Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Die Morphogenese von Candida albicans wird durch eine Vielzahl von Umweltsignalen ausgelöst. Indem wir die Morphogenese in vivo untersuchen, bestimmen wir, wie der Organismus all diese Umweltsignale integriert und darauf reagiert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Morphogenese ohne Verzerrungen oder Artefakte zu untersuchen, die mit In-vitro-Modellsystemen eingeführt werden könnten.

Nur sehr wenige Menschen haben Erfahrung mit intradermalen Injektionen. Ich empfehle dringend, dass jemand, der mit dieser Technik noch nicht vertraut ist, sich an seinen Tierarzt wendet, um Hilfe beim Erlernen zu erhalten. Rohan Wakade, Postdoktorand aus unserer Laborgruppe, demonstriert das Verfahren.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Tieres auf die Impfung, indem Sie mindestens sieben Tage vor der Impfung chlorophyllfreies Futter füttern. Nehmen Sie einen Tag vor der Injektion einen Klecks Canada albicans Zellen aus einer Kolonie mit einem Zahnstocher. Impfen Sie 25 Milliliter YPD und wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals, um Zellen aus mehreren verschiedenen Kolonien zu erhalten.

Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 175 U/min. Ein Milliliter Kultur für zwei Minuten bei 500 x g zentrifugieren, dann die Hefe dreimal mit einem Milliliter sterilem DPBS waschen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter sterilem DPBS und verdünnen Sie die Kultur bei 1 bis 100.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zelldichte entsprechend an. Als nächstes erstellen Sie das Inokulum für die Injektion, indem Sie gleiche Volumina des referenzierten und experimentellen Stammes mischen. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine rezeptfreie Enthaarungscreme großzügig auf die innere und äußere Oberfläche beider Ohren eines betäubten Tieres auf.

Nach zwei bis drei Minuten wischen Sie das Ohr vorsichtig mit einer trockenen Gaze ab, gefolgt von Mullpads, die in sterilem Wasser gesättigt sind, um Enthaarungscremerückstände gründlich zu entfernen. Nachdem Sie die Ohrenoberfläche mit 70% Ethanol sterilisiert haben, mischen Sie das Inokulum gut, indem Sie die Durchstechflasche mehrmals umkehren oder vortexen. Ziehen Sie 20 bis 30 Mikroliter Inokulum in eine Insulinspritze.

Halten Sie die Nadel in der aufrechten Position und klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, um sicherzustellen, dass sich Luft im Zylinder oben befindet. Werfen Sie vorsichtig Luft und überschüssiges Inokulum zurück in das Inokulumrohr oder ein Abfallrohr, so dass der Kolben die 10-Mikroliter-Marke erreicht. Tragen Sie das doppelseitige Hautband über dem Ladentisch auf einen kleinen konischen oder runden Kunststoffschlauch auf und drapieren Sie das Ohr über das Band, um zu vermeiden, dass sich der Nasenkonus der Anästhesie löst.

Halten Sie die Spritzennadel fast parallel zur Haut und vermeiden Sie große Venen, führen Sie die Spitze der Nadel in die äußerste Hautschicht ein, bis die Fase gerade noch bedeckt ist, und injizieren Sie das Inokulum langsam intradermal. Eine gute intradermale Injektion wird eine kleine Blase in der Haut aufwirbeln. Halten Sie die Nadel 15 bis 20 Sekunden lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie aus dem Ohr entfernen, um ein Auslaufen zu minimieren.

Kennzeichnen Sie den Käfig gemäß den institutionellen Protokollen mit Biohazard-Etiketten, die darauf hinweisen, dass die Tiere im Käfig mit Candida albicans infiziert sind. Unter Verwendung der gleichen gewaschenen Kulturen, die zur Herstellung des Inokulums verwendet wurden, eine 1 bis 50-Zellverdünnung in RPMI 1640 herstellen, ergänzt mit 10% Wärme und aktiviertem fetalem Rinderserum, und bei 37 Grad Celsius mit Taumeln für vier Stunden inkubieren. Untersuchen Sie die Probe mit einem Mikroskop.

Zählen Sie mindestens 100 Zellen und notieren Sie die Anzahl der Hefe- und Fadenzellen für jeden Stamm. Drehen Sie das Objektiv mit langer Arbeitsentfernung und legen Sie einen Tropfen Tauchflüssigkeit auf die Linse. Senken Sie das Objektiv, um mögliche Schäden beim Platzieren des Abdeckscheins zu vermeiden.

