antigens ausprobieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Überprüfen Sie die Reaktionseffizienz.<ol><li>Bereiten Sie 10 μL OMV-SC, RBD-ST und das Reaktionsprodukt vor (Schritt 4.2.). Fügen Sie 2,5 μL 5x Ladepuffer hinzu (siehe Materialtabelle) und erhitzen Sie die Proben bei 100 °C für 5 min. Laden Sie die Proben in das Gel (10 μL/Well). Führen Sie die Elektrophorese bei 60 V für 20 min durch und ändern Sie den Zustand für 1 h auf 120 V.</li>
		<li>Übertragen Sie das Protein aus dem Gel auf PVDF-Western-Blotting-Membranen (siehe Materialtabelle) bei 100 V für 70 min.</li>
		<li>Die Membran in 5% fettfreies Milchpulver/TBST geben und 1 h schütteln. Dann 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln waschen.</li>
		<li>Legen Sie die Membran in 0,1% His-Tag-Antikörper/TBST (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie sie für 1 h, dann waschen Sie 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln.</li>
		<li>Legen Sie die Membran in 0,02% Anti-Maus-IgG1-Antikörper (HRP)/TBST (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie sie für 40 min, dann waschen Sie 3x mit TBST für 5 min pro Waschgang mit Schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie eine verbesserte Chemilumineszenzlösung hinzu (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Membran frei.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine Reinigung von OMV-RBD durch.<ol><li>1 ml der umgesetzten OMV-RBD-Lösung auf 10 ml verdünnen und die Verdünnung bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h zentrifugieren.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu verwerfen und den Rückstand mit 10 ml PBS aufzuheben. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 150.000 x g bei 4 °C für 2 h.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie den Rückstand mit 1 ml PBS. ANMERKUNG: Wenn die Löslichkeit des Antigens viel geringer ist, kann der gleiche Trenneffekt durch Größenausschlusschromatographie19 erreicht werden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Charakterisierung
<ol><li>Führen Sie dynamische Lichtstreuung (DLS) durch.<ol><li>Die Proben werden auf eine Konzentration von 100 μg/ml verdünnt und 1 ml Probe in die Probenzelle gegeben.</li>
		<li>Wählen Sie "Größe" für "Messtyp", "Protein" für "Probenmaterial", "Wasser" für "Dispergiermittel", "25 °C" für "Temperatur", laden Sie dann Proben und messen Sie automatisch23.</li>
	</ol></li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf.<ol><li>Die Proben werden auf 100 μg/ml verdünnt. Nehmen Sie ein Kupfergitter mit 200 Mesh, fügen Sie 20 μL Probe hinzu und lassen Sie es 10 Minuten lang absorbieren.</li>
		<li>Verwenden Sie Filterpapier, um die Lösung abzuleiten, fügen Sie 20 μL 3% Uranylacetat zum Trägerfilm hinzu und färben Sie für 30 s.</li>
		<li>Das Uranylacetat ableiten und die Folie auf natürliche Weise bei Raumtemperatur 1 h trocknen.</li>
		<li>Laden Sie die Proben in das TEM-System (siehe Materialtabelle) und erfassen Sie Bilder bei 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
<li>Micoli, F., MacLennan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle vaccines.</a> Seminars in Immunology. 50, 101433(2020).</li>
<li>Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+and+origins+of+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Types and origins of bacterial membrane vesicles.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).</li>
<li>Sartorio, M. G., Pardue, E. J., Feldman, M. F., Haurat, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles%3A+From+discovery+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles: From discovery to applications.</a> Annual Review of Microbiology. 75, 609-630 (2021).</li>
<li>Kaparakis-Liaskos, M., Ferrero, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+modulation+by+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immune modulation by bacterial outer membrane vesicles.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (6), 375-387 (2015).</li>
<li>Petousis-Harris, H., Radcliff, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploitation+of+Neisseria+meningitidis+group+B+OMV+vaccines+against+N-gonorrhoeae+to+inform+the+development+and+deployment+of+effective+gonorrhea+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploitation of Neisseria meningitidis group B OMV vaccines against N-gonorrhoeae to inform the development and deployment of effective gonorrhea vaccines.</a> Frontiers in Immunology. 10, 683(2019).</li>
<li>Gnopo, Y. M. D., Watkins, H. C., Stevenson, T. C., DeLisa, M. P., Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+outer+membrane+vesicles+as+immunomodulatory+systems+-+Reprogramming+bacteria+for+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Designer outer membrane vesicles as immunomodulatory systems - Reprogramming bacteria for vaccine delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 114, 132-142 (2017).</li>
<li>Zhang, Y. X., Fang, Z. Y., Li, R. Z., Huang, X. T., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+outer+membrane+vesicles+as+cancer+vaccines%3A+A+new+toolkit+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Design of outer membrane vesicles as cancer vaccines: A new toolkit for cancer therapy.</a> Cancers. 11 (9), 1314(2019).</li>
<li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environmental Microbiology. 15 (2), 347-354 (2013).</li>
<li>Huang, W. L., Meng, L. X., Chen, Y., Dong, Z. Q., Peng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+potential+biological+nanomaterials+for+antibacterial+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as potential biological nanomaterials for antibacterial therapy.</a> Acta Biomaterialia. 140, 102-115 (2022).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Robbiani, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+antibody+responses+to+SARS-CoV-2+in+convalescent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Convergent antibody responses to SARS-CoV-2 in convalescent individuals.</a> Nature. 584 (7821), 437-442 (2020).</li>
