Rekonstitution der Aktin-basierten Motilität mit kommerziell erhältlichen Proteinen

Mit einer einfachen Mischung aus Inhaltsstoffen und funktionalisierten Oberflächen stellt dieses Protokoll eine lebenswichtige Funktion der Zellen wieder her, die durch Aktin-Assemblierung angetrieben wird. Die biochemischen und biophysikalischen Mechanismen der Krafterzeugung können durch Variation der Inhaltsstoffmischung und der Eigenschaften der funktionalisierten Oberfläche beurteilt werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass alle Inhaltsstoffe gekauft werden können, so dass keine Erfahrung in der Proteinreinigung erforderlich ist.

Dies ermöglicht es Nicht-Spezialisten, dieses System als Werkzeug für ihre Forschung zu nutzen. Dieses Protokoll bietet ein Unterrichtsmodul auf Bachelor-Niveau, das den Schülern praktische Erfahrungen bei der Manipulation von Proteinen und der Beobachtung eines selbst erstellten biologischen Systems unter dem Mikroskop vermittelt. Sie können Systemparameter steuern und variieren.

Physikalische Analysen, z. B. eine Langmuir-Gleichung, können auf Trajektorien ausgeführt werden. Beginnen Sie mit der Resuspendierung lyophilisierter Proteine. Sammeln Sie den Feststoff am Boden des Röhrchens durch Pulszentrifugieren von Proteinpulvern bei vier Grad Celsius.

Dann fügen Sie Wasser gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu und inkubieren Sie mindestens 15 Minuten auf Eis. Durch Pipettieren vorsichtig mischen. Lassen Sie es weitere 15 Minuten auf dem Eis und mischen Sie es erneut.

Sammeln Sie die Lösung am Boden des Röhrchens durch Zentrifugieren. Remix und Aliquot auf Eis. Um Aktin-Oligomere, die während der Lyophilisation und des Gefrierens gebildet werden, zu depolymerisieren, wird ein Aliquot resuspendiertes Aktin achtfach in G-Puffer verdünnt, der mit zusätzlichem ATP, DTT und 10% markiertem Aktin versetzt ist.

Lassen Sie es auf Eis mit gelegentlichem Mischen für mindestens einige Tage bis eine Woche depolymerisieren, bevor Sie die Proteinkonzentration messen. Um die Proteinkonzentrationen von resuspendierten Proteinen zu messen, wird zunächst eine BSA-Verdünnungsreihe hergestellt. Beginnen Sie, indem Sie zwei Milliliter- und 1,5-Milliliter-Röhrchen in ein Gestell legen, wie im Manuskript beschrieben.

Füllen Sie ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen oben mit Bradford-Reagenz und legen Sie es auf Eis. Nehmen Sie 200 Mikroliter Bradford-Reagenz und werfen Sie es zurück in das konische Rohr, um die Pipettenspitze zu benetzen. Da die Lösung viskos ist, pipetten Sie langsam, damit die Lösung vollständig in die Spitze eindringen und sie verlassen kann, ohne Blasen zu bilden.

Pipettieren Sie dann mit der vornassen Spitze 200 Mikroliter Bradford-Reagenz in jedes der 1,5-Milliliter-Röhrchen im Rack. Und geben Sie den restlichen Inhalt des 15 Milliliter konischen Röhrchens in die Flasche zurück. Messen Sie Wasser in die zwei Milliliterröhrchen der Reihen eins, drei und fünf.

Bereiten Sie die BSA-Verdünnungsreihe vor, indem Sie die kalibrierte BSA-Stammlösung wie im Manuskript beschrieben verdünnen. Führen Sie dann serielle Verdünnungen durch, indem Sie 900 Mikroliter jeder Lösung in das nächste Röhrchen überführen. Fügen Sie 800 Mikroliter Wasser in das Bradford-Reagenzrohr für den Rohling hinzu und starten Sie den Timer.

Mischen Sie 800 Mikroliter jedes BSA-Standards mit 200 Mikrolitern Bradford-Reagenz in den vorbereiteten Röhrchen. Innerhalb von fünf Minuten nach dem Mischen mit dem Bradford-Reagenz oder jedem Standard in einer Einwegküvette wird dann die Absorption bei 600 Nanometern abgelesen. Die erhaltenen Extinktionswerte werden als Funktion der bekannten BSA-Konzentration grafisch dargestellt und erhalten eine lineare Korrelation mit einem R-Wert von 0,99.

In den Röhrchen mit 2000 Mikrolitern Wasser werden resolubilisierte Proteine vorsichtig verdünnt, wie im Manuskript beschrieben. Sofort 800 Mikroliter jeder Lösung in das vorbereitete Bradford-Reagenz geben und mischen. Lesen Sie die Extinktionen im Spektralphotometer innerhalb von fünf Minuten ab.

