Name: Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie Morphogenese-Phänotypen von Candida albicans während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise in-vivo-Analysen.

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Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss 1R01AI33409 und die Abteilung für Pädiatrie des Carver College of Medicine der University of Iowa unterstützt.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Modell verwendet konfokale Mikroskopie, um Bilder von C. albicans-Organismen zu erhalten, wie sie im Gewebe eines Säugetierwirts wachsen, so dass wir die Morphogenese-Phänotypen während der aktiven Infektion bewerten können. Der Prozess der Morphogenese ist von zentraler Bedeutung für die Pathogenese von C. albicans und wurde mit einer Vielzahl von In-vitro-Assays umfassend untersucht 2,3,4. Kein In-vitro-Assay kann jedoch die komplexe biochemische und strukturelle Umgebung des Wirts vollständig modellieren.
Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung dieses In-vivo-Bildgebungssystems, um eine Reihe / Bibliothek von C. albicans-Mutanten zu screenen, um die Gene zu identifizieren, die an der Morphogenese während der Infektion beteiligt sind. Die Verwendung von C. albicans-Stämmen, die verschiedene fluoreszierende Proteine exprimieren, ermöglicht es uns, die In-vivo-Morphogenese von C. albicans-Mutantenstämmen im Vergleich zu einem Referenzstamm zu quantifizieren. Der Vergleich der Morphogenese in der Mutante mit dem Referenzstamm innerhalb desselben Infektionsgebiets stellt sicher, dass die Organismen identischen Umgebungen ausgesetzt sind. Dies ermöglicht eine quantitative Messung des Prozentsatzes der Zellen, die einer Filamentation unterzogen werden, sowie des Ausmaßes der Filamentation. Die Normalisierung der Messungen des/der mutierten Stammes/e auf die des Referenzstamms ermöglicht es uns, die Leistung einer Mutante besser mit einer anderen zu vergleichen.
Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse zeigen das Potenzial für eine signifikante Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Phänotypen. Der C. albicans efg1ΔΔ mutierte Stamm wird häufig als Negativkontrolle für Morphogenese-Assays verwendet, da er unter fast allen In-vitro-Bedingungen nicht filamentieren kann20. Obwohl die In-vivo-Ergebnisse den In-vitro-Ergebnissen sehr ähnlich waren, bildete selbst dieser stark behinderte Stamm gelegentlich Filamente in der Umgebung des Wirtsgewebes (Abbildung 3). Dies unterstreicht die Stärke der Wirtsumgebung bei der Auslösung der Morphogenese.
Im Gegensatz dazu zeigt der cyr1ΔΔ-mutierte Stamm eine erhebliche Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Wachstum; Obwohl keine der mutierten Zellen in vitro einer Filamentation unterzogen wird, wächst etwa die Hälfte der Zellen in vivo als Filamente (Abbildung 4)10,21. Interessanterweise waren diese Filamente signifikant kürzer als diejenigen, die durch den Referenzstamm gebildet wurden, was darauf hindeutet, dass CYR1 entweder zur Wachstumsrate des Filaments oder zur Fähigkeit beiträgt, einen filamentösen Phänotyp aufrechtzuerhalten. Um die Analyse der Filamentlänge zu erleichtern, wurde die Kurvenweglänge der Filamente mit einer zweidimensionalen Projektion der Bilder gemessen. In zweidimensionalen Projektionen von Filamenten, die in drei Dimensionen wachsen, wird jedes Filament, das auf einer Achse wächst, die nicht parallel zur xy-Ebene ist, kürzer als seine wahre Länge projiziert. Da diese Verkürzung auch für den Referenzstamm auftritt, erlaubt die Auswertung der Verteilung der Filamentlängen in einer zweidimensionalen Projektion dennoch einen quantitativen Vergleich zwischen Referenz- und Mutantenstämmen. Die Analyse der Filamentlänge in zwei statt drei Dimensionen erfordert eine weniger intensive Bildanalyse; Somit kann es relativ schnell auf einem typischen Desktop-Computer durchgeführt werden. Die Verwendung dieser einfacheren Analyse ermöglicht die Einbeziehung der Filamentlängenverteilung als Teil eines Screening-Protokolls, was ein nuancierteres Verständnis der Fähigkeit jeder Mutante ermöglicht, eine Morphogenese zu durchlaufen, ohne wesentliche Verzögerungen beim Durchsatz zu verursachen.
Die hier vorgestellten repräsentativen Studien wurden mit DBA2/N-Mäusen durchgeführt, die einen Defekt in ihrem Komplementsystem aufweisen, der dazu führt, dass Neutrophile nicht an den Ort der C. albicans-Infektion rekrutiertwerden 22. Ziel dieser Studien war es, Mechanismen der Regulation der C. albicans-Filamentation im Wirtsgewebe zu untersuchen. Daher wurden DBA2/N-Mäuse verwendet, um zu vermeiden, dass die Ergebnisse aufgrund der Anfälligkeit oder Resistenz eines einzelnen Stammes gegen Neutrophile verfälscht werden. Da die neutrophile Anti-C. albicans-Antwort die Filamentation beeinflussen kann23, könnte die Rekrutierung von Neutrophilen an die Infektionsstelle die Ergebnisse eines Morphogenese-Assays beeinflussen. Wenn ein Stamm in der Lage ist, in vivo zu filamentieren, aber stark von der Filamentation gehemmt wird, wenn Neutrophile vorhanden sind, würde eine Filamentation bei DBA2 / N-Mäusen nachgewiesen, aber es wäre unwahrscheinlich, dass sie bei Mäusen mit intakter neutrophiler Chemotaxis beobachtet wird. Daher ist die Belastung der Maus, die als Host verwendet wird, ein wichtiger Faktor bei der Verwendung dieses Protokolls.