<li>Wang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2%3A+Structure%2C+Biology%2C+and+Structure-Based+Therapeutics+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269(2020).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+a+recombinant+tandem-repeat+dimeric+RBD-based+protein+subunit+vaccine+%28ZF2001%29+against+COVID-19+in+adults%3A+Two+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+phase+1+and+2+trials%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of a recombinant tandem-repeat dimeric RBD-based protein subunit vaccine (ZF2001) against COVID-19 in adults: Two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and 2 trials.</a> The Lancet Infectious Disease. 21 (8), 1107-1119 (2021).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccine-elicited+antibodies+to+SARS-CoV-2+and+circulating+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccine-elicited antibodies to SARS-CoV-2 and circulating variants.</a> Nature. 592 (7855), 616-622 (2021).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+mRNA+vaccination+induces+functionally+diverse+antibodies+to+NTD%2C+RBD%2C+and+S2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 mRNA vaccination induces functionally diverse antibodies to NTD, RBD, and S2.</a> Cell. 184 (15), 3936-3948 (2021).</li>
<li>Tan, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+prime-boost+protein+subunit+vaccine+strategies+against+SARS-CoV-2+in+mice+and+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of prime-boost protein subunit vaccine strategies against SARS-CoV-2 in mice and macaques.</a> Nature Communication. 12 (1), 1403(2021).</li>
<li>Thapa, H. B., Mueller, A. M., Camilli, A., Schild, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intranasal+vaccine+based+on+outer+membrane+vesicles+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An intranasal vaccine based on outer membrane vesicles against SARS-CoV-2.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 752739(2021).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+vaccines+based+on+the+receptor+binding+domain+%28RBD%29+and+heptad+repeat+%28HR%29+of+SARS-CoV-2+elicit+robust+protective+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle vaccines based on the receptor binding domain (RBD) and heptad repeat (HR) of SARS-CoV-2 elicit robust protective immune responses.</a> Immunity. 53 (6), 1315-1330 (2020).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBD-modified+bacterial+vesicles+elicited+potential+protective+immunity+against+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">RBD-modified bacterial vesicles elicited potential protective immunity against SARS-CoV-2.</a> Nano Letters. 21 (14), 5920-5930 (2021).</li>
<li>Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimer-PAGE%3A+A+method+for+capturing+and+resolving+protein+complexes+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multimer-PAGE: A method for capturing and resolving protein complexes in biological samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55341(2017).</li>
<li>Arslan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+total+protein+and+bioactive+protein+concentrations+in+bovine+colostrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Determining total protein and bioactive protein concentrations in bovine colostrum.</a> Journal of Visualized Experiments. (178), e63001(2021).</li>
<li>Alves, N. J., Turner, K. B., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+protein+packaging+within+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%3A+Design%2C+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Directed protein packaging within outer membrane vesicles from Escherichia coli: Design, production and purification.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54458(2016).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+transcriptomic+landscape+of+Escherichia+coli+BL21%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3).</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5285-5293 (2017).</li>
<li>Daleke-Schermerhorn, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoration+of+outer+membrane+vesicles+with+multiple+antigens+by+using+an+autotransporter+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Decoration of outer membrane vesicles with multiple antigens by using an autotransporter approach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (18), 5854-5865 (2014).</li>
<li>Kuipers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+outer+membrane+vesicles+displaying+high+densities+of+pneumococcal+antigen+at+the+surface+offer+protection+against+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Salmonella outer membrane vesicles displaying high densities of pneumococcal antigen at the surface offer protection against colonization.</a> Vaccine. 33 (17), 2022-2029 (2015).</li>
<li>Veggiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+polyproteams+built+using+twin+peptide+superglues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmable polyproteams built using twin peptide superglues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (5), 1202-1207 (2016).</li>
<li>Saunders, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+antibody+vaccine+for+pandemic+and+pre-emergent+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutralizing antibody vaccine for pandemic and pre-emergent coronaviruses.</a> Nature. 594, 553-559 (2021).</li>
<li>van Saparoea, H. B. V., Houben, D., Kuijl, C., Luirink, J., Jong, W. S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+protein+ligation+systems+to+expand+the+functionality+of+semi-synthetic+outer+membrane+vesicle+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Combining protein ligation systems to expand the functionality of semi-synthetic outer membrane vesicle nanoparticles.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 890(2020).</li>
<li>Needham, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+innate+immune+response+by+combinatorial+engineering+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulating the innate immune response by combinatorial engineering of endotoxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1464-1469 (2013).</li>
<li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Um eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform zu schaffen, wurde SC-fusioniertes ClyA in BL21(DE3)-Stämmen exprimiert, die aufgrund ihrer Vorteile bei der Proteinexpression24 eines der am weitesten verbreiteten Modelle für die rekombinante Proteinproduktion sind, so dass während des Prozesses der Bakterienproliferation genügend SC-Fragmente auf der Oberfläche der OMVs angezeigt werden. Gleichzeitig wurde ein ST-fusioniertes Zielantigen für die chemische Kopplung zwischen den Antigenen...

