Name: Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie die zellfreie Proteinsynthese mit linearen DNA-Vorlagen aus Exonuklease-V-Knockout-Stämmen von Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht schnelles Prototyping ohne Klonierung.

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ACB und JLF bestätigen die finanzielle Unterstützung durch den ANR SINAPUV-Zuschuss (ANR-17-CE07-0046). JLF und JB bestätigen die finanzielle Unterstützung durch den ANR SynBioDiag-Zuschuss (ANR-18-CE33-0015). MSA und JLF bestätigen die finanzielle Unterstützung durch den ANR iCFree-Zuschuss (ANR-20-BiopNSE). JB dankt dem ERC für die Unterstützung von "COMPUCELL" (Fördernummer 657579). Das Centre de Biochimie Structurale dankt der französischen Infrastruktur für integrierte Strukturbiologie (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). MK dankt der finanziellen Unterstützung durch die MICA-Abteilung von INRAe, die Université Paris-Saclay, das DIM-RFSI der Region Ile-de-France (IdF) und ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Diese Arbeit wurde durch den European Research Council Consolidator Award (865973 an CLB) gefördert.

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Hier zeigen wir, dass Zelllysat, hergestellt aus E. coli BL21 Rosetta2 mit einem genomischen Knockout für recB - oder recBCD-Operon , eine hohe Proteinexpression aus linearen DNA-Vorlagen unterstützt. Dieses Protokoll erarbeitet ein schrittweises Lysat-Kalibrierungsverfahren speziell für lineare DNA-Templates (Abbildung 2), ein kritischer Schritt, der zur hohen Expression von σ70-Promotoren in linearer DNA führt und plasmidnahe Konzentrationen für äquimolare DNA-Ko...

Zellfreie Proteinsynthesesysteme (CFPS) werden zunehmend als schnelle, einfache und effiziente Methode für die Biosensortechnik, die dezentrale Herstellung und das Prototyping genetischer Schaltkreise eingesetzt1. Aufgrund ihres großen Potenzials werden CFPS-Systeme regelmäßig im Bereich der synthetischen Biologie eingesetzt. Bisher sind CFPS-Systeme jedoch auf zirkuläre Plasmide angewiesen, die das volle Potenzial der Technologie einschränken können. Die Herstellung von Plasmid-DNA hängt von vielen zeitaufwändigen Schritten während der Klonierung und großen Mengen an DNA-Isolierung ab. Auf der anderen Seite kann die PCR-Amplifikation aus einem Plasmid oder einer synthetisierten DNA-Vorlage verwendet werden, um CFPS-Templates einfach innerhalb weniger Stunden herzustellen 2,3. Daher bietet die Anwendung von linearer DNA eine vielversprechende Lösung für CFPS. Lineare DNA wird jedoch schnell durch Exonukleasen abgebaut, die natürlicherweise in zellulären Extrakten vorkommen4. Es gibt Lösungen, die dieses Problem angehen, wie die Verwendung des λ-Phagen-GamS-Proteins5 oder DNA, die Chi-Stellen6 enthält, als Schutzmittel oder der direkte Schutz der linearen DNA durch chemische Modifikation ihrer Enden 2,7,8,9. Alle diese Methoden erfordern Ergänzungen des Zellextrakts, die kostspielig und zeitaufwendig sind. Es ist seit langem bekannt, dass der Exonuklease-V-Komplex (RecBCD) lineare DNA inZelllysaten abbaut4. Kürzlich haben wir gezeigt, dass lineare DNA in Lysaten aus Zellen, die für Exonuklease-Gene (recBCD) ausgeschaltet wurden, viel besser geschützt werden kann10.
In diesem Protokoll werden Schritte zur Herstellung zellfreier Lysate aus dem E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD-Stamm durch Ultraschalllyse detailliert beschrieben. Die Beschallungslyse ist eine gängige und erschwingliche Technik, die von mehreren Labors eingesetztwird 11,12. Die aus diesem Stamm hergestellten Extrakte benötigen keine zusätzliche Komponente oder DNA-Vorlagenmodifikation, um die Expression aus linearen DNA-Templates zu unterstützen. Die Methode beruht auf dem wesentlichen Schritt der Pufferoptimierung für Zellextrakte speziell für die lineare DNA-Expression aus nativen E. coli-Promotoren. Es hat sich gezeigt, dass diese spezifische Pufferoptimierung für die lineare DNA-Expression der Schlüssel für native σ70-Promotoren ist, um eine hohe Proteinproduktion ohne GamS-Protein- oder Chi-DNA-Supplementierung zu erzielen und sogar die Reinigung der PCR-Produkte zu vermeiden10. Es wurde festgestellt, dass die optimale Konzentration von Mg-glu für die lineare DNA-Expression ähnlich der für Plasmid-DNA ist. Die optimale Konzentration von K-glu zeigte jedoch einen wesentlichen Unterschied zwischen linearer und Plasmid-DNA, wahrscheinlich aufgrund eines transkriptionsbezogenen Mechanismus10. Die Funktionalität von Proteinen, die mit dieser Methode exprimiert werden, wurde für verschiedene Anwendungen nachgewiesen, wie z.B. das schnelle Screening von Zehengriffschaltern und die Aktivitätsbewertung von Enzymvarianten10.
Dieses Protokoll bietet eine einfache, effiziente und kostengünstige Lösung für die Verwendung linearer DNA-Templates in zellfreien E. coli-Systemen durch einfache Verwendung mutierter ΔrecBCD-Zellextrakte und spezifischer Kalibrierung für lineare DNA als Vorlage.

