Hybridzell-Analysesystem zur Beurteilung struktureller und kontraktiler Veränderungen von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten für die präklinische kardiale Risikobewertung

Die Methode kann dazu beitragen, präklinische Fragen zur kardialen Sicherheit und Toxizität unter Verwendung realer humanbasierter Daten zu beantworten, um einen sicheren Übergang neuer Arzneimittelkandidaten in die klinische Phase zu ermöglichen. Anstatt eine Reihe verschiedener In-vitro- und In-vivo-Techniken zu verwenden, besteht der Hauptvorteil dieses Hybridsystems in der gleichzeitigen Bewertung von humanen iPC-abgeleiteten Kardiomyozyten, elektrophysiologischen und Lebensfähigkeitsparametern sowie in der Analyse kontraktiler Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen. Diese Methode kann für die Wirkstoffforschung angewendet werden, da sie elektrophysiologische, strukturelle und kontraktile Veränderungen von Kardiomyozyten und ein System mit höherem Durchsatz abdeckt, das die gleichzeitige Untersuchung von 69 Bohrlöchern ermöglicht.

Um mit der Plattenbeschichtung zu beginnen, lassen Sie den Boden der Kontraktionsplatte bis zur Messung im Kontraktilitätsmodul mit dem zusätzlich mitgelieferten Membranschutz abgedeckt. Für die Aussaat von Kardiomyozyten bereiten Sie eine verdünnte EHS-Gelbeschichtungslösung vor, indem Sie 2,75 Milliliter EHS-Gel-gebrauchsfertige Lösung und 8,25 Milliliter DPBS mit Kalzium und Magnesium in ein steriles Zentrifugenröhrchen überführen. Mischen Sie dann die Lösung.

Entfernen Sie den Membranschutz von der Kontraktionsplatte. Übertragen Sie die vorbereitete Beschichtungslösung in ein steriles Reagenzienreservoir im Laborautomatisierungsroboter. Verwenden Sie das Programm, fügen Sie 100 Mikroliter mit dem Laborautomatisierungsroboter hinzu und fügen Sie 100 Mikroliter der Beschichtungslösung pro Vertiefung hinzu.

Dann den Deckel wieder auf die 96-Well-Platte setzen und drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Auftauen und Zählen der Zellen stellen Sie die Zellen in das empfohlene Beschichtungsmedium gemäß den Anweisungen des Zellherstellers ein, was zu 11 mal 10 bis sechsten Zellen pro 11 Milliliter für die Aussaat einer gesamten 96-Well-Platte führt. Verwenden Sie das Programm 100 Mikroliter entfernen, um die EHS-Gellösung mit dem Laborautomatisierungsroboter aus den Vertiefungen zu entfernen.

Als nächstes überführen Sie die 11 Milliliter Zellsuspension in ein steriles Reagenzreservoir, das im Laborautomatisierungsroboter platziert wird, und säen die Zellen mit 100 Mikrolitern Suspension pro Well. Mit dem Programm fügen Zellen 100 Mikroliter hinzu. Unmittelbar nach der Zellaussaat die flexible 96-Well-Platte bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid, in den feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator geben und die Zellen über Nacht absetzen lassen.

In einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen werden 22 Milliliter Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium auf jede Platte auf 37 Grad Celsius gegeben. 18 bis 24 Stunden nach der Aussaat der Platten das frische Medium in ein steriles Reagenzreservoir überführen und neben dem Laborautomatisierungsroboter abstellen. Führen Sie dann die Mediumentfernung mit dem Programm durch und entfernen Sie 100 Mikroliter.

Als nächstes legen Sie das Reagenzienreservoir mit dem frischen Medium in den Laborautomatisierungsroboter und geben Sie 200 Mikroliter des frischen Mediums pro Vertiefung mit dem Programm ab, fügen Sie 100 Mikroliter hinzu. Führen Sie diesen Schritt zweimal durch, um 200 Mikroliter pro Vertiefung zu erreichen. Unmittelbar nach dem Mediumwechsel die Platte in den Inkubator überführen.