Berechnen Sie die Proteinkonzentrationen anhand der zuvor konstruierten Standardkurve. Für die Perlenbeschichtung die Zentrifuge auf vier Grad Celsius vorkühlen. Pipettieren Sie 50 Mikroliter Xb-Puffer in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Mischen Sie die Perlensuspension mit einem Durchmesser von 4,5 Mikrometern gründlich durch Wirbeln und fügen Sie neun Mikroliter der Suspension in das Röhrchen mit Xb-Puffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Um die Perlen zu beschichten, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören, und resuspendieren Sie das Perlenpellet in 40 Mikrolitern zwei mikromolaren SpVCA in Xb-Puffer durch vorsichtiges Pipettieren.

Rühren Sie nun die Perlen im Trockenblock bei 1000 U/min für 20 Minuten bei 18 Grad Celsius. Als nächstes waschen Sie die beschichteten Perlen durch Zentrifugieren. Entfernen des Überstands und Resuspendieren der Perlen in 50 Mikroliter kaltem Xb mit 1% BSA.

Nach dem Waschen der Perlen das beschichtete Perlenpellet in 120 Mikroliter kaltem Xb, 1% BSA resuspendieren. Auf Eis im Kühlschrank oder Kühlraum aufbewahren. Bereiten Sie das Motilitätsreaktionsgemisch wie im Manuskript beschrieben vor.

Mischen Sie schnell die Reaktion und starten Sie den Timer. Erkennen Sie die gesamte Motilitätsreaktionsmischung auf einem Objektträger. Bedecken Sie es mit einem 18 Millimeter mal 18 Millimeter großen Deckglas und verschließen Sie das Deckglas mit geschmolzenem VALAP mit einem kleinen Pinsel.

Um durchschnittliche Verschiebungsgeschwindigkeiten für eine ganze Population von Perlen zu erhalten, zeichnen Sie Phasenkontrast oder fluoreszierende Standbilder im Laufe der Zeit auf, indem Sie das gesamte Dia scannen. Messen Sie die Kometenlänge von Hand und protokollieren Sie die Werte. Zeichnen Sie die Kometenlänge über die Zeit auf.

Die Steigung der linearen Passung ist die durchschnittliche Wachstumsgeschwindigkeit. Wählen Sie Zeitrafferfilme in der Phasenkontrastmikroskopie aus, um einzelne Raupengeschwindigkeiten zu bewerten. Abhängig von der Perlengeschwindigkeit und der erforderlichen Auflösung nehmen Sie alle 1 bis 10 Sekunden Bilder auf.

Verwenden Sie das Tracking-Tool eines beliebigen Bildverarbeitungsprogramms, um Perlengeschwindigkeiten und Trajektorien zu erhalten. Das Mischen von BSA-Standards mit Bradford-Reagenz ergibt eine Lösung mit abgestuften Blautönen. Die Absorptionswerte werden im Vergleich zu den Standardproteinkonzentrationen aufgetragen und die lineare Korrelation wird verwendet, um die resuspendierten Proteinkonzentrationen zu bestimmen.

Das Mischen von SPVCA-kodierten Beads und Motilitätsmedium, das Capping-Protein enthält, führt innerhalb von Minuten zur Bildung von Aktinwolken. Die Wolkenpolarisation erfolgt nach etwa fünf Minuten und die Kometenproduktion nach 15 bis 20 Minuten. Die Aktinkometen verlängern sich noch viele Stunden, aber eine konstante Geschwindigkeit wird nicht aufrechterhalten.

So wird die Perlenmotilität innerhalb einer Stunde bewertet. Motilitätsmischung mit entweder Capping-Protein oder Gelsolin ergibt Kometen auf ähnliche Weise. Aktinwolken polarisierten in den ersten 20 Minuten der Reaktion zu Kometen, und Kometen dehnen sich mit der Zeit aus.

Die Auswertung von Kometenlängen, die über die Zeit gemessen werden, wird verwendet, um die Verdrängungsgeschwindigkeit zu berechnen. In Abwesenheit von Capping-Aktivität bilden sich Aktinwolken um Perlen, aber Kometenbildung findet nicht statt. Die sorgfältige Handhabung und das Pipettieren von Proteinen ist für den Erfolg dieses Verfahrens unerlässlich, nicht nur bei der Herstellung der Motilitätsmischung, sondern auch bei der Messung der Proteinkonzentrationen mit dem Bradford-Assay.

Kometenbildung und Perlenbahnen, die mit diesem Protokoll erhalten wurden, ermöglichen das Verständnis des physikalischen Bewegungsmechanismus unter Verwendung von Analysen der weichen Materie und statistischer Physik sowie biophysikalischer Experimente, einschließlich Kraftmessungen und Mikromanipulation.