Als potenzielle Impfstoffplattform haben äußere Membranvesikel (OMVs) in den letzten Jahren immer mehr Aufmerksamkeit erregt 1,2. OMVs, die hauptsächlich auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien3 sezerniert werden, sind kugelförmige nanoskalige Partikel, die aus einer Lipiddoppelschicht bestehen, normalerweise in der Größe von 20-300nm4. OMVs enthalten verschiedene bakterielle Ausgangskomponenten, einschließlich bakterieller Antigene und pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs), die als feste Immunpotentiatoren dienen5. OMVs profitieren von ihren einzigartigen Komponenten, ihrer natürlichen Vesikelstruktur und ihren großartigen gentechnischen Modifikationsstellen und wurden für den Einsatz in vielen biomedizinischen Bereichen entwickelt, darunter bakterielle Impfstoffe6, Adjuvantien7, Krebsimmuntherapeutika8, Wirkstoffabgabevektoren9 und antibakterielle Klebstoffe10.
Die SARS-CoV-2-Pandemie, die sich seit 2020 weltweit ausbreitet, hat die globale Gesellschaft stark belastet. Die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) im Spike-Protein (S-Protein) kann an das humane Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) binden, das dann den Eintritt des Virus in die Zellevermittelt 11,12,13. Daher scheint RBD ein Hauptziel für die Impfstoffentdeckungzu sein 14,15,16. Monomere RBD ist jedoch schlecht immunogen, und ihr kleines Molekulargewicht erschwert es dem Immunsystem, sie zu erkennen, so dass häufig Adjuvantien erforderlich sind17.
Um die Immunogenität von RBD zu erhöhen, wurden OMVs mit polyvalenten RBDs konstruiert. Bestehende Studien, die OMV zur Darstellung von RBD verwenden, verschmelzen in der Regel RBD mit OMV, um in Bakterien exprimiert zu werden18. RBD ist jedoch ein vom Virus abgeleitetes Protein, und die prokaryotische Expression beeinflusst wahrscheinlich seine Aktivität. Um dieses Problem zu lösen, wurde das von Streptococcus pyogenes abgeleitete SpyTag (ST)/SpyCatcher (SC)-System verwendet, um ein kovalentes Isopeptid mit OMV und RBD in einem konventionellen Puffersystem19 zu bilden. Die SC-Domäne wurde mit Cytolysin A (ClyA) als Fusionsprotein durch biotechnologisch hergestellte Escherichia coli exprimiert, und ST wurde mit RBD über das HEK293F-Zellexpressionssystem exprimiert. OMV-SC und RBD-ST wurden über Nacht gemischt und inkubiert. Nach Reinigung durch Ultrazentrifugation oder Größenausschlusschromatographie (SEC) wurde OMV-RBD erhalten.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin-Natrium-Sangon</td><td>Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Zellzähler</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Protein-Quantifizierungskit</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touching Imaging System</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Danamic Light Scattering</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresegerät</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Puffer H 10X TBST Puffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>Ziege pAb zur Maus IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His-Tag Maus mAb</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td>A600277</tr><tr><td>Isopropyl beta-D-thiogalactopyranosid</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>Fettfreies Milchpulver</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293 Zellkulturmedium</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST Plasmid</td><td>Wuhan genecreat Biologische Technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer Kochsalzlösung</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin Linear</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC Plasmid</td><td>Wuhan genecreat biologische Technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF Western Blotting Membranen</td><td>Roche</td><td></td><td></td>03010040001</tr><tr><td>Quixstand Tischsysteme (100 kD Hohlfasersäule)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Ladepuffer (5x)</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Supersignal west pico PLUS (verbesserte Chemilumineszenzlösung)</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Suspensionsinstrument</td><td>Life Technology</td><td>Hula-Mischer</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Hitachi</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>Trypton-Oxoid-LP0042B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman-Schar</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolett-Spektralphotometer</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

