Name: ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Erfahren Sie die Optimierung von ATAC-seq für epitheliale Zelltypen in der Krebsforschung. Diese Methode identifiziert chromatinzugängliche Regionen und liefert wertvolle Einblicke in epigenetische Veränderungen bei Erkrankungen.

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Wir danken der UND Genomics Core Facility für die hervorragende technische Unterstützung.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [P20GM104360 bis M.T., P20 GM104360 bis A.D.] und Anschubfonds der University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [bis M.T.] finanziert.

1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments
<ol><li>Lysepufferlager vorbereiten. HINWEIS: Der optimale nukleare Isolationspuffer kann für jeden Zelltyp unterschiedlich sein. Wir empfehlen, sowohl den im Originalpapier8 verwendeten hypotonischen Puffer als auch einen CSK-Puffer12,13 für jeden Zelltyp unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zu testen.<ol><li>Zur Herstellung des hypotonischen Puffers (Greenleaf-Puffer) mischen Sie 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 und 0,1% NP-40.</li>
		<li>Zur Herstellung des CSK-Puffers mischen Sie 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mMMgCl2 und 0,1% Triton X-100.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturbedingungen optimal sind; Untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass es keine erhöhten Apoptosewerte gibt.</li>
	<li>Schalten Sie die Zentrifuge ein, damit sie 4 °C erreicht.</li>
</ol>2. Zellernte
<ol><li>Absaugen von Medien aus einer Zellkultur bei <80% Konfluenz. Zellen werden typischerweise in einer 35 mm oder 60 mm Schale gezüchtet, basierend auf der Anzahl der benötigten Zellen, Behandlungen usw.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 1 ml oder 3 ml PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml oder 1 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 2-3 min (abhängig von den Zelltypen). Verwenden Sie vorsichtig eine 1-ml-Pipette, um gut zu mischen.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml oder 2 ml Medien auf die Platte und mischen Sie gut. Transfer in ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen für 3 min bei 300 x g. HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren.</li>
	<li>Saugen Sie das Medium ab und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml oder 2 ml Medium. HINWEIS: Es ist wichtig, eine homogene Einzelzelllösung herzustellen. Für Gewebe kann ein Dounce-Homogenisator verwendet werden, um Gewebe zu homogenisieren und große Zellklumpen oder Aggregate zu minimieren. Einige Gewebe erfordern Filtration (z. B. Zellsiebe) und/oder FACS-Zellsortierung, um lebensfähige Zellen zu isolieren und eine Einzelzelllösung zu erhalten.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Zellzählers. HINWEIS: In dieser Studie wurde ein automatisierter Zellzähler (Table of Materials) verwendet.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das erforderliche Zellvolumen (z. B. ein Volumen mit 1 x 106 Zellen basierend auf der Zellzahl) bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 x 106 Zellen in 1 ml kaltem PBS. HINWEIS: Wenn die Zellzahlen kleiner als 1 x 10 6 Zellen sind, verringern Sie das kalte PBS-Volumen, um die Zelllösung in der gleichen Konzentration (1 x 106 Zellen / ml) herzustellen.</li>
</ol>3. Zelllyse
<ol><li>25 μL (= 2,5 x 104 Zellen) in ein neues 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.</li>
	<li>Fügen Sie 25 μL Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren auf und ab. 5 min auf Eis inkubieren</li>