Die Beobachtung, dass der efg1ΔΔ-mutierte Stamm nicht in vivo filamentiert, ist unwahrscheinlich, dass er mit den Neutrophilenantworten des Wirts zusammenhängt, da dieser Stamm auch nicht in vitro filamentiert. Die in vivo beobachtete Filamentation mit dem Cyr1ΔΔ-Stamm ist diskordant mit dem Versagen der Filamentation in vitro. Daten aus dem Zebrafischmodell der C. albicans-Infektion deuten darauf hin, dass ansprechende Neutrophile wichtig für die Prävention der Morphogenese sind24. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Verwendung von DBA2/N-Mäusen, denen neutrophile Antworten fehlen, die Zunahme der Filamentation des Cyr1ΔΔ in vivo im Vergleich zu in vitro erklärt. Nichtsdestotrotz beeinflusst die In-vivo-Umgebung eindeutig die Morphogenese des Cyr1ΔΔ-Stammes; Daher kann die weitere Untersuchung dieses Stammes wichtige Informationen über die Regulation der Morphogenese von C. albicans während aktiver Infektionen liefern. Das hier beschriebene Protokoll ist als Screening-Assay konzipiert, um Stämme wie den cyr1ΔΔ-Stamm zu identifizieren, der in zukünftigen Studien verwendet werden soll.
Die Verwendung eines Low-Flow-Gasanästhesiesystems ist für dieses Protokoll sehr hilfreich (Abbildung 1A,B). Während der anfänglichen Entwicklung dieses Protokolls wurden Mäuse mit einem injizierbaren Anästhesiecocktail aus Ketamin gemischt mit Xylazin betäubt. Während es möglich war, eine begrenzte Bildgebung mit dieser Anästhesiemethode durchzuführen, war die Dauer der Anästhesie unvorhersehbar, so dass die Bildgebungssitzungen schnell beendet werden mussten, um zu vermeiden, dass sich die Maus während der Bildgebung von der Anästhesie erholte. Herkömmliche inhalative Anästhesiesysteme sind sperrig und erfordern hohe Durchflussraten von Anästhesiegasen, die oft in einem Abzug verwendet werden müssen. Daher wären herkömmliche inhalative Anästhesiesysteme mit den Platzbeschränkungen eines konfokalen Mikroskops sehr schwierig zu verwenden, ohne die Forscher versehentlich den Anästhetika auszusetzen. Die Verwendung eines Low-Flow-Inhalationsanästhesiesystems ermöglicht eine konsistente Anästhesie des Tieres bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer sicheren Umgebung für den Ermittler. Der Low-Flow-Nasenkegel ermöglicht eine einfache Positionierung des Tieres sowohl für die Impfung als auch für die Mikroskopie. Der kleinkalibrige, kleinvolumige Verabreichungsschlauch ermöglicht die Verwendung relativ langer Schläuche, wodurch das Anästhesiegerät in ausreichendem Abstand platziert werden kann, um die Mikroskopie nicht zu stören.
Das in typischen Mäusesuppen vorhandene Chlorophyll führt zu einer signifikanten Gewebeautofluoreszenz25. Dies führt zu erheblichem Rauschen in den Bildern, was es schwierig macht, qualitativ hochwertige Bilder mit hoher räumlicher Auflösung zu erhalten. Wenn die Tiere vor der Bildgebung 7 Tage lang mit chlorophyllfreiem Chow gefüttert wurden, war der Hintergrund der Autofluoreszenz im Gewebe erheblich verringert, aber das im Haar abgelagerte Chlorophyll war weiterhin problematisch. Das Entfernen der Haare auf den Ohrmuscheln mit einer rezeptfreien chemischen Enthaarungscreme minimiert die Autofluoreszenz im Haar wirksam (Abbildung 1C, D). So verringerte die Kombination aus chlorophyllfreiem Chow und ausreichender Haarentfernung die Autofluoreszenz erheblich und verbesserte die Bildqualität dramatisch. Da die Haare vor der Bildgebung aus dem Ohr entfernt werden, hat die Farbe der Haare des Tieres keinen Einfluss auf dieses System. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um C. albicans-Infektionen bei BALB/c (weiß), C57BL/6 (schwarz) und DBA2/N (braun) Mäusen zu untersuchen. Das Protokoll kann auch mit C57BL/6-Knockout-Mäusen verwendet werden, denen verschiedene Wirtsgene fehlen; Dies wird zukünftige Untersuchungen ermöglichen, wie das Immunsystem des Säugetierwirts die Filamentation beeinflusst. Ein Merkmal dieses Modells, das in diesem Protokoll nicht diskutiert wird, ist, dass dasselbe Tier über mehrere Tage hinweg wiederholt abgebildet werden kann, da dieses Bildgebungssystem nicht-invasiv ist, so dass der Fortschritt der individuellen Infektion im Laufe der Zeit verfolgt werden kann. Dieses Merkmal wird wahrscheinlich eine Schlüsselrolle in zukünftigen Studien zur Wirt-Pathogen-Interaktion spielen.