Führen Sie jeden zweiten Tag einen Mediumwechsel durch, bis die Verbindung zugegeben wird. Vier bis sechs Stunden vor der Zugabe der Verbindung führen Sie einen letzten Mediumwechsel durch, indem Sie 22 Milliliter frischen und warmen Assay-Puffer in ein steriles Reagenzienreservoir überführen und neben dem Laborautomatisierungsroboter belassen. Unmittelbar nach dem Mediumwechsel die flexible Platte wieder in den Inkubator überführen.

Eine Stunde vor der Basismessung die Platte in das jeweilige Messgerät überführen. Öffnen Sie in der Steuerungssoftware Protokoll bearbeiten und wählen Sie den jeweiligen Messmodus, Flex Site oder Impedanz EFP aus. Definieren Sie die Sweep-Dauer oder -Länge einer Messung auf 30 Sekunden und ein Wiederholungsintervall auf 10 Minuten, bevor Sie die Protokollnummer speichern.

Wählen Sie dann Protokoll starten und fahren Sie mit dem Ausfüllen der erforderlichen Felder fort. Wenn die Parameter eingestellt sind, wählen Sie Messung starten. Führen Sie mindestens drei Baseline-Messungen in Fünf-Minuten-Intervallen kurz vor der Zugabe der Verbindung durch.

Entfernen Sie 50 Mikroliter des Assay-Puffers aus jeder Vertiefung, ohne die flexible 96-Well-Platte aus dem Messgerät zu entfernen, gefolgt von der Zugabe von 50 Mikrolitern der vierfach konzentrierten Verbindungslösung in jede Vertiefung der Platte gemäß dem Messplan. Wählen Sie nach der Zugabe der Verbindung Reagenzmarker hinzufügen, um das Layout der Verbindungsplatte und das Volumen der Verbindungslösung zu definieren. Wählen Sie dann Mit Standardmessung fortfahren oder mit Messreihen gemäß Versuchsplan fortfahren.

Die repräsentative Analyse zeigt die Wirkungen des Kinase-Inhibitors Erlotinib auf die Kontraktilität von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Bei der niedrigsten Konzentration induzierte Erlotinib eine statistisch unsignifikante Abnahme der Amplitude, während mikromolare Konzentrationen von Erlotinib zeit- und dosisabhängige kardiotoxische Wirkungen zeigten. Der Beginn der Wirkung wurde nach 96 Stunden mit einem mikromolaren Erlotinib beobachtet, während die Behandlung mit 10 mikromolaren Erlotinib 24 Stunden nach Zugabe der Verbindung zu einer signifikanten Abnahme führte.

Nach der Anwendung von 10 mikromolaren Epirubicin hörten die Zellen innerhalb von 24 Stunden auf zu schlagen. Bei der Anwendung eines mikromolaren Epirubicins folgte auf eine drastische Abnahme der Amplitude nach 24 Stunden eine vollständige Beendigung des Schlages bis 48 Stunden. Bei 100 Nanomolaren wurde eine zeitabhängige Abnahme der Schlagamplitude beobachtet.

Bei der niedrigsten Konzentration von 10 Nanomolaren schwankte die Amplitude stetig, was bestätigte, dass die Wirkung von Epirubicin nur dosisabhängig war. Die Behandlung mit Doxorubicin und Nifedipin über 24 Stunden reduziert die Zelllebensfähigkeit konzentrations- und zeitabhängig. Bei Anwendung steigender Nifedipin-Konzentrationen zeigen Feldpotentialaufnahmen an Zellen eine konzentrationsabhängige Verkürzung der Felddauer normalisiert.

Die Nifedipin-Bewertung in Bezug auf die kardiale Kontraktilität zeigte ebenfalls eine signifikante konzentrationsabhängige Amplitudenabnahme bei akuter Messung mit 10 nanomolaren und 13 nanomolaren Konzentrationen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zellen im Allgemeinen empfindlich auf Umweltparameter wie Temperatur- und pH-Änderungen sowie auf mechanische Simulationen reagieren, die besonders auf den Kontraktionsplatten unterstützt werden.