Eine "Plug-and-Display"-Nanopartikel-Impfstoffplattform basierend auf äußeren Membranvesikeln mit SARS-CoV-2-Rezeptorbindungsdomäne

Nanowissenschaften können die antigenspezifische Immunantwort effektiv verstärken, nachdem Antigene auf der Oberfläche von Der Hauptvorteil dieser Impfstoffplattform kann die Abnahme von Plaque und Display erreichen. Mit anderen Worten, die Plattform ist in der Lage, die Vielfalt der Antigene in Diese Methode kann auch auf andere biologische Nanopartikel angewendet werden, um Träger in Nanogröße anzuzeigen. Um eine Cytolysin A-Spionagekathetertransformation durchzuführen, beginnen Sie mit der Zugabe von fünf Mikrolitern Plasmalösung zu 50 Mikrolitern BL 21-kompetentem Stamm.

Vorsichtig blasen und 30 Minuten auf Eis abkühlen lassen. Legen Sie die Lösung für 90 Sekunden in das Wasserbad bei 42 Grad Celsius und legen Sie dann sofort die gemischte Lösung für drei Minuten auf Eis. 500 Mikroliter Luria bertani-Medium in die Bakteriensuspension geben und nach Mischen der Kultur bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.

Als nächstes die gesamte Transformations-Luria-Bertani-Agarplatte, die Ampicillin und Kultur enthält, über Nacht bei 37 Grad Celsius ansiedeln. Für die OMV Spionagefängerproduktion beginnen Sie mit der Isolierung einer einzelnen Kolonie von der Platte auf 20 Milliliter Luria bertani Medium und Kultur über Nacht bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius. Die Bakterienlösung in ein Zwei-Liter-Medium inkubieren und fünf Stunden lang bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius kultivieren, bis das logarithmische Wachstumsstadium erreicht ist.

Fügen Sie Isopropyl beta D-IPTG hinzu, um die Endkonzentration der Bakterienlösung auf 0,5 Millimol zu bringen, und kultivieren Sie dann über Nacht bei 220 Umdrehungen pro Minute bei 25 Grad Celsius. Als nächstes führen Sie die OMV Spionagecatcher-Reinigung durch. Beginnen Sie mit Zentrien, die die Bakterienlösung verschmelzen.

Filtern Sie den Überstand mit einem 0,22-Mikrometer-Membranfilter und konzentrieren Sie ihn dann mit einer Hohlfasersäule. Filtern Sie das Konzentrat durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter, schmelzen Sie es dann zwei Stunden lang mit einer Ultra-Zentri-Sicherung bei 150.000 mal G bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette. Setzen Sie den Niederschlag mit PBS wieder aus und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius.

Um eine RBD-Spytag-Transfektion durchzuführen, beginnen Sie mit der Auswahl eines geeigneten eukaryotischen Expressionssystems und kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius nach der Genesung. Geben Sie 20 Mikroliter HEK 293F Zelllösung in den automatisierten Zellzähler. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, stellen Sie die Konzentration auf eins mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter ein.

Und dann kultivieren Sie die Zellen bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius für vier Stunden. Filtern Sie RBD-Spionage-Tag-Plasmid durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter und fügen Sie 300 Mikrogramm Plasmide in das Zellkulturmedium ein, bis das endgültige Volumen 10 Milliliter beträgt. 10 Sekunden lang schütteln.

PEI im Wasserbad auf 65 Grad Celsius erhitzen. Mischen Sie 0,7 Milliliter PEI mit 9,3 Milliliter Zellkulturmedium und schütteln Sie intermittierend für 10 Sekunden. Fügen Sie der PEI-Lösung Plasmidlösung hinzu.

Schütteln Sie die Mischung intermittierend für 10 Sekunden und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten. Fügen Sie die Mischung zu 280 Milliliter Zellkulturmedium hinzu und kultivieren Sie sie fünf Tage lang bei 130 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius. Führen Sie als Nächstes eine RBD-Spytag-Reinigung durch.

Beginnen Sie mit Zentrien, die die Zellen bei 6.000 mal G bei 25 Grad Celsius für 20 Minuten verschmelzen, und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu sammeln. Füllen Sie die Säule mit zwei Milliliter Nickel-NTA-Agarose und waschen Sie sie dreimal mit PBS. Fügen Sie Imidazol in den Zellüberstand hinzu, um die Endkonzentration von 20 Millimol zu erreichen, und laden Sie den Zellüberstand.

Fügen Sie drei Säulenvolumina PBS hinzu, die 20 Millimolar Imidazol zum Waschen enthalten, und sammeln Sie die Waschfraktion. Gradientenelue mit drei Säulenvolumina PBS mit niedrigen bis hohen Konzentrationen von Imidazolelue zweimal für jede Konzentration. Um die Proteinkonzentration nach der BCA-Methode zu bestimmen, verdünnen Sie die Standard-BSA-Proteinlösung seriell von zwei auf 0,0625 Milligramm pro Milliliter, verdünnen Sie den gereinigten OMV-Spionagefänger und den RBD-Spionagetag 10 mal.

Dann mischen Sie BCA-Arbeitslösungen A und B im Verhältnis 50 zu eins. Fügen Sie eine verdünnte Proteinlösung hinzu und mischen Sie sie mit der BCA-Arbeitslösung. Bei 37 Grad 30 Minuten inkubieren.

Messen Sie die Absorption bei 562 Nanometern jeder Vertiefung und berechnen Sie die Proteinkonzentration aus der Standardkurve. Um eine Biokonjugation von OMV Spycatcher und RBD Spy Tag durchzuführen, mischen Sie OMV Spycatcher und RBD Spytag und PBS im Verhältnis 40 zu eins. Vertikal drehen, um die Mischung über Nacht bei 15 Umdrehungen pro Minute bei vier Grad Celsius zu mischen.

Führen Sie die Reinigung von OMV RBD mit PBS-Lösung nach einem Verfahren durch, das der OMV Spionagefängerreinigung ähnelt. Das Plasma-Design-Schema zeigt, dass das Spycatcher-Gen über einen flexiblen Linker mit dem cly-A-Gen verbunden ist, während das Spytag mit den fünf Hauptterminals des RBD-Gens mit einem Hys-Tag-Gen zur Reinigung und Verifizierung verbunden ist. Nach der Ultrazentrifugation verblieben fast alle nicht reagierten RBD-Spytag im Überstand.

Die zweite Ultrazentrifugation brachte keinen weiteren signifikanten Vorteil gegenüber dem ersten Mal. Der durchschnittliche hydrodynamische Durchmesser des OMV Spionagefängers betrug 133 Nanometer, während er für OMV-RBD 152,6 Nanometer betrug. Diese Unterschiede können darauf zurückzuführen sein, dass RBD die OMV-Partikelgröße nach intensiver Anzeige erhöht.

Die Ergebnisse von TEM stimmen mit der Partikelgrößenverteilung überein, die aus den DLS-Ergebnissen erhalten wird. Die Rotation zum Mischen der Mischung ist sehr wichtig. Die Effizienz der Reaktion kann ohne Rotation viel geringer sein.