Zusammenfassend führt dieses Protokoll zu hochauflösenden Bildern von C. albicans, die im Gewebe eines lebenden Säugetierwirts wachsen, was eine genaue Bewertung der Morphogenese in mutierten Stämmenermöglicht 8,9,10. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um eine Bibliothek von C. albicans-Mutanten zu screenen. Von den bisher getesteten C. albicans-Mutanten wird ein großer Teil der Mutanten mit bekannten Defekten in der Morphogenese in vitro leicht in vivo filamentiert 9,10. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, ein In-vivo-System wie dieses in Experimente einzubeziehen, die die Mechanismen der Pathogenese von C. albicans aufklären sollen.

Candida albicans ist ein häufiger humaner Pilzerreger, der mukokutane Erkrankungen, disseminierte Erkrankungen und lokalisierte Gewebeinfektionen verursacht1. Ein wesentliches Merkmal der Physiologie von C. albicans ist ihr komplexes polymorphes Wachstum, das mit seiner Rolle als Kommensal- und Krankheitserreger verbunden ist 2,3,4. Unter nährstoffreichen Bedingungen in vitro bei 30 °C wächst sie typischerweise als eiförmige Knospungshefe. Eine Vielzahl von Umweltauslösern, einschließlich Nährstoffentzug, pH-Änderungen, Wachstum bei 37 ° C, Exposition gegenüber Serum und Wachstum bei Einbettung in Agar, führen zum Übergang zu einem polarisierten Wachstumsmuster, was zur Bildung echter Hyphen und / oder Pseudohyphen führt5. Die Initiierung des polarisierten Wachstums und das daraus resultierende Wachstum filamentöser Organismen wird als Morphogenese bezeichnet.
Aufgrund der Bedeutung der Morphogenese für die Virulenz des Organismus wurde die Regulation der Hyphenbildung umfassend untersucht 6,7. Es gibt ein komplexes Netzwerk von Signalwegen und transkriptioneller Regulation, das die Morphogenese auslöst. Trotz der Beziehung der Morphogenese von C. albicans mit der Pathogenese haben die meisten Studien, die die Morphogenese untersuchen, In-vitro-Stimuli verwendet, um die Hyphenbildung auszulösen. Es wird immer deutlicher, dass die verschiedenen in vitro Modelle der Filamentation hinsichtlich der einzelnen stimulierten Regulationswege nicht identisch sind. Darüber hinaus korrespondieren keine In-vitro-Wachstumsbedingungen eng mit der komplexen Umgebung des Wirts. Angesichts der Bedeutung von C. albicans als menschlicher Krankheitserreger besteht das Ziel dieses Protokolls darin, seine Morphogenese während der aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mit einem System mit moderatem Durchsatz zu untersuchen, so dass ein Forscher C. albicans mutierte Bibliotheken untersuchen kann.
Um diese Untersuchungen zu erleichtern, wurde ein in vivo Bildgebungssystem entwickelt, das es uns ermöglicht, hochauflösende Bilder von C. albicans-Zellen während der Infektion der Ohrmuschel einer anästhesierten Maus mit einem inversen konfokalen Mikroskop8,9,10 zu erhalten. Da die Haut der Ohrmuschel ziemlich dünn ist, können diese Bilder ohne Gewebedissektion erhalten werden. So können quantitative Phänotypdaten am Ort aktiver Infektionen im Wirtsgewebe gemessen werden. Das hier beschriebene Protokoll beinhaltet die Transformation eines Referenzstamms und eines oder mehrerer mutierter Stämme mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten11,12. Die fluoreszierenden proteinexprimierenden Stämme werden dann gemischt und intradermal co-injiziert. Nachdem die Infektion festgestellt wurde, wird die konfokale Bildgebung verwendet, um sowohl die Häufigkeit der Filamentation als auch die Länge der gebildeten Filamente zu quantifizieren. Die von den mutierten Stämmen erhaltenen Daten werden auf die des Referenzstamms normalisiert, der in derselben Geweberegion vorhanden ist, wodurch eine interne Kontrolle gewährleistet ist. Dieses System hat es uns ermöglicht, mehrere Serien von C. albicans-Mutantenstämmen, von denen viele Morphogenesedefekte in vitro9,10 aufweisen, erfolgreich zu screenen. Viele dieser Stämme filamentieren leicht in vivo, was die Bedeutung von In-vivo-Modellen für die Untersuchung der Morphogenese unterstreicht.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Deckgläser</td><td>Thermo-Fisher</td><td>20811</td><td>groß genug, um die universelle Tischöffnung abzudecken</td></tr><tr><td>0,1 mL Insulinspritzen</td><td>EXELint</td><td>26018</td><td>Kann Spritzen verwenden, die 5/16" groß sind&ndash; 1/2" lang und 29&ndash; 32 G</td></tr><tr><td>3,7 % Formaldehyd in dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBJ5734</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol/30 % Wasser</td><td>Decon Laboratories</td><td>A05061001A</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Vorbereitungspads</td><td>Covidien</td><td>5110</td><td>Alternative: Mullbinden getränkt in 70 % Isopropylalkohol</td></tr> <tr><td>C.albicans Referenzstamm und experimentelle Stämme</td><td>SN250</td><td>FGSC Online-Katalog</td><td>Der spezifische Stamm C. albicans variiert je nach Experiment und den Zielen der Forscher. Wir haben Stämme verwendet, die von SC5314 abgeleitet sind, sowie andere klinische Isolate.</td></tr><tr><td>Chlorophylfreies Mausfutter</td><td>Envigo</td><td>2920x</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7050</td><td>Computer, auf dem Bildgebungssoftware für die Erfassung und Analyse von Bildern ausgeführt werden kann. Es steht eine Vielzahl von Bildgebungssoftware zur Verfügung, die je nach Mikroskop und Benutzersystem variiert.