ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

ATAC-seq ermöglicht es uns, den Status der offenen Chromatinregionen im Genom zu identifizieren, der in den Krankheitszuständen im Vergleich zum Normalzustand oft verändert ist. Weniger Zelleingabe, ein vereinfachtes Protokoll der Tn5-Verdauung, gefolgt von der Isolierung fragmentierter DNA und Bibliothekspräparation durch PCR-Amplifikation und kürzere Versuchszeiten machen es zu einer vorteilhafteren Technik. Der Vergleich der veränderten epigenetischen Landschaft durch ATAC-seq zwischen normalen und Krankheitszuständen kann Aufschluss über die krankheitsassoziierten Chromatin-regulatorischen Elemente geben und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien nützlich sein.

Diese Technik ist einfach durchzuführen, da sie keine kritischen experimentellen Schritte beinhaltet. Um erfolgreiche ATAC-seq-Ergebnisse zu erhalten, sind nur ein paar Standardisierungsschritte erforderlich. Um zu beginnen, 25 Mikroliter aus einer Zellsuspension mit einer Million Zellen pro Milliliter in PBS in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen und bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zu zentrifugieren.

Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und fügen Sie 25 Mikroliter Lysepuffer hinzu. Suspendieren Sie die Zellen erneut, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Bei 500 G fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen.

Das Pellet wird sofort in 25 Mikrolitern Tn5-Reaktionsgemisch resuspendiert und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Mischen Sie die Lösung alle 10 Minuten. Fügen Sie der Tn5-markierten DNA-Lösung fünf Mikroliter 3-molares Natriumacetat und 125 Mikroliter Puffer-PB hinzu.

Gut mischen. Als nächstes legen Sie die Spin-Säule in ein 2-Milliliter-Sammelröhrchen und tragen die Probe auf die Spin-Säule auf. Zentrifugieren Sie bei 17, 900 G für eine Minute bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Durchfluss.

Fügen Sie der Spalte PE-Puffer hinzu, und drehen Sie die Spalte. Legen Sie die Spin-Säule wieder in dasselbe Sammelrohr und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang, um die Membran vollständig zu trocknen. Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen ein.

Eluieren Sie die DNA-Fragmente mit 10 Mikrolitern Puffer EB und lassen Sie die Säule eine Minute bei Raumtemperatur stehen. Dann zentrifugieren Sie bei 17, 900 G für eine Minute bei Raumtemperatur, um die DNA zu eluieren. Richten Sie die PCR-Reaktion in 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen ein und führen Sie das erste Teil des PCR-Amplifikationsprogramms durch.

Für Echtzeit-QPCR bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung vor, indem Sie fünf Mikroliter PCR-Produkt, 0,75 Mikroliter 1.000-fach verdünntes SYBR Gold, fünf Mikroliter 2X PCR Master Mix und 3,75 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen. Bestimmen Sie die erforderliche Anzahl zusätzlicher PCR-Zyklen anhand der Laufparameter. Sobald die Zyklusnummer bestimmt ist, richten Sie PCRs mit den zuvor berechneten zusätzlichen Zyklen ein.

Zu den amplifizierten PCR-Produkten 150 Mikroliter Perlen hinzufügen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Röhrchen fünf Minuten lang auf einen Magnetständer und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Waschen Sie die Perlen mit 200 Mikrolitern 80% Ethanol und entfernen Sie den Überstand.

Entfernen Sie das Ethanol vollständig und trocknen Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft. Zum Schluss mit 50 Mikrolitern Elutionspuffer resuspendieren. Stellen Sie das Röhrchen auf einen magnetischen Ständer und geben Sie das Eluat in ein frisches 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Ein Vergleich der Zelllyseeffizienz mit Trypanblau ist hier dargestellt. NMuMG-Zellen wurden mit einem hypotonen Puffer und CSK-Puffer behandelt und mit Trypanblau angefärbt. Eine höhere Zelllyseeffizienz wurde in CSK-behandelten Zellen beobachtet.

ATAC-seq-Bibliotheken wurden aus MDA-MB-231-Brustkrebszellen hergestellt. Nach der PCR-Amplifikation wurden PCR-Produkte auf einem 0,5-fachen TBE, 1,5%igen Agarose-Gel vor und nach der Reinigung der Perlen analysiert. Grundierungen werden meist durch die anfängliche Perlenreinigung entfernt.

DNA-Bandenmuster aus 1X TAE 1%Agarose-Gelelektrophorese und einer automatisierten Elektrophorese sind ebenfalls indiziert. SYBR Gold wurde verwendet, um die hier gezeigten DNA-Fragmente sichtbar zu machen. Ein Genom-Browser-Track, der den ERS1-Locus zeigt, wird hier vorgestellt.

Die Genomabdeckung der ATAC-seq-Daten in T47D-Zellen ist in diesem Bild dargestellt. Es wurden Primer aus einer früheren Publikation verwendet, deren Zielregionen gelb hervorgehoben sind. Ein Balkendiagramm, das die Primeramplikonanreicherung in ATAC-seq-Bibliotheken darstellt, ist hier dargestellt.

ATAC-seq-Bibliotheken wurden durch den hypotonischen Puffer oder einen CSK-Puffer vorbereitet. Das repräsentative Bild zeigt die Genom-Browser-Visualisierung zur ATAC-seq-Optimierung. Die ATAC-seq-Daten aus der 25.000-Zell-Eingangsbedingung zeigten die höchste Anreicherung nukleosomenfreier Fragmente, während die 100.000-Zell-Eingangsbedingung die höchsten mononukleosomalen DNAs aufwies.

Genom-Browser-Tracks, die ATAC-seq-Daten von verschiedenen Zellzahlen zeigen, werden hier vorgestellt. Die HOMER-Peak-Annotationsanalyse ist in diesem repräsentativen Bild dargestellt. HOMER klassifizierte jeden Peak als proximalen oder distalen Promotorpeak.

Die Anzahl der Zelleingaben des Zelllysepuffers und die Konzentration des Enzyms Tn5 in Abhängigkeit vom Zelltyp sind die kritischsten Parameter, die standardisiert werden müssen. Tn5, das mit Protein A in der Cut-and-Tack-Technik fusioniert wird, wird häufig verwendet, um DNA-Bindungsstellen für ein Protein von Interesse mit Antikörpern zu identifizieren, die für dieses interessierende Protein spezifisch sind.