	<li>5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen. HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.</li>
</ol>4. Tn5-Tagmentation
<ol><li>Das Pellet wird sofort in 25 μL Tn5-Reaktionsgemisch resuspendiert. Die Tn5-Reaktionsmischung ist wie folgt: 12,5 μL 2x Tagmentations-DNA-Puffer (TD-Puffer), 1,25-5 μL Tn5-Transposase und 11,25-7,5 μL nukleasefreies Wasser. HINWEIS: Die Standardkonzentration von Tn5 beträgt 2,5 μL für 2,5 x 104 Zellen.</li>
	<li>30 min bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Mischen Sie die Lösung alle 10 Minuten.</li>
</ol>5. DNA-Reinigung
HINWEIS: Vor der Verstärkung ist eine Reinigung erforderlich. Die DNA-Aufreinigung erfolgt mit dem MinElute PCR-Reinigungskit (Table of Materials).
<ol><li>Fügen Sie 5 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) hinzu.</li>
	<li>Sofort 125 μL Buffer PB hinzufügen und gut mischen.</li>
	<li>Befolgen Sie ab Schritt 2 das Protokoll des PCR-Aufreinigungskits .<ol><li>Legen Sie die Spin-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen.</li>
		<li>Die Probe auf die Spinsäule auftragen und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.</li>
		<li>750 μL Puffer-PE in die Spin-Säule geben und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Spin-Säule für 5 min, um die Membran vollständig zu trocknen.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Durchfluss und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Eluieren Sie die DNA-Fragmente mit 10 μL Buffer EB.</li>
		<li>Lassen Sie die Säule 1 min bei RT stehen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie für 1 min bei 17.900 x g RT, um die DNA zu eluieren.</li>
	</ol></li>
</ol>6. PCR-Amplifikation
HINWEIS: Die PCR-Amplifikation transponierter (markierter) DNA ist für die Sequenzierung notwendig. In diesem Beispiel wurden Nextera-Kit-Adapter (Table of Materials) verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
<ol><li>Die folgende PCR-Reaktion in 200 μL PCR-Röhrchen (50 μL für jede Probe) einrichten. Die PCR-Reaktionsmischung ist wie folgt: 10 μL eluierte DNA (Schritt 5.), 2,5 μL 25 mM Adapter 1, 2,5 μL 25 mM Adapter 2, 25 μL 2x PCR-Mastermix und 10 μL nukleasefreies Wasser</li>
	<li>Führen Sie das PCR-Amplifikationsprogramm Teil 1 durch (Tabelle 2). HINWEIS: Für die anfängliche Amplifikation werden für alle Proben mit einem Standard-Thermocycler die gleichen Bedingungen verwendet.</li>
	<li>Real-time qPCR (insgesamt 14,5 μL pro Probe)<ol><li>Richten Sie unter Verwendung von 5 μL des Produkts aus der PCR-Amplifikation Teil 1 (Schritt 6.2) die folgende Reaktion ein, diesmal einschließlich SYBR-Gold und Nachweis in einer Echtzeit-PCR-Maschine.</li>
		<li>Das PCR-Reaktionsgemisch wird wie folgt hergestellt: 5 μL PCR-Produkt aus Schritt 6.2., 0,75 μL SYBR-Gold (1000x verdünnt), 5 μL 2x PCR-Mastermix und 3,75 μL nukleasefreies Wasser. HINWEIS: Die genauen Zykluszahlen für die Bibliotheksamplifikation vor Erreichen der Sättigung für jede Probe werden durch qPCR bestimmt (Tabelle 3), um den GC- und Größenbias in PCR10 zu reduzieren. SYBR Gold wurde mit nukleasefreiem Wasser verdünnt. Zur Herstellung der verdünnten Lösung wurde 1 μL SYBR Gold (Stammkonzentration 10.000x) zu 999 μL nukleasefreiem Wasser gegeben. Die in Tabelle 3 erwähnte Laufzeit der RT-qPCR beträgt ca. 60 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Ermitteln Sie die erforderliche Anzahl zusätzlicher PCR-Zyklen anhand der Laufparameter aus Schritt 6.3.<ol><li>Anzahl der Zyklen = 1/4 maximale (gesättigte) Fluoreszenzintensität (typischerweise 3 oder 4 PCR-Zyklen)</li>
	</ol></li>