<table><tbody><tr><td>2-YT Bouillon</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Safe-Lock Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td></tr><tr><td>384-Well-Mikrotiterplatte mit quadratischem Boden</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Phosphoglycerinsäure, Dinatrium)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Klebeplattendichtung</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosin-5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 & Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 & Delta; recBCD</td><td>Addgen</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenosin 3' 5'-cyclisches Monophosphat)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (Coenzym A-Hydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL PP Zentrifugenröhrchen, Gestell verpackt mit CentriStar Kappe, steril</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>15 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Corning 50 mL PP Zentrifugenröhrchen, konischer Boden mit CentriStar Kappe, steriles</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>50 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>CTP (Cytidin 5'-triphosphat, Dinatriumsalz Hydrat)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTB (DL-Dithiothreitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Folinsäure (feste Folinsäure, Calciumsalz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosin-5?-Triphosphat,&nbsp; Dinatriumsalz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K Phosphat zweibasisch (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K Phosphat einbasig (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-Glutamat</td><td>Alfa Aesar A17232</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mg-Glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,22 & Mikro; m, Polyethersulfon</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Membranfilter 0,22 &micro; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & DNA-Aufreinigungskit</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & DNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Plasmid Miniprep Kit</td></tr><tr><td>NAD (B-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Hydrat)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NIST-rückführbarer FITC-Standard</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plasmid Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Aufgereinigtes rekombinantes EGFP-Protein</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>rekombinantes eGFP</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>fluorometrischer Assay mit DNA-bindendem Farbstoff</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td></td><td></td><td>Gereinigtes Wasser aus dem Millipore RiOs 8 System, sterilisiert durch Autoklavieren.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Life Science Produkte Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallprozessor Vibrazelle VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>Ultraschallgerät</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridin 5'- Triphosphat, Trinatriumsalzhydrat)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Wasser, nukleasefrei</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>nukleasefreies Wasser</td></tr></tbody></table>

zellfreie proteinsynthese aus exonuklease-defizienten zellextrakten unter verwendung linearer dna-vorlagen