Platznummer 1.5 Cover über die Bühnenöffnung schieben und an Ort und Stelle kleben. Heben Sie das Objektiv so an, dass die Tauchflüssigkeit sowohl mit der Objektivlinse als auch mit dem Abdeckschlupf in Kontakt kommt. Befestigen Sie einen Anästhesie-Nasenkegel auf dem Mikroskoptisch so, dass er die Nase des Tieres vollständig bedeckt, wenn es für die Bildgebung in Position ist.

Legen Sie die Nase einer betäubten Maus in den Nasenkegel. Legen Sie einen Tropfen steriles Wasser auf den Abdeckschein über der Objektivlinse. Stellen Sie den Nasenkonus der Anästhesie ein und positionieren Sie die Maus so, dass sich das Ohr der Maus über dem Wassertropfen befindet.

Nehmen Sie einen weiteren Deckschein und legen Sie den Rand des Deckstreifens parallel zum Körper der Maus, wobei der Rand die Maus dort berührt, wo das Ohr auf den Kopf trifft. Senken Sie mit einer Scharnierbewegung den freien Rand des Deckels auf den Mikroskoptisch. Wenn der Deckschlupf gegen den Mikroskoptisch kommt, wird das Ohr abgeflacht.

Kleben Sie die obere Abdeckung sicher ab, um gerade genug Druck zu halten, um das Ohr flach zu halten und zu vermeiden, dass die Haare oder Schnurrhaare der Maus im Klebeband gefangen bleiben. Sofern kein Mikroskop mit einer Klimakammer verwendet wird, bedecken Sie den Körper der Maus locker mit einem sterilen Vorhang, um eine normale thermische Umgebung aufrechtzuerhalten. Passen Sie mit weißem Licht und Weitfeldbildgebung die Fokusebene in das Ohrgewebe ein und konzentrieren Sie sich auf die roten Blutkörperchen, die sich in den Blutgefäßen bewegen.

Um ein ausreichend starkes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, damit die Morphologie für alle Zellen im Sichtfeld bestimmt werden kann, passen Sie die Laserleistung oder die Bildgebungsgeschwindigkeit an. Um Gewebeschäden zu vermeiden, verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung. Wählen Sie ein Sichtfeld mit klarer Filamentbildung im referenzierten Stamm und wo die meisten Organismen so weit verteilt sind, dass ihre Morphologie bestimmt werden kann.

Legen Sie die obere und untere Fokusebene für einen Z-Stack fest. Es ist nicht notwendig, die gesamte Tiefe des infizierten Bereichs abzudecken, aber denken Sie daran, dass Organismen am oberen oder unteren Rand des abgebildeten Volumens typischerweise von der Analyse ausgeschlossen sind. Erfassen Sie Z-Stack-Bilder, färben Sie jeden Kanal pseudo, um jede Dehnung zu unterscheiden, und überlagern Sie die Kanäle.

Speichern Sie die Bilder. Verwenden Sie eine Imaging-Software, um eine maximale Projektion des Z-Stacks in ein zweidimensionales Bild durchzuführen. Zählen Sie jeden Organismus, der in den maximalen Projektionsbildern zu sehen ist, nach Stammtyp und Morphologie.

Der referenzierte Stamm bildet in vitro schnell Filamente. Während das EFG1 Null die Filamente nicht bilden konnte. Das EFG1 Null weist auch in vivo einen signifikanten Filamentationsdefekt auf.

Etwa 9% der EFG1-Null-Zellen wuchsen in vivo als Filamente. In ähnlicher Weise zeigte der CYR1 Null-mutierte Stamm in vitro einen Filamentationsdefekt im Vergleich zum referenzierten Stamm. Im Gegensatz dazu wuchsen 53% der CYR1-Nullmutantenzellen als Filamente in vivo.

Die von der CYR1 Null-Mutante gebildeten Filamente waren kürzer als der referenzierte Stamm. Es ist wichtig, die Nadel während der Impfung parallel zur Haut zu halten. Ziel ist es, das Inokulum direkt unter der äußeren Hautschicht zu platzieren.

Diese Technik kann auch mit Mausstämmen verwendet werden, die ein fluoreszierendes Protein in Wirtszellen von Interesse exprimieren, so dass wir die Interaktionen mit Wirtserregern in vivo untersuchen können.