	<li>PCR-Amplifikationsprogramm Teil 2 (Volumen = 45 μL; Tabelle 4): Sobald Sie die Zyklusnummer ermittelt haben, richten Sie PCRs mit zusätzlichen Zyklen ein, die in Schritt 6.4.1 berechnet werden. Wenn die berechnete Zykluszahl beispielsweise 3 ist, richten Sie im folgenden Programm 3 Zyklen ein. Die Gesamtzyklen wären 8 (5 in Schritt 6.2., plus 3 zusätzliche Zyklen in Schritt 6.5).</li>
</ol>7. Reinigung von Perlen
HINWEIS: Hier wurden AMPure XP (Table of Materials) Perlen verwendet.
<ol><li>Zu den im vorherigen Schritt amplifizierten PCR-Produkten werden 150 μL Perlen bei RT hinzugefügt. HINWEIS: Hausgemachte AMPure-Perlen14 können in diesem Prozess verwendet werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 15 min bei RT.</li>
	<li>Legen Sie die Röhrchen für 5 min auf einen Magnetständer.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 80% Ethanol. HINWEIS: 80% Ethanol sollte frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 7.4.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ethanol vollständig.</li>
	<li>Trocknen Sie die Proben 10 min an der Luft bei RT.</li>
	<li>Resuspendieren mit 50 μL Elutionspuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Perlenreinigung (Schritte 7.1.-7.9.), um die Verunreinigung des Primers weiter zu minimieren.</li>
</ol>8. DNA-Konzentration und Qualitätskontrolle
<ol><li>Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nukleinsäure-Quantifizierungskit (Table of Materials).</li>
	<li>Überprüfen Sie die amplifizierten DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese mit SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% Agarosegel) oder einem automatisierten Elektrophoresesystem (z.B. TapeStation, Bioanalyzer).</li>
</ol>9. Sequenzierung
<ol><li>Durchführung einer Hochdurchsatzsequenzierung unter Verwendung der amplifizierten DNA-Proben12,13. HINWEIS: Amplifizierte DNA-Proben sind bereit für die Hochdurchsatzsequenzierung. Um nukleosomale DNA-Fragmentinformationen zu erhalten, wird die Paar-End-Sequenzierung gegenüber der Single-End-Sequenzierung empfohlen. Beide Enden der DNA-Fragmente zeigen an, wo die Transposase bindet. Für die Kartierung offener Chromatinbereiche sind in der Regel 30 Millionen Lesevorgänge/Probe ausreichend.</li>
</ol>10. Datenanalyse
<ol><li>Datenfilterung basierend auf der Qualität von Basisanrufen: Legen Sie den minimalen durchschnittlichen Basisqualitätsfaktor auf 20 fest (Genauigkeit von 99 %).</li>
	<li>Adapterzuschnitt: Entfernen Sie die Adaptersequenzen mit einem geeigneten Werkzeug. HINWEIS: Das Wrapper-Werkzeug "Galore trimmen" (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) wurde verwendet, um Adaptersequenzen zu entfernen. Für ATAC-seq-Bibliotheken, die von Illumina Tn5 vorbereitet wurden, wird die folgende Sequenz als Adaptersequenz verwendet: CTGTCTCTTATACACATCT. Die minimale Sequenzlänge zur Erkennung von Adapterverunreinigungen ist auf 5 festgelegt.</li>
	<li>Genomkartierung: Ordnen Sie die Messwerte dem entsprechenden Genom mit Bowtie unter Verwendung der folgenden Parameter "-I 0 -X 2000 -m 1"15 zu. Ein Beispiel für die Kartierungsqualität von MDA-MB-231 basalen Brustkrebszellen ist unten: Lesevorgänge mit mindestens einer gemeldeten Ausrichtung: 52,79 % Lesevorgänge, die nicht ausgerichtet werden konnten: 13,10 % Lesevorgänge mit unterdrückten Ausrichtungen aufgrund von -m: 34,11 %</li>
	<li>Deduplizierung: Markieren Sie die PCR-Duplikate mit Picard-Tools16.</li>
	<li>Generieren einer Genomabdeckungsdatei für die Datenvisualisierung: Konvertieren Sie die deduplizierten Paired-End-Lesevorgänge in Single-End-Lesefragmente. Genomabdeckungsspuren werden mit genomeCoverageBed von Bettwerkzeugen17 erhalten.</li>
</ol>