</td></tr><tr><td>Wattestift-Applikator</td><td>Pro Advantage</td><td>76200</td><td></td></tr><tr><td>DBA2/N (6-12 Wochen alte Mäuse)</td><td></td><td></td><td>BALB/c und C57/BL6 Mäuse können ebenfalls verwendet werden. Letztere ermöglichen die Verwendung von weit verbreiteten Knockout-Mausmodellen sowie von Mausmodellen, in denen einzelne Zelltypen, wie z.B. Phagozyten, durch ihre Expression von fluoreszierenden Proteinen identifiziert werden.</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband zum Fixieren von Stoff auf der Haut (Fashion Tape)</td><td>Örtliche Apotheke oder Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td>Doppelseitiges Klebeband, das entwickelt wurde, um Kleidung auf der menschlichen Haut an Ort und Stelle zu halten. Dies ist in der Regel rezeptfrei in Apotheken und Varietégeschäften erhältlich. Es ist wichtig, diese Art von Klebeband zu verwenden, da es für eine sanfte Haftung auf der Haut konzipiert ist. Beispiele:&nbsp; https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =Mode+Klebeband& qid=1649174406& sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70& sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =Mode+Klebeband& qid=1649174320& sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70& sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =Mode+Klebeband& qid=1649174406& sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70& sr=8-29</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>14190-144</td><td>Muss steril sein; für jedes Experiment ein neues Behältnis öffnen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Mullkissen</td><td>Pro Advantage</td><td>P157112</td><td></td></tr><tr><td>Gel Augenlaubikant</td><td>Lokale Apotheke oder Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ oder FIJI Analysesoftware</td><td>NIH</td><td>ImageJ (FIJI)</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Akorn</td><td>J119005</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 (SP8-Plattform) mit Leica 11506375</td> Objektiv <td>Leica</td><td>DMi8 (SP8)</td><td>Das Objektiv&nbsp; (Leica 11506375) hier verwendet&nbsp; ist eine 25-fache Wasserimmersionslinse, die es uns ermöglicht, einen hohen NA (0,95) zu erreichen und gleichzeitig den Brechungsindex des Ohrgewebes zu approximieren. Das Mikroskop (Leica DMi8 (SP8-Plattform) verfügt über 488 nm und 638 nm Diodenlaserlinien und ist mit einer filterfreien&nbsp; spektralen Detektion mit computergesteuerter einstellbarer Bandbreite für die Detektion von Emissionslicht ausgestattet. Der Tisch muss genügend Abstand haben, damit das Objektiv Erreichen Sie das untere Deckglas, ohne auf die Bühne zu treffen.</td></tr><tr><td>Low-Flow-Anästhesiesystem oder herkömmlicher Anästhesieverdampfer</td><td>Kent Scientific International</td><td>SomnoSuite</td><td></td></tr><tr><td>Nair Haarentfernerlotion</td><td>in der örtlichen Apotheke oder im Lebensmittelgeschäft</td><td></td><td>Rezeptfreie Enthaarungscreme</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>Jena Bioscience</td><td>AB-101L</td><td></td></tr><tr><td>pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR Plasmide</td><td></td><td></td><td>Transformationskonstrukte für die Expression fluoreszierender Proteine großzügig zur Verfügung gestellt von Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infektion und Immunität)</td></tr><tr><td>Druckempfindliches Laborklebeband</td><td>Klebeband & Label Graphic Systems Inc</td><td>1007910</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Zellkulturmedium</td><td>Gibco / Thermo-Fisher</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fingerhut, konisches 15-ml-Kunststoffröhrchen aus konischem Kunststoff oder Falcon 5 ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>Zum sicheren Halten des Ohrs des Tieres während der Injektion</td></tr></tbody></table>

verwendung von in-vivo-bildgebung zum screening auf morphogenese-phänotypen in candida albicans mutierten stämmen während einer aktiven infektion in einem säugetierwirt

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans ist ein wichtiger humanpathogener Erreger. Seine Fähigkeit, zwischen morphologischen Formen zu wechseln, ist von zentraler Bedeutung für seine Pathogenese; Diese morphologischen Veränderungen werden durch ein komplexes Signalnetzwerk reguliert, das als Reaktion auf Umweltreize gesteuert wird. Diese regulatorischen Komponenten wurden intensiv untersucht, aber fast alle Studien verwenden eine Vielzahl von In-vitro-Stimuli, um die Filamentation auszulösen. Um zu bestimmen, wie die Morphogenese während des Pathogeneseprozesses reguliert wird, entwickelten wir ein In-vivo-Mikroskopiesystem, um hochauflösende Bilder von Organismen zu erhalten, die sich im Säugetierwirt hyphalisch bilden. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung dieses Systems zum Screening kleiner Sammlungen von C. albicans-Mutantenstämmen, so dass wir die wichtigsten Regulatoren der Morphogenese identifizieren können, wie sie am Ort der Infektion auftreten. Es werden repräsentative Ergebnisse vorgestellt, die zeigen, dass einige Regulatoren der Morphogenese, wie der Transkriptionsregulator Efg1, konsistente Phänotypen in vitro und in vivo haben, während andere Regulatoren, wie die Adenylzyklase (Cyr1), signifikant unterschiedliche Phänotypen in vivo im Vergleich zu in vitro aufweisen.