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

Die zellfreie Proteinsynthese (CFPS) ist in letzter Zeit aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile im Bereich der synthetischen Biologie sehr populär geworden. Die Verwendung linearer DNA-Templates für CFPS wird es der Technologie ermöglichen, ihr volles Potenzial auszuschöpfen und die experimentelle Zeit zu verkürzen, indem die Schritte des Klonens, der Transformation und der Plasmidextraktion eliminiert werden. Lineare DNA kann schnell und einfach durch PCR amplifiziert werden, um hohe Konzentrationen der Vorlage zu erhalten, wodurch eine mögliche In-vivo-Expressionstoxizität vermieden wird. Lineare DNA-Templates werden jedoch durch Exonukleasen, die natürlicherweise in den Zellextrakten vorhanden sind, schnell abgebaut. Es gibt mehrere Strategien, die vorgeschlagen wurden, um dieses Problem anzugehen, wie die Zugabe von Nukleaseinhibitoren oder die chemische Modifikation linearer DNA-Enden zum Schutz. Alle diese Strategien kosten zusätzliche Zeit und Ressourcen und müssen noch plasmidnahe Proteinexpressionswerte erreichen. Ein detailliertes Protokoll für eine alternative Strategie zur Verwendung linearer DNA-Templates für CFPS wird hier vorgestellt. Durch die Verwendung von Zellextrakten aus Exonuklease-defizienten Knockout-Zellen bleiben lineare DNA-Templates intakt, ohne dass Endmodifikationen erforderlich sind. Wir stellen die Herstellungsschritte von Zelllysat aus Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD Stamm durch Ultraschalllyse und Pufferkalibrierung für Mg-Glutamat (Mg-glu) und K-Glutamat (K-glu) speziell für lineare DNA vor. Diese Methode ist in der Lage, Proteinexpressionsniveaus zu erreichen, die mit denen von Plasmid-DNA in E. coli CFPS vergleichbar sind.

Repräsentative Ergebnisse sind hier nach Kalibrierung des Lysats für optimale Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Spiegel getrennt für lineare und Plasmid-DNA dargestellt (Abbildung 1). Die optimale Mg-Glutamat-Konzentration ist bei Δ recB- undΔ-recBCD-Extrakten bei 8 mM ähnlich (Abbildung 1B). Die optimale K-Glutamatkonzentration für Plasmid-DNA beträgt jedoch 140 mM, während die optimale K-Glutamat-Konzentration für lineare DNA für denselben Extrakt ...

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Pufferkalibrierung von Zellextrakten aus Exonuklease-V-Knockout-Stämmen von Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD und ΔrecB) vorgestellt. Dies ist ein schneller, einfacher und direkter Ansatz für die Expression in zellfreien Proteinsynthesesystemen mit linearen DNA-Vorlagen.

Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

Das Protokoll ist sehr wichtig, da es eine schnelle, einfache und direkte Verwendung von linearen DNA-Vorlagen in zellfreien Proteinsynthesesystemen ermöglicht, sogar aus nativen E.coli-Parametern. Die Hauptvorteile sind die Zeitersparnis durch die Vermeidung von Klonen, chemischen Modifikationen linearer DNA-Enden und schützender Nahrungsergänzungsmittel wie Gamma- oder Chi-DNA. Da selbstberichtende Syntheseextrakte für verschiedene Organismen von Interesse entwickelt werden, bietet unsere Methode eine Möglichkeit, das Prototyping in diesen Extrakten durch die Verwendung linearer DNA zu beschleunigen.Um zu beginnen, BL21 Rosetta-2 delta recBCD von minus 80 Grad Celsius Glycerin-Brühe auf eine 2x YTP-Agarplatte zu streifen, die 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol enthält, und über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren. Dann inokulieren Sie eine einzelne Kolonie von der Agarplatte in etwas mehr als 40 Milliliter 2x YTP, ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol, und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 200 U/min Schütteln. Als nächstes machen Sie eine Subkultur, indem Sie die Nachtkultur 100 Mal in vier Liter frische 2x YTP-Medien mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol verdünnen.Teilen Sie die vier Liter des Mediums in vier separate Kolben. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius, 200 U/min, für etwa drei bis vier Stunden Wachstum, um eine optische Dichte von 1,5 bis 2,0 zu erreichen. Die Kultur auf Eis legen, die Zellen bei 5.000 G für 12 Minuten bei vier Grad Celsius herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen.Dann resuspendieren Sie die Zellpellets in 800 Milliliter gekühltem S30A mit DTT. Auch hier werden die Zellen bei 5.000 G für 12 Minuten bei vier Grad Celsius wie zuvor demonstriert heruntergedreht und der Überstand durch Dekantieren verworfen. Nach der Resuspendierung von Zellpellets in 160 Milliliter gekühltem S30A mit DTT werden die Zellen in gekühlte und vorgewogene 50-Milliliter-Röhrchen überführt.Die Zellen bei 2000 G für acht Minuten bei vier Grad Celsius herunterdrehen und dann den Überstand durch Dekantieren verwerfen. Auch hier drehen Sie die Zellen bei 2000 G für vier Minuten bei vier Grad Celsius herunter und entfernen Sie dann den verbleibenden Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Messen Sie dann das Gewicht des Röhrchens erneut, um das Gewicht des Zellpellets zu berechnen, und halten Sie die Zellpellets bei minus 80 Grad Celsius.Nachdem Sie die Zellpellets ab minus 80 Grad Celsius entnommen haben, tauen Sie sie ein bis zwei Stunden auf Eis auf und resuspendieren Sie die Zellpellets in 0,9 Milliliter S30A mit DTT-Puffer pro Gramm des Zellpelletgewichts. Dann pipetten Sie langsam, um die Zellen zu resuspendieren, und vermeiden Sie den oberen Schaum so weit wie möglich. Ein-Milliliter-Aliquots der resuspendierten Zellen in 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen geben und auf Eis oder einem vorgekühlten kalten Block bei vier Grad Celsius aufbewahren.Als nächstes beschallen Sie jedes Röhrchen in einem Ultraschallgerät mit einer Einstellung von 20% Amplitude für drei Zyklen und drehen Sie das Lysat bei 12.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius herunter. Nach dem Sammeln des Überstands mit einer Pipette in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführen. Inkubieren Sie das Zelllysat bei 37 Grad Celsius bei 200 U/min Rühren für 80 Minuten.Nach dem Abschleudern des Lysats und dem Sammeln des Überstands in vorgekühlten 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen aliquot 30 Mikroliter in vorgekühlten PCR-8-Streifen-Röhrchen, während alle Röhrchen auf Eis gehalten werden. Die Lysataliquots auf Trockeneis einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Bereiten Sie eine Mastermischung gemäß der Registerkarte Puffervorbereitung vor, wie im Manuskript beschrieben.Bei einem Reaktionsvolumen von 10,5 Mikrolitern 1,05 Mikroliter verschiedener Mg-Glutamat-Stammkonzentrationen und 9,45 Mikroliter der Mastermischung zugeben und vorsichtig mischen. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der oben genannten Reaktionen in eine 384-Well-Quadratboden-Mikroplatte und bedecken Sie sie mit einer Klebeplattendichtung. Messen Sie die Genexpression als Fluoreszenzausgabe, indem Sie Fluoreszenzdaten mit einem Plattenleser in regelmäßigen Abständen für acht Stunden Inkubation bei 30 Grad Celsius mit kontinuierlichem Orbitalschütteln bei 307 Zyklen pro Minute aufzeichnen.Nachdem Sie die Mg-Glutamat-Konzentration identifiziert haben, die am Endpunkt zu dem höchsten Fluoreszenzwert führt, fahren Sie mit der K-Glutamat-Kalibrierung fort. Führen Sie das Experiment durch und identifizieren Sie den höchsten Fluoreszenzwert aus den getesteten K-Glutamat-Konzentrationen, wodurch die optimale Pufferzusammensetzung für Mg-Glutamat und K-Glutamat für dieses Lysat ermittelt wird. Sobald die Mg-Glutamat- und K-Glutamat-Werte ermittelt sind, werden die Lagerröhrchen der optimierten Pufferzusammensetzung entsprechend dem erhaltenen Chargenvolumen vorbereitet.Nach Berechnung der Anzahl der benötigten Pufferrohre aliquot 38 Mikroliter pro Röhrchen aliquotieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Markieren Sie zunächst ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen für die optimale Master-Mix-Zubereitung. Fügen Sie die richtigen Mengen des Puffers hinzu und lysieren Sie sie und mischen Sie sie vorsichtig.Dann pipetten Sie zuerst die DNA-Proben, gefolgt von nukleasefreiem Wasser und schließlich dem optimalen Mastermix. Mischen Sie die zellfreie Reaktion vorsichtig mit einer Pipette, kurz bevor Sie sie in den Plattenleser geben, und vermeiden Sie Blasen. Nach dem Einrichten der Reaktionen im Plattenleser zeichneten kinetische Läufe in regelmäßigen Abständen Fluoreszenzdaten für acht Stunden Inkubation bei 30 Grad Celsius mit kontinuierlichem Orbitalschütteln bei 307 Zyklen pro Minute auf.Nach der Kalibrierung des Lysats war die optimale Konzentration von Mg-Glutamat bei acht Millimolar über Extrakte sowohl für lineare als auch für Plasmid-DNA ähnlich. Die optimale K-Glutamatkonzentration für Plasmid-DNA beträgt jedoch 140 Millimolar, während die optimale K-Glutamatkonzentration für lineare DNA 20 Millimol beträgt. Nach den Kalibrierungsschritten wurden die Konzentrationen der GFP-Expressionen zwischen linearer und Plasmid-DNA in den Wildtyp-, Delta-recB- und Delta-recBCD-Extrakten verglichen.Die GFP-Expression aus linearer DNA erreichte 102% bzw. 138% der Expression aus Plasmid-DNA in Extrakten aus delta recB- bzw. delta recBCD-Stämmen. Die wichtigsten Punkte im Protokoll sind die Ultraschalllyse der Zelle und die getrennten Pufferkalibrierungsschritte für lineare und Plasmid-DNA, insbesondere bei Verwendung der nativen Parameter. Diese Technik würde dazu beitragen, das Testen biologischer Designs in zellfreien Systemen zu beschleunigen, zum Beispiel das Screening von Biosensoren, Enzymen und Signalwegen oder das Prototyping synthetischer genetischer Schaltkreise.