eine "plug-and-display"-nanopartikel-impfstoffplattform basierend auf äußeren membranvesikeln mit sars-cov-2-rezeptorbindungsdomäne

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

Biomimetische Nanopartikel, die aus Bakterien oder Viren gewonnen werden, haben großes Interesse an der Impfstoffforschung und -entwicklung geweckt. Äußere Membranvesikel (OMVs) werden hauptsächlich von gramnegativen Bakterien während des durchschnittlichen Wachstums mit einem Durchmesser in Nanogröße und selbstadjuvanter Aktivität sezerniert, was ideal für die Impfstoffabgabe sein kann. OMVs haben als facettenreiches Liefersystem für Proteine, Nukleinsäuren und kleine Moleküle funktioniert. Um die biologischen Eigenschaften von OMVs voll auszuschöpfen, wurden biotechnologisch hergestellte Escherichia coli-abgeleitete OMVs als Träger und SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (RBD) als Antigen verwendet, um eine "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform zu konstruieren. Die Domänen SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) in Streptococcus pyogenes wurden angewendet, um OMVs und RBD zu konjugieren. Das Cytolysin A (ClyA)-Gen wurde nach Plasmidtransfektion mit dem SC-Gen als Fusionsprotein übersetzt, wobei eine reaktive Stelle auf der Oberfläche der OMVs zurückblieb. Nach dem Mischen von RBD-ST in einem konventionellen Puffersystem über Nacht wurde eine kovalente Bindung zwischen den OMVs und RBD gebildet. Somit wurde ein multivalent anzeigender OMV Impfstoff erreicht. Durch den Ersatz durch verschiedene Antigene kann die OMVs Impfstoffplattform eine Vielzahl heterogener Antigene effizient darstellen und so Epidemien von Infektionskrankheiten schnell verhindern. Dieses Protokoll beschreibt eine präzise Methode zum Aufbau der OMV Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Das Flussdiagramm für dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll könnte ein allgemeiner Ansatz zur Nutzung von OMVs als Impfstoffplattform sein. Man muss nur die geeigneten Expressionssysteme basierend auf der Art der Antigene auswählen.
Abbildung 2 zeigt ein realisierbares Plasmid-Design-Schema. Das SC-Gen ist über einen flexiblen Linker mit dem ClyA-Gen verbunden, während ST mit dem 5'-Terminal des RBD-Gens mi...