Die hier vorgestellten Ergebnisse basieren auf den bereits veröffentlichten Berichten 9.10. Das Ziel dieser Analyse ist es, die Fähigkeit mutierter C. albicans-Stämme, während aktiver Infektionen eine Morphogenese zu durchlaufen, quantitativ zu bewerten. Die typischen Parameter, die Pseudohyphen von Hyphen unterscheiden, können bei Organismen, die in einer komplexen in vivo-Umgebung dreidimensional wachsen, schwer zu bewerten sein. Dies gilt insbesondere für die zweidimensionalen Querschnitte, die durch konfokale Bildgebung erzeugt werden. Daher konzentriert sich diese Screening-Analyse auf die Identifizierung von Organismen, die als filamentös gegenüber Hefe wachsen. Für Folgestudien mit einer tiefergehenden Analyse, einschließlich dreidimensionaler Rekonstruktionen, könnte diese Methode angepasst werden, um Hefe, Hyphen und Pseudohyphen zu unterscheiden.
Die Expression eines fluoreszierenden Proteins in einem Referenz- oder mutierten Stamm von C. albicans ermöglicht einen einfachen Nachweis der Stammmorphologie in vivo (Abbildung 3 und Abbildung 4). Im Allgemeinen wird die quantitative lichtmikroskopische Analyse am besten durchgeführt, wenn nur wenige bis keine Pixel im Bild gesättigt sind. Bei diesem Protokoll vereinfacht jedoch oft eine Sättigung des Bildes die Analyse. Die Lokalisierung fluoreszierender Proteine ist nicht gleichmäßig in der gesamten Zelle und ist in der Mutterhefe oft höher als in Filamenten. Glücklicherweise bestimmt für die Untersuchung der Morphogenese die räumliche Verteilung des Signals und nicht seine Intensität das Ergebnis. Daher verbessert die Gewinnung von Bildern, in denen viele Pixel gesättigt sind, die Fähigkeit, die Morphogenese in diesem Assay zu quantifizieren.
Um die Bedeutung der Bewertung der Morphogenese in vivo zu veranschaulichen, werden repräsentative Ergebnisse für den Referenzstamm (SN250) und zwei Mutanten präsentiert: einer ohne den Transkriptionsfaktor Efg1 und der andere ohne Adenylylcyclase Cyr1. In vitro wächst keiner dieser Stämme als Filamente20,21. Wenn in vitro in RPMI-Medium gezüchtet wird, das mit 10% Serum ergänzt wird, bildet der Referenzstamm schnell Filamente, während die efg1ΔΔ- und cyr1ΔΔ-Stämme dies nicht tun (Abbildung 3 und Abbildung 4). Unter diesen Bedingungen zeigt die efg1ΔΔ-Mutante ein etwas polarisiertes Wachstum, wobei die Tochterzellen im Vergleich zu den Mutterzellen leicht verlängert sind. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, eine klare Definition der Filamentation zu verwenden. Eine solche Definition ist standardmäßig willkürlich, aber sie ist für eine konsistente Bewertung des Phänotyps notwendig. Für diese Studien wird ein filamentöses Wachstumsmuster als ein Organismus mit der längsten Dimension einer Tochterzelle definiert, die mehr als doppelt so groß ist wie die der Mutterzelle. Nach dieser Definition sind die länglichen efg1ΔΔ-Zellen nicht filamentös.