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<li>Bhattacharya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+channel+proteins+ORAI3+and+STIM1+mediate+TGF-%CE%B2+induced+Snai1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression.</a> Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).</li>
<li>Schep, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+nucleosome+fingerprints+enable+high-resolution+mapping+of+chromatin+architecture+within+regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions.</a> Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen gibt, die sich auf die in diesem Papier beschriebene Forschung beziehen.

ATAC-seq wurde häufig für die Kartierung offener und aktiver Chromatinregionen verwendet. Die Progression von Krebszellen wird häufig durch genetische Veränderungen und epigenetische Reprogrammierung vorangetrieben, was zu einer veränderten Chromatinzugänglichkeit und Genexpression führt. Ein Beispiel für diese Reprogrammierung ist während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs (EMT) und seines umgekehrten Prozesses, des mesenchymalen zu epithelialen Übergangs (MET), die als wichtige zelluläre Reprogrammierungsproze...

Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Regulation der Genexpression auf einer genomweiten Skala1. Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit sind häufig mit mehreren Krankheitszuständen verbunden, einschließlich Krebs 2,3,4. Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche Techniken entwickelt, die es Forschern ermöglichen, die Chromatinlandschaft zu untersuchen, indem sie Regionen mit Chromatinzugänglichkeit kartieren. Einige von ihnen umfassen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyd-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, und der Schwerpunkt dieser Arbeit, ATAC-seq (Assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartiert zugängliche Regionen durch die Verwendung eines Schlüsselmerkmals von DNase, nämlich der bevorzugten Verdauung von nackter DNA, die frei von Histonen und anderen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren5 ist. FAIRE-seq, ähnlich wie ChIP-seq, nutzt Formaldehydvernetzung und Beschallung, außer dass keine Immunpräzipitation beteiligt ist, und die nukleosomenfreien Regionen werden durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert6. Die MAPit-Methode verwendet eine GC-Methyltransferase, um die Chromatinstruktur bei Einzelmolekülauflösung7 zu untersuchen. ATAC-seq basiert auf der hyperaktiven Transposase Tn58. Die Tn5-Transposase bindet bevorzugt an offene Chromatinbereiche und fügt Sequenzierungsadapter in zugängliche Bereiche ein. Tn5 arbeitet durch einen DNA-vermittelten "Cut and Paste"-Mechanismus, wobei die mit Adaptern vorgeladene Transposase an offene Chromatinstellen bindet, DNA schneidet und die Adapter8 ligiert. Tn5-gebundene Regionen werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern wiederhergestellt, die an diese Adapter angeglüht werden. FAIRE-seq und DNase-seq erfordern eine große Menge an Ausgangsmaterial (~100.000 Zellen bis 225.000 Zellen) und einen separaten Bibliotheksvorbereitungsschritt vor der Sequenzierung9. Auf der anderen Seite ist das ATAC-seq-Protokoll relativ einfach und erfordert eine kleine Anzahl von Zellen (<50.000 Zellen)10. Im Gegensatz zu den FAIRE-seq- und DNase-seq-Techniken ist die Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung von ATAC-seq relativ einfach, da die isolierte DNA-Probe bereits mit den Sequenzierungsadaptern von Tn5 markiert wird. Daher ist nur der PCR-Amplifikationsschritt mit geeigneten Primern erforderlich, um die Bibliotheksvorbereitung abzuschließen, und die vorherigen Verarbeitungsschritte wie Endreparatur und Adapterligatur müssen nicht durchgeführt werden, was Zeit spart11. Zweitens vermeidet ATAC-seq die Notwendigkeit einer Bisulfitumwandlung, Klonierung und Amplifikation mit regionsspezifischen Primern, die für MAPit7 erforderlich sind. Aufgrund dieser Vorteile ist ATAC-seq zu einer sehr beliebten Methode zur Definition offener Chromatinregionen geworden. Obwohl die ATAC-seq-Methode einfach ist, erfordern mehrere Schritte eine Optimierung, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Dieses Manuskript diskutiert Optimierungsverfahren für die Standard-ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung und hebt insbesondere drei Parameter hervor: (1) Lysepufferzusammensetzung, (2) Tn5-Transposase-Konzentration und (3) Zellzahl. Darüber hinaus liefert dieser Artikel Beispieldaten aus den Optimierungsbedingungen unter Verwendung von krebsartigen und nicht-kanzerösen adhärenten Epithelzellen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Natural</td></tr><tr><td>10 & micro; L XL TipOne-Spitzen</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Gefiltert und mit geringer Retention</td></tr><tr><td>100 & Mikro; L XL TipOne RPT-Spitzen</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>Gefiltert und mit geringer Retention</td></tr><tr><td>100 & Mikro; L XL TipOne-Spitzen</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1840</td><td>Gefiltert und mit geringer Retention. </td></tr><tr><td>Konische Zentrifugenröhrchen mit abgeschrägten 15 mL</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>20 & Mikro; L TipOne RPT-Spitzen</td><td>USA Scientific</td><td>1183-1810</td><td>Gefiltert und mit geringer Retention</td></tr><tr><td>200 & Mikro; L TipOne RPT-Spitzen</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td>Gefilterte und 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit geringer Retention</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>YBP136010</td><td>Genetische Analysequalität</td></tr><tr><td>Alle in dieser Studie verwendeten Zelllinien stammen aus ATCC</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30R Zentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>364658</td><td>SX2415</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Beads Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>CellDrop Zellzähler</td><td>DeNovix</td><td>CellDrop FL</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>BioUltra, wasserfrei, &ge; 99% (Titration)</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC615100020</td><td>wasserfrei; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilisationsprodukte</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum - TET Geprüfte</td><td>Forschung und Entwicklung D Systems</td><td>S10350</td><td>Triple 0.1 &micro; m gefiltert</td></tr><tr><td>Gibco DMEM 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td>[+] 4,5 g/L D-Glukose; [+] L-Glutamin; [-] Natriumpyruvat</td></tr><tr><td>Gibco PBS 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA 1x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>(0,25%), Phenolrot</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>IBI Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Qubit Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>DNA-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>IBI Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>BioXtra, &ge; 98% (säuerlich), Pellets (wasserfrei)</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>Nextera DNA-Probenvorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1030</td><td>2x TD und Tn5 Transposase</td></tr><tr><td>NP - 40 (IGEPAL CA-630)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I8896</td><td>für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>PCR Nachweissystem</td><td>BioRad</td><td>1855484</td><td>CFX384 Echtzeit-System. C1000 Touch Thermocycler</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1851</td><td>BioPerformance Zertifiziert, geeignet für Zellkultur</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen; Nukleinsäure-Quantifizierungskit</td></tr><tr><td>Quibit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32856</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>SDS</td><td>MilliporeSigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Hausgemacht-pH</td><td></td> <td>5,2</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>IBI Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Grün Supermix, 1,25 mL</td><td>BioRad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure 0,2 mL PCR 8-Röhrchen-Streifen</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td>Flex-frei, natürlich, Polypropylen</td></tr><tr><td>TempPlate 384-WELL PCR PLATE</td><td>USA Scientific</td><td>1438-4700</td><td>Einzelne Kerbe. Natürliches Polypropylen</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>MilliporeSigma</td><td>648311</td><td>ULTROL Grade</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>IBI Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit</td><td>Illumina</td><td>PE-121-1003</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>BioXtra, viskose Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Wasser</td><td>MilliporeSigma</td><td>W3500</td><td>steril gefiltert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur</td></tr></tbody></table>