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Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Zellfreie Expressionssysteme sind leistungsstarke und kostengünstige Werkzeuge für den Hochdurchsatz-Synthese und Screening von wichtigen Proteinen. Hier beschreiben wir die Vorbereitung der zellfreien Protein Expressionssystems mit Vibrio Natriegens für die schnelle Proteinproduktion Plasmid-DNA, lineare DNA und mRNA-Vorlage verwenden.

Zellfreien Protein Ausdruck mithilfe der rasch wachsenden Bakterium Vibrio natriegens

Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.

Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs

Die Studie beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung großer (μg-mg) Mengen an DNA für Protein-Screening-Kampagnen aus synthetischen Genfragmenten ohne Klonen oder Verwendung lebender Zellen. Die minimale Schablone wird enzymatisch verdaut und zirkuliert und dann mit isothermer Rollkreisamplifikation amplifiziert. Zellfreie Expressionsreaktionen könnten mit dem ungemeinigten Produkt durchgeführt werden.

Schnelle, enzymatische Methoden zur Amplifikation minimaler, linearer Templates für das Protein-Prototyping mit zellfreien Systemen

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle und einfache Methode zur Herstellung von bakteriellem Lysat für die zellfreie Genexpression unter Verwendung eines technisch hergestellten Stammes von Escherichia coli und erfordert nur Standardlaborgeräte.

Schnelle, kostengünstige und unkomplizierte Herstellung von bakteriellem zellfreiem Lysat

Gut charakterisierte genetische Teile sind für das Design neuartiger genetischer Schaltkreise notwendig. Hier beschreiben wir eine kostengünstige Hochdurchsatzmethode zur schnellen Charakterisierung genetischer Teile. Unsere Methode reduziert Kosten und Zeit durch die Kombination von zellfreien Lysaten, linearer DNA zur Vermeidung von Klonen und akustischem Flüssigkeitshandling, um den Durchsatz zu erhöhen und das Reaktionsvolumen zu reduzieren.

Schnelle Charakterisierung genetischer Teile mit zellfreien Systemen

Diese Arbeit beschreibt die Herstellung von Zellextrakt aus Escherichia coli (E. coli ) gefolgt von zellfreien Proteinsynthesereaktionen (CFPS) in weniger als 24 Stunden. Die Erläuterung des CFAI-Protokolls (Cell-Free Autoinduction) beschreibt Verbesserungen, die vorgenommen wurden, um die Aufsicht der Forscher zu reduzieren und die Mengen des erhaltenen Zellextrakts zu erhöhen.

Von der Zelle zur zellfreien Proteinsynthese innerhalb von 24 Stunden mit zellfreiem Autoinduktions-Workflow

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Erfahren Sie die zellfreie Proteinsynthese mit linearen DNA-Vorlagen aus Exonuklease-V-Knockout-Stämmen von Escherichia coli. Diese Methode ermöglicht schnelles Prototyping ohne Klonierung.

Zellfreie Proteinsynthese aus Exonuklease-defizienten Zellextrakten unter Verwendung linearer DNA-Vorlagen

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