Name: Herstellung einer Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus einem erwachsenen Mausherzen nach Myokardinfarkt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Lernen Sie die Isolierung lebensfähiger Nicht-Kardiomyozyten aus postinfarktigen Mäuseherzen für Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Studien zur zellulären Heterogenität in der kardiovaskulären Pathophysiologie.

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Diese Arbeit wurde vom Natural Science Funds der Provinz Zhejiang unterstützt (LQ22H020010).

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren an der Zhejiang University durchgeführt und vom Animal Advisory Committee der Zhejiang University genehmigt.
1. Ligatur der Koronararterien links anterior absteigend (LAD-Ligatur)
HINWEIS: Acht Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden als Modelle verwendet. Die Herzentnahme erfolgte 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt. Die linksanteriore absteigende Koronararterien-Ligaturoperation wurde wie zuvor beschrieben und nachgewiesen durchgeführt11.
<ol><li>Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente vor der Operation mit 70%igem Ethanol.</li>
	<li>Wiegen Sie die Maus und betäuben Sie sie dann mit intraperitonealen Injektionen von 1 % Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg). Beobachten Sie den Zehen-Kneif-Reflex und messen Sie die Atemfrequenz, um die Tiefe der Anästhesie während des Eingriffs zu beurteilen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus mit einem 37 °C warmen Heizkissen auf den OP-Tisch. Verwenden Sie Augensalbe, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.</li>
	<li>Enthaaren Sie die linke Brust und den Hals mit Enthaarungscreme und verwenden Sie Wattestäbchen, um Haare zu entfernen. Desinfizieren Sie die Haut mit Jodophor, gefolgt von 70% Alkohol, um den Bereich dreimal zu reinigen.</li>
	<li>Führen Sie einen Schnitt in der Mittellinie der Halswirbelsäule (0,8-1,0 cm) unter dem Mikroskop durch. Trennen Sie die Haut, den Muskel und das Gewebe, das die Luftröhre umgibt, und führen Sie dann eine 20-G-Kanüle in die Luftröhre ein. Anmerkungen: Beobachten Sie beim Einführen der Kanüle in die Luftröhre unter dem Mikroskop, dass der Schlauch nicht in die Speiseröhre eingeführt wird.</li>
	<li>Schließen Sie die Maus an ein Nagetierbeatmungsgerät an, das auf ein Tidalvolumen von 0,2 ml mit 150 Hüben pro Minute eingestellt ist.</li>
	<li>Schneiden Sie die Brust der Maus mit einer sterilen Schere schräg entlang der Mittelschlüsselbeinlinie ein. Präparieren Sie das Unterhautgewebe, um die Rippen freizulegen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Schere, um die Haut schräg entlang der linken mittleren Schlüsselbeinlinie (0,8-1,0 cm) zu schneiden. Führen Sie eine linke Thorakotomie durch, um die dritte und vierte Rippe zu trennen und das Herz freizulegen. Verwenden Sie einen Rippenaufroller für eine klare Sicht.</li>
	<li>Öffnen Sie das Perikard mit einer gekrümmten Pinzette und ligieren Sie dann die linke vordere absteigende Arterie (unterhalb des linken Vorhofanhangs) mit einer 7-0-Seidennaht. Eine blasse Vorderwand des linken Ventrikels deutet darauf hin, dass die myokardiale Perfusion erfolgreich unterbrochen wurde.</li>
	<li>Lösen Sie den Rippenretraktor und nähen Sie den Thoraxschnitt in Schichten mit einer 5-0-Seidennaht, während Sie Luft aus dem Brustkorb ausstoßen. Nähen Sie den Halsschnitt mit einer 5-0-Nahtseidennaht.</li>
	<li>Entfernen Sie den Trachealtubus von der Maus, sobald ihre Spontanatmung wiederhergestellt ist. Intraperitoneal 0,5 ml vorgewärmte sterile Kochsalzlösung injizieren. Injizieren Sie Buprenorphin (0,1 mg/kg) alle 12 Stunden subkutan, um die Schmerzen zu minimieren.</li>
	<li>Legen Sie abschließend die Maus auf das Heizkissen, um auf die Wiederbelebung zu warten. Überwachen Sie die Maus, um sicherzustellen, dass sie nicht an übermäßiger Dyspnoe oder Blutungen leidet, indem Sie sie visuell beobachten.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus nach dem Aufwachen in ihren Käfig zurück. Überwachen Sie die Maus in der ersten Woche täglich, um sicherzustellen, dass ihre Mobilität, Fellpflege und Essgewohnheiten angemessen sind. Ernten Sie das Herz je nach Bedarf des Experiments zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Myokardinfarkt. HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die einzellige Suspension 2 Wochen nach dem Myokardinfarkt mit dem Herzen hergestellt.</li>
</ol>2. Herstellung der kardialen Einzelzellsuspension
<ol><li>Aufbereitung der Lösungen und Medien<ol><li>Dissoziationspuffer für kardiales Gewebe: Mischen Sie 10 mg Kollagenase i.v. (600 U/ml), 5 mg Dispase II (0,5 U/ml) und 50 μl DNase I (100 μg/ml) in 5 ml RPMI 1640. Dieses Medium vor Gebrauch im Wasserbad auf 37 °C vorwärmen.</li>
		<li>Zellwaschpuffer: 1 % BSA oder 10 % FBS in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, PH 7,4) herstellen und bei 4 °C oder auf Eis aufbewahren.</li>
		<li>Perfusionslösung: PBS (PH 7,4) als Perfusionslösung vorkühlen.</li>
		<li>Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC): Verwenden Sie den Lysepuffer für Erythrozyten, wie vom Hersteller angegeben. HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte.</li>
	</ol></li>
	<li>Euthanasieren Sie die Maus durch eine intraperitoneale Pentobarbital-Natrium-Injektion (150 mg/kg).</li>
	<li>Dissektion des Herzens<ol><li>Bringen Sie die Maus in Rückenlage, indem Sie ihre Hinterbeine mit Klebeband fixieren.</li>
		<li>Besprühen Sie den Körper mit 70%igem Ethanol und schneiden Sie dann senkrecht durch die Bauchhaut und die Muskeln, ohne die Leber zu durchstechen. Öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb und vermeiden Sie dabei eine Punktion des Herzens.</li>
		<li>Verwenden Sie das vorgekühlte PBS (PH 7,4), um den linken Ventrikel zu durchbluten, bis die farblose Perfusionsflüssigkeit beobachtet wird (ca. 15 ml PBS [pH 7,4] werden benötigt).</li>
		<li>Heben Sie das Herz vorsichtig mit einer Pinzette vom Brustkorb ab und schneiden Sie das überschüssige Gewebe, das an der Außenseite des Herzens befestigt ist, mit einer Augenschere ab. Legen Sie das Herz in 1 ml vorgekühltes PBS (PH 7,4) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzymatische Dissoziation des Herzgewebes<ol><li>Übertragen Sie das Mausherz in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 150 μL des auf Eis gelegten Dissoziationspuffers des Herzgewebes und schneiden Sie es mit einer Schere in kleine Stücke (~1 mm).</li>
		<li>Das zerkleinerte Herzgewebe wird mit 5 ml des Gewebedissoziationspuffers in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. HINWEIS: Das empfohlene Puffervolumen für die Dissoziation von Herzgewebe beträgt 5 ml/Herz.</li>
		<li>Legen Sie das Zentrifugenröhrchen für 1 h bei 37 °C in den elektrisch thermostatischen Kolbenschüttler mit 125 U/