atac-seq optimierung für die krebsepigenetikforschung

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) untersucht die Zugänglichkeit von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung der hyperaktiven Tn5-Transposase. Tn5 schneidet und ligiert Adapter für Hochdurchsatzsequenzierung innerhalb zugänglicher Chromatinregionen. In eukaryotischen Zellen wird genomische DNA in Chromatin verpackt, einen Komplex aus DNA, Histone und anderen Proteinen, der als physikalische Barriere für die Transkriptionsmaschinerie wirkt. Als Reaktion auf extrinsische Signale rekrutieren Transkriptionsfaktoren Chromatin-Remodeling-Komplexe, um den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie für die Genaktivierung zu ermöglichen. Daher ist die Identifizierung offener Chromatinregionen nützlich, wenn die Aktivitäten von Enhancern und Genpromotoren während biologischer Ereignisse wie dem Fortschreiten von Krebs überwacht werden. Da dieses Protokoll einfach zu bedienen ist und einen geringen Zelleingangsbedarf hat, wurde ATAC-seq weit verbreitet, um offene Chromatinregionen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Krebszellen, zu definieren. Für eine erfolgreiche Datenerfassung müssen bei der Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken mehrere Parameter berücksichtigt werden. Unter ihnen sind die Wahl des Zelllysepuffers, die Titration des Enzyms Tn5 und das Startvolumen der Zellen entscheidend für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in Krebszellen. Optimierung ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der ATAC-seq-Optimierungsmethoden für Epithelzelltypen.

Um erfolgreiche und qualitativ hochwertige ATAC-seq-Daten zu erhalten, ist es wichtig, die experimentellen Bedingungen zu optimieren. Die ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung kann in die fünf Hauptschritte unterteilt werden (Abbildung 1), nämlich Zelllyse, Tagmentation (Fragmentierung und Adapterinsertion durch Tn5), genomische DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation und Datenanalyse. Als ersten Prozess muss zunächst der Zelllysepuffer (Kernisolierung) für jeden Zelltyp optimiert werden. Zur Lyse vo...

ATAC-seq ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die die hyperaktive mutierte Transposase Tn5 verwendet, um Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit abzubilden, die durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. ATAC-seq ermöglicht die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen in Krebszellen zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren für ATAC-seq in Epithelzelltypen, einschließlich Krebszellen.