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Bioengineering von äußeren Membranvesikeln als "Plug-and-Display"-Impfstoffplattform, einschließlich Produktion, Reinigung, Biokonjugation und Charakterisierung.

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Biomimetic nanoparticles obtained from bacteria or viruses have attracted substantial interest in vaccine research and development. Outer membrane ...

Nanowissenschaften können die antigenspezifische Immunantwort effektiv verstärken, nachdem Antigene auf der Oberfläche von Der Hauptvorteil dieser Impfstoffplattform kann die Abnahme von Plaque und Display erreichen. Mit anderen Worten, die Plattform ist in der Lage, die Vielfalt der Antigene in Diese Methode kann auch auf andere biologische Nanopartikel angewendet werden, um Träger in Nanogröße anzuzeigen. Um eine Cytolysin A-Spionagekathetertransformation durchzuführen, beginnen Sie mit der Zugabe von fünf Mikrolitern Plasmalösung zu 50 Mikrolitern BL 21-kompetentem Stamm.Vorsichtig blasen und 30 Minuten auf Eis abkühlen lassen. Legen Sie die Lösung für 90 Sekunden in das Wasserbad bei 42 Grad Celsius und legen Sie dann sofort die gemischte Lösung für drei Minuten auf Eis. 500 Mikroliter Luria bertani-Medium in die Bakteriensuspension geben und nach Mischen der Kultur bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Als nächstes die gesamte Transformations-Luria-Bertani-Agarplatte, die Ampicillin und Kultur enthält, über Nacht bei 37 Grad Celsius ansiedeln. Für die OMV Spionagefängerproduktion beginnen Sie mit der Isolierung einer einzelnen Kolonie von der Platte auf 20 Milliliter Luria bertani Medium und Kultur über Nacht bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius. Die Bakterienlösung in ein Zwei-Liter-Medium inkubieren und fünf Stunden lang bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius kultivieren, bis das logarithmische Wachstumsstadium erreicht ist.Fügen Sie Isopropyl beta D-IPTG hinzu, um die Endkonzentration der Bakterienlösung auf 0,5 Millimol zu bringen, und kultivieren Sie dann über Nacht bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 25 Grad Celsius. Als nächstes führen Sie die OMV Spionagecatcher-Reinigung durch. Beginnen Sie mit Zentrien, die die Bakterienlösung verschmelzen.Filtern Sie den Überstand mit einem 0,22-Mikrometer-Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer Hohlfasersäule. Filtern Sie das Konzentrat durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter, schmelzen Sie es dann zwei Stunden lang mit einer Ultra-Zentri-Sicherung bei 150.000 mal G bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Setzen Sie den Niederschlag mit PBS wieder aus und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.Um eine RBD-Spytag-Transfektion durchzuführen, beginnen Sie mit der Auswahl eines geeigneten eukaryotischen Expressionssystems und kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius nach der Genesung. Geben Sie 20 Mikroliter HEK 293F Zelllösung in den automatisierten Zellzähler. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, stellen Sie die Konzentration auf eins mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter ein.Und dann kultivieren Sie die Zellen bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für vier Stunden. Filtern Sie RBD-Spionage-Tag-Plasmid durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter und fügen Sie 300 Mikrogramm Plasmide in das Zellkulturmedium ein, bis das endgültige Volumen 10 Milliliter beträgt. 