In Übereinstimmung mit seinem In-vitro-Phänotyp weist das efg1 ΔΔ in vivo einen signifikanten Filamentationsdefekt auf: Etwa 9% der efg1ΔΔ-Zellen wuchsen in vivo als Filamente (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu wuchsen 53% der cyr1ΔΔ-mutierten Zellen als Filamente in vivo (Abbildung 4). Obwohl die Anzahl der Cyr1 ΔΔ-mutierten Zellen, die in vivo einer Filamentation unterzogen wurden, signifikant geringer war als der Referenzstamm, stellt die Fähigkeit der Cyr1ΔΔ-Mutante, Filamente in vivo zu bilden, eine wesentliche Veränderung gegenüber ihrem völligen Fehlen von Morphogenese in vitro dar. Optisch schienen die von der cyr1ΔΔ-Mutante gebildeten Filamente kürzer zu sein als der Referenzstamm. Um dies quantitativ auszuwerten, wurde die Kurvenweglänge der filamentösen Zellen mittels einer zweidimensionalen Projektion der in vivo Bilder gemessen (Abbildung 4E). Die mediane Länge von Cyr1ΔΔ-Filamenten war 29% kürzer als die von Filamenten des Referenzstamms.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig01.jpg"> Abbildung 1: Anästhesie und Impfung . (A) Einleitung der Anästhesie unter Verwendung einer Induktionskammer. (B) Die Anästhesie wird mit einem Nasenkegel aufrechterhalten, so dass die Maus bei Bedarf neu positioniert werden kann. (C) Die Haarentfernungscreme wird mit einem Applikator mit Baumwollspitze aufgetragen. Augenschmiergel wurde aufgetragen, um die Augen während der Anästhesie zu schützen. (D) Effektive Haarentfernung des rechten Ohres. Vergleichen Sie mit dem unbehandelten linken Ohr. (E) Intradermale Injektion von C. albicans in das Mausohr. Das Ohr wird mit der Spitze eines konischen Röhrchens gehalten, das mit doppelseitigem Hautband (Modeband) umwickelt ist. (F) Nahaufnahme der intradermalen Injektion. In der Haut bildet sich eine blasse Blase, die ein Zeichen für eine erfolgreiche intradermale Platzierung ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig02.jpg"> Abbildung 2: Vorbereitung für die Bildgebung . (A) Für die Bildgebung vorbereiteter Mikroskoptisch. Der Nasenkonus der Anästhesie ist fixiert. Ein Deckglas wird auf die Bühne geklebt, die die Linsenöffnung bedeckt. Zusätzliche Klebebänder sind erhältlich. Der Heiztisch wird auf 37 °C vorgewärmt (nicht abgebildet). (B) Einsetzen der anästhesierten Maus in den Nasenzapfen der Anästhesie. (C) Die Maus wird leicht gedreht, so dass die Seite des Ohres, die geimpft wurde, zum unteren Deckglas/Objektiv zeigt. Das Ohr wird dann gegen das untere Deckglas abgeflacht und fixiert, indem ein zweites Deckglas auf das Ohr gelegt wird. (D) Das obere Deckglas wird auf den Tisch geklebt, um das Ohr relativ zum Mikroskoptisch zu fixieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig3v2.jpg"> Abbildung 3: In vitro und in vivo Morphologie des efg1ΔΔ mutierten Stammes. (A) Weitfeldaufnahme von WT- und efg1-ΔΔ-Mutantenstämmen nach in vitro-Induktion der Filamentation durch Wachstum von Zellen in RPMI + 10% Serum bei 37 °C für 4 h. Maßstabsbalken stellen 10 μm dar. Der Bildkontrast wurde mit einer Bildbearbeitungssoftware angepasst, um die Anzeige zu erleichtern. (B) Prozentsatz der Filamentation in vitro, beobachtet in den WT- und efg1ΔΔ-Mutantenstämmen. Und = nicht nachweisbar (es wurden keine Filamente detektiert). Die Balkenhöhe stellt den mittleren Prozentsatz filamentöser Zellen aus drei unabhängigen Experimenten dar, in denen mindestens 100 Zellen quantifiziert wurden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an (Ergebnisse verglichen mit dem t-Test des Schülers, p &lt; 0,001). (C) Konfokalmikroskopische Aufnahme von WT (grün) und der efg1ΔΔ-Mutante (rot), die 24 h nach der Inokulation in vivo wächst. Pfeile zeigen Beispiele für efg1ΔΔ mutierte Zellen, die unserer Definition von "filamentös" entsprechen. Der Maßstabsbalken entspricht 50 μm. (D) Prozentsatz der Filamentation in vivo, beobachtet in den WT- und efg1ΔΔ-Mutantenstämmen. Die Balkenhöhe stellt den mittleren Prozentsatz filamentöser Zellen aus zwei unabhängigen Experimenten dar. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an (Ergebnisse verglichen mit dem t-Test des Schülers, p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64258/64258fig04v2.jpg"> Abbildung 4: In vitro und in vivo Morphologie des cyr1 ΔΔ mutierten Stammes. (A) Weitfeldbild des cyr1ΔΔ-mutierten Stammes nach in vitro Induktion der Filamentation durch Wachstum von Zellen in RPMI + 10% Serum bei 37 °C für 4 h. Der Maßstabsbalken stellt 10 μm dar. Der Bildkontrast wurde mit einer Bildbearbeitungssoftware angepasst, um die Anzeige zu erleichtern. (B) Prozentsatz der in vitro beobachteten Filamentation in den WT- und cyr1-ΔΔ-Mutantenstämmen. Und = nicht nachweisbar (es wurden keine Filamente detektiert). Die Balkenhöhe stellt den mittleren Prozentsatz filamentöser Zellen aus drei unabhängigen Experimenten dar, in denen mindestens 100 Zellen quantifiziert wurden. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an (Ergebnisse verglichen mit dem t-Test des Schülers, p &lt; 0,001). (C) Konfokalmikroskopische Aufnahme von WT (grün) und der Cyr1ΔΔ-Mutante (rot), die 24 h nach der Inokulation in vivo wächst. Der Maßstabsbalken stellt 50 μm dar. (D) Prozentsatz der Filamentation in vivo, beobachtet in den WT- und cyr1ΔΔ-Mutantenstämmen. Die Balkenhöhe stellt den mittleren Prozentsatz filamentöser Zellen aus zwei unabhängigen Experimenten dar. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an (Ergebnisse verglichen mit dem t-Test des Schülers, p &lt; 0,001). (E) Verteilung der Filamentlänge in vivo, gemessen durch Kurvenweglänge in einer zweidimensionalen Projektion des z-Stacks. Jeder Punkt repräsentiert die Länge eines Filaments. Zellen, die als Hefe wachsen, wurden in diese Analyse nicht einbezogen. Bar gibt die mittlere Filamentlänge an. Die Verteilung der Längen ist signifikant unterschiedlich, wenn sie mit einem Mann-Whitney-U-Test analysiert wird (p &lt; 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64258/64258fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum Screening mittelgroßer Candida albicans-Mutantenbibliotheken auf Morphogenesephänotypen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mittels nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Die Morphogenese von Candida albicans wird durch eine Vielzahl von Umweltsignalen ausgelöst. Indem wir die Morphogenese in vivo untersuchen, bestimmen wir, wie der Organismus all diese Umweltsignale integriert und darauf reagiert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Morphogenese ohne Verzerrungen oder Artefakte zu untersuchen, die mit In-vitro-Modellsystemen eingeführt werden könnten.Nur sehr wenige Menschen haben Erfahrung mit intradermalen Injektionen. Ich empfehle dringend, dass jemand, der mit dieser Technik noch nicht vertraut ist, sich an seinen Tierarzt wendet, um Hilfe beim Erlernen zu erhalten. Rohan Wakade, Postdoktorand aus unserer Laborgruppe, demonstriert das Verfahren.Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Tieres auf die Impfung, indem Sie mindestens sieben Tage vor der Impfung chlorophyllfreies Futter füttern. Nehmen Sie einen Tag vor der Injektion einen Klecks Canada albicans Zellen aus einer Kolonie mit einem Zahnstocher. Impfen Sie 25 Milliliter YPD und wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, um Zellen aus mehreren verschiedenen Kolonien zu erhalten.Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 175 U/min. Ein Milliliter Kultur für zwei Minuten bei 500 x g zentrifugieren, dann die Hefe dreimal mit einem Milliliter sterilem DPBS waschen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter sterilem DPBS und verdünnen Sie die Kultur bei 1 bis 100.Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zelldichte entsprechend an. Als nächstes erstellen Sie das Inokulum für die Injektion, indem Sie gleiche Volumina des referenzierten und experimentellen Stammes mischen. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine rezeptfreie Enthaarungscreme großzügig auf die innere und äußere Oberfläche beider Ohren eines betäubten Tieres auf.Nach zwei bis drei Minuten wischen Sie das Ohr vorsichtig mit einer trockenen Gaze ab, gefolgt von Mullpads, die in sterilem Wasser gesättigt sind, um Enthaarungscremerückstände gründlich zu entfernen. Nachdem Sie die Ohrenoberfläche mit 70% Ethanol sterilisiert haben, mischen Sie das Inokulum gut, indem Sie die Durchstechflasche mehrmals umkehren oder vortexen. Ziehen Sie 20 bis 30 Mikroliter Inokulum in eine Insulinspritze.Halten Sie die Nadel in der aufrechten Position und klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, um sicherzustellen, dass sich Luft im Zylinder oben befindet. Werfen Sie vorsichtig Luft und überschüssiges Inokulum zurück in das Inokulumrohr oder ein Abfallrohr, so dass der Kolben die 10-Mikroliter-Marke erreicht. Tragen Sie das doppelseitige Hautband über dem Ladentisch auf einen kleinen konischen oder runden Kunststoffschlauch auf und drapieren Sie das Ohr über das Band, um zu vermeiden, dass sich der Nasenkonus der Anästhesie löst.Halten Sie die Spritzennadel fast parallel zur Haut und vermeiden Sie große Venen, führen Sie die Spitze der Nadel in die äußerste Hautschicht ein, bis die Fase gerade noch bedeckt ist, und injizieren Sie das Inokulum langsam intradermal. Eine gute intradermale Injektion wird eine kleine Blase in der Haut aufwirbeln. Halten Sie die Nadel 15 bis 