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

ATAC-seq ermöglicht es uns, den Status der offenen Chromatinregionen im Genom zu identifizieren, der in den Krankheitszuständen im Vergleich zum Normalzustand oft verändert ist. Weniger Zelleingabe, ein vereinfachtes Protokoll der Tn5-Verdauung, gefolgt von der Isolierung fragmentierter DNA und Bibliothekspräparation durch PCR-Amplifikation und kürzere Versuchszeiten machen es zu einer vorteilhafteren Technik. Der Vergleich der veränderten epigenetischen Landschaft durch ATAC-seq zwischen normalen und Krankheitszuständen kann Aufschluss über die krankheitsassoziierten Chromatin-regulatorischen Elemente geben und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien nützlich sein.Diese Technik ist einfach durchzuführen, da sie keine kritischen experimentellen Schritte beinhaltet. Um erfolgreiche ATAC-seq-Ergebnisse zu erhalten, sind nur ein paar Standardisierungsschritte erforderlich. Um zu beginnen, 25 Mikroliter aus einer Zellsuspension mit einer Million Zellen pro Milliliter in PBS in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen und bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und fügen Sie 25 Mikroliter Lys

atac-seq-optimization-for-cancer-epigenetics-research

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.

Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing

Test für Transposase zugänglichen Chromatin gepaart mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-Seq) ist eine genomweite Methode zugänglich Chromatin aufzudecken. Dies ist ein Schritt für Schritt ATAC-Seq-Protokoll von molekularen bis die abschließende computergestützte Analyse, optimiert für menschlichen Lymphozyten (Th1/Th2). Dieses Protokoll kann von Wissenschaftlern ohne Vorkenntnisse in Next Generation Sequencing Methoden übernommen werden.

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Detaillierte Protokolle für die Einführung ein veränderter Split-TET2 Enzym (Apfelwein) in Säugerzellen für chemische induzierbaren DNA-Hydroxymethylation und epigenetische Umbau werden vorgestellt.

Ein veränderter Split-TET2 Enzym für chemische-induzierbaren DNA Hydroxymethylation und epigenetische Umbau

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Probe für Transposase zugänglichen Chromatin Sequenzierung (ATAC-Seq) auf aktivierten CD4 + menschlichen Lymphozyten durchführen. Das Protokoll wurde modifiziert, um Kontamination mitochondriale DNA liest von 50 % auf 3 % durch die Einführung eines neuen Lyse-Puffers zu minimieren.

ATAC-Seq-Assay mit niedrigen mitochondriale DNA Kontamination von primären menschlichen CD4 + T-Lymphozyten

Hier zeigen die Autoren den Nutzen von MULTI-seq für die Phänotypisierung und nachfolgende gepaarte scRNA-seq und scATAC-seq bei der Charakterisierung der transkriptomischen und chromatinischen Zugänglichkeitsprofile in der Netzhaut.

Multiplexe Analyse der retinalen Genexpression und der Chromatinzugänglichkeit mittels scRNA-seq und scATAC-seq

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Einzelzellmethode für iterative epigenomische Analysen unter Verwendung einer wiederverwendbaren Einzelzelle. Die wiederverwendbare Einzelzelle ermöglicht die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Einzelzelle und die statistische Validierung der Ergebnisse.

Wiederverwendbare Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen

Wir präsentieren ein Protokoll für den Assay von Transposase-zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) speziell an Adipozyten mittels Zellkernsortierung mit Fettgewebe, das aus transgenen Reportermäusen mit nukleärer Fluoreszenzmarkierung isoliert wurde.

Adipozyten-spezifischer ATAC-Seq mit Fettgewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Dieses Manuskript skizziert ein Protokoll zur Erstellung einer ATAC-seq-Bibliothek von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen, mit dem Ziel, eine optimale Lebensfähigkeit der Neutrophilen und eine hohe Bibliotheksqualität zu gewährleisten. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur BMC-Vorbereitung, zur immunomagnetischen Sortierung und zum Aufbau von Bibliotheken und dient insbesondere für Neueinsteiger in die Erforschung von Neutrophilen als wertvolle Anleitung.

ATAC-Seq-Bibliothek Präparation von aus dem Knochenmark gewonnenen Neutrophilen der Maus

Hier stellen wir ein schnelles und einfaches ATAC-seq-Protokoll vor, das im L4-Stufen-Caenorhabditis elegans-Ganzwurm mit nur 30 μL Wurmpellet implementiert werden kann.

Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die Optimierung von ATAC-seq für epitheliale Zelltypen in der Krebsforschung. Diese Methode identifiziert chromatinzugängliche Regionen und liefert wertvolle Einblicke in epigenetische Veränderungen bei Erkrankungen.

ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

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