10 Sekunden lang schütteln.PEI im Wasserbad auf 65 Grad Celsius erhitzen. Mischen Sie 0,7 Milliliter PEI mit 9,3 Milliliter Zellkulturmedium und schütteln Sie intermittierend für 10 Sekunden. Fügen Sie der PEI-Lösung Plasmidlösung hinzu.Schütteln Sie die Mischung intermittierend für 10 Sekunden und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Fügen Sie die Mischung zu 280 Milliliter Zellkulturmedium hinzu und kultivieren Sie sie fünf Tage lang bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius. Führen Sie als Nächstes eine RBD-Spytag-Reinigung durch.Beginnen Sie mit Zentrien, die die Zellen bei 6.000 mal G bei 25 Grad Celsius für 20 Minuten verschmelzen, und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu sammeln. Füllen Sie die Säule mit zwei Milliliter Nickel-NTA-Agarose und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Fügen Sie Imidazol in den Zellüberstand hinzu, um die Endkonzentration von 20 Millimol zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand.Fügen Sie drei Säulenvolumina PBS hinzu, die 20 Millimolar Imidazol zum Waschen enthalten, und sammeln Sie die Waschfraktion. Gradientenelue mit drei Säulenvolumina PBS mit niedrigen bis hohen Konzentrationen von Imidazolelue zweimal für jede Konzentration. Um die Proteinkonzentration nach der BCA-Methode zu bestimmen, verdünnen Sie die Standard-BSA-Proteinlösung seriell von zwei auf 0,0625 Milligramm pro Milliliter, verdünnen Sie den gereinigten OMV-Spionagefänger und den RBD-Spionagetag 10 mal.Dann mischen Sie BCA-Arbeitslösungen A und B im Verhältnis 50 zu eins. Fügen Sie eine verdünnte Proteinlösung hinzu und mischen Sie sie mit der BCA-Arbeitslösung. Bei 37 Grad 30 Minuten inkubieren.Messen Sie die Absorption bei 562 Nanometern jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve. Um eine Biokonjugation von OMV Spycatcher und RBD Spy Tag durchzuführen, mischen Sie OMV Spycatcher und RBD Spytag und PBS im Verhältnis 40 zu eins. Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht bei 15 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius zu mischen.Führen Sie die Reinigung von OMV RBD mit PBS-Lösung nach einem Verfahren durch, das der OMV Spionagefängerreinigung ähnelt. Das Plasma-Design-Schema zeigt, dass das Spycatcher-Gen über einen flexiblen Linker mit dem cly-A-Gen verbunden ist, während das Spytag mit den fünf Hauptterminals des RBD-Gens mit einem Hys-Tag-Gen zur Reinigung und Verifizierung verbunden ist. Nach der Ultrazentrifugation verblieben fast alle nicht reagierten RBD-Spytag im Überstand.Die zweite Ultrazentrifugation brachte keinen weiteren signifikanten Vorteil gegenüber dem ersten Mal. Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser des OMV Spionagefängers betrug 133 Nanometer, während er für OMV-RBD 152,6 Nanometer betrug. Diese Unterschiede können darauf zurückzuführen sein, dass RBD die OMV-Partikelgröße nach intensiver Anzeige erhöht.Die Ergebnisse von TEM stimmen mit der Partikelgrößenverteilung überein, die aus den DLS-Ergebnissen erhalten wird. Die Rotation zum Mischen der Mischung ist sehr wichtig. Die Effizienz der Reaktion kann ohne Rotation viel geringer sein.

a-plug-display-nanoparticle-vaccine-platform-based-on-outer-membrane

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll beschreibt ein allgemeines Verfahren für die Untersuchung rekombinanten Rezeptor-bindende Domäne (RBD)-basierte Subunit-Impfstoffe gegen SARS. Es umfasst Methoden für die Transfektion und Expression von RBD-Protein in 293T-Zellen, Immunisierung von Mäusen mit RBD und den Nachweis von Neutralisation Aktivität Mausseren anhand eines etablierten SARS pseudovirus Neutralisationstest.

Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von multivalent anzeigenden Impfstoffen mit äußerem Membranvesikel (OMV). Säugetierzellen werden transfiziert, um virale Antigene zu exprimieren und zu sezernieren, die mit einem SpyTag und einem Polyhistidin-Tag fusioniert sind. Diese Antigene werden dann mit einer Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätssäule aufgereinigt. Das gereinigte Antigen wird mit äußeren Membranvesikeln gemischt, die das oberflächengebundene SpyCatcher...

Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur pseudotyped Partikel in eine Einstellung "BSL-2" unter Einbeziehung der Spike-Protein des hoch pathogenen Viren Nahen Osten respiratorisches Syndrom und Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronaviren zu generieren. Diese pseudotyped Partikel enthalten eine Luciferase Reporter-gen ermöglicht die Quantifizierung der Virus Eintritt in Zielzellen Host.

Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren

Hier wird eine detaillierte Methode zur Beschreibung der Reinigung, Umfaltung und Charakterisierung selbstassemblierender Protein-Nanopartikel (SAPNs) für die Impfstoffentwicklung beschrieben.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Neutralisationsepitopen auf antigenanzeigenden virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Die Immunpräzipitation der aus dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleiteten VLPs erfolgt unter Verwendung von Hüllglykoproteinen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an Protein G-konjugierte magnetische Kügelchen gekoppelt sind. Gefangene VLPs werden anschließend einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung viraler...

Nachweis neutralisationsempfindlicher Epitope in Antigenen, die auf VLP-basierten Impfstoffen (Virus Like Particle) mit einem Capture-Assay angezeigt werden

In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt neue Werkzeuge für SPR-Bindungsassays zur Untersuchung der CV-N-Bindung an HA, S-Glykoprotein, verwandte Hybrid-Glykane und High-Mannose-Oligosaccharide. SPR wird verwendet, um das KD für die Bindung von entweder dimerem oder monomerem CV-N an diese Glykane zu bestimmen.

Entwicklung antiviraler Wirkstoffe mittels Oberflächenplasmonenresonanz

Hier beschreiben wir einen neu entwickelten Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay, der ein durchflusszytometrisches System mit zwei Reportern verwendet, um gleichzeitig zwei einzigartige Spike-Protein-Epitope auf intakten Viruspartikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu detektieren, die von Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-gekoppelten magnetischen Mikrosphären eingefangen wurden.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Wir stellen ein optimiertes In-vitro-Protokoll zur Herstellung von SARS-CoV-2-Virus-ähnlichen Partikeln vor, die das authentische Virus genau nachahmen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Virusinfektions-, Assemblierungs- und Austrittsmechanismen, ohne dass ein Labor der Biosicherheitsstufe 3 erforderlich ist.

Herstellung eines SARS-CoV-2 Virus ähnlichen Partikelsystems zur Untersuchung viraler Lebenszyklen in vitro

Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Erzeugung von SARS-CoV-2-Pseudotyp-Partikeln mit einem Luciferase-Reporter-System und deren Anwendung zur Identifizierung von Einstiegsinhibitoren. Diese Protokolle werden mit zwei verschiedenen Entry-Inhibitoren demonstriert, einem rekombinanten humanen ACE2-Fc-Fusionsprotein und der kleinmolekularen Verbindung Arbidol.

Verfahren zur Identifizierung von SARS-CoV-2-Eintrittsinhibitoren als potenzielle antivirale Mittel mittels MLV-basierten Pseudoviren

Erfahren Sie die Bioengineering-Methode für äußere Membranvesikel als vielseitige Impfstoffplattform. Diese Technik ermöglicht die effektive Präsentation verschiedener Antigene zur Stärkung immunologischer Reaktionen.

Eine Plug-and-Display-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne (Video) | JoVE Journal

Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

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