20 Sekunden lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie aus dem Ohr entfernen, um ein Auslaufen zu minimieren.Kennzeichnen Sie den Käfig gemäß den institutionellen Protokollen mit Biohazard-Etiketten, die darauf hinweisen, dass die Tiere im Käfig mit Candida albicans infiziert sind. Unter Verwendung der gleichen gewaschenen Kulturen, die zur Herstellung des Inokulums verwendet wurden, eine 1 bis 50-Zellverdünnung in RPMI 1640 herstellen, ergänzt mit 10% Wärme und aktiviertem fetalem Rinderserum, und bei 37 Grad Celsius mit Taumeln für vier Stunden inkubieren. Untersuchen Sie die Probe mit einem Mikroskop.Zählen Sie mindestens 100 Zellen und notieren Sie die Anzahl der Hefe- und Fadenzellen für jeden Stamm. Drehen Sie das Objektiv mit langer Arbeitsentfernung und legen Sie einen Tropfen Tauchflüssigkeit auf die Linse. Senken Sie das Objektiv, um mögliche Schäden beim Platzieren des Abdeckscheins zu vermeiden.Platznummer 1.5 Cover über die Bühnenöffnung schieben und an Ort und Stelle kleben. Heben Sie das Objektiv so an, dass die Tauchflüssigkeit sowohl mit der Objektivlinse als auch mit dem Abdeckschlupf in Kontakt kommt. Befestigen Sie einen Anästhesie-Nasenkegel auf dem Mikroskoptisch so, dass er die Nase des Tieres vollständig bedeckt, wenn es für die Bildgebung in Position ist.Legen Sie die Nase einer betäubten Maus in den Nasenkegel. Legen Sie einen Tropfen steriles Wasser auf den Abdeckschein über der Objektivlinse. Stellen Sie den Nasenkonus der Anästhesie ein und positionieren Sie die Maus so, dass sich das Ohr der Maus über dem Wassertropfen befindet.Nehmen Sie einen weiteren Deckschein und legen Sie den Rand des Deckstreifens parallel zum Körper der Maus, wobei der Rand die Maus dort berührt, wo das Ohr auf den Kopf trifft. Senken Sie mit einer Scharnierbewegung den freien Rand des Deckels auf den Mikroskoptisch. Wenn der Deckschlupf gegen den Mikroskoptisch kommt, wird das Ohr abgeflacht.Kleben Sie die obere Abdeckung sicher ab, um gerade genug Druck zu halten, um das Ohr flach zu halten und zu vermeiden, dass die Haare oder Schnurrhaare der Maus im Klebeband gefangen bleiben. Sofern kein Mikroskop mit einer Klimakammer verwendet wird, bedecken Sie den Körper der Maus locker mit einem sterilen Vorhang, um eine normale thermische Umgebung aufrechtzuerhalten. Passen Sie mit weißem Licht und Weitfeldbildgebung die Fokusebene in das Ohrgewebe ein und konzentrieren Sie sich auf die roten Blutkörperchen, die sich in den Blutgefäßen bewegen.Um ein ausreichend starkes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, damit die Morphologie für alle Zellen im Sichtfeld bestimmt werden kann, passen Sie die Laserleistung oder die Bildgebungsgeschwindigkeit an. Um Gewebeschäden zu vermeiden, verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung. Wählen Sie ein Sichtfeld mit klarer Filamentbildung im referenzierten Stamm und wo die meisten Organismen so weit verteilt sind, dass ihre Morphologie bestimmt werden kann.Legen Sie die obere und untere Fokusebene für einen Z-Stack fest. Es ist nicht notwendig, die gesamte Tiefe des infizierten Bereichs abzudecken, aber denken Sie daran, dass Organismen am oberen oder unteren Rand des abgebildeten Volumens typischerweise von der Analyse ausgeschlossen sind. Erfassen Sie Z-Stack-Bilder, färben Sie jeden Kanal pseudo, um jede Dehnung zu unterscheiden, und überlagern Sie die Kanäle.Speichern Sie die Bilder. Verwenden Sie eine Imaging-Software, um eine maximale Projektion des Z-Stacks in ein zweidimensionales Bild durchzuführen. Zählen Sie jeden Organismus, der in den maximalen Projektionsbildern zu sehen ist, nach Stammtyp und Morphologie.Der referenzierte Stamm bildet in vitro schnell Filamente. Während das EFG1 Null die Filamente nicht bilden konnte. Das EFG1 Null weist auch in vivo einen signifikanten Filamentationsdefekt auf.Etwa 9% der EFG1-Null-Zellen wuchsen in vivo als Filamente. In ähnlicher Weise zeigte der CYR1 Null-mutierte Stamm in vitro einen Filamentationsdefekt im Vergleich zum referenzierten Stamm. Im Gegensatz dazu wuchsen 53% der CYR1-Nullmutantenzellen als Filamente in vivo.Die von der CYR1 Null-Mutante gebildeten Filamente waren kürzer als der referenzierte Stamm. Es ist wichtig, die Nadel während der Impfung parallel zur Haut zu halten. Ziel ist es, das Inokulum direkt unter der äußeren Hautschicht zu platzieren.Diese Technik kann auch mit Mausstämmen verwendet werden, die ein fluoreszierendes Protein in Wirtszellen von Interesse exprimieren, so dass wir die Interaktionen mit Wirtserregern in vivo untersuchen können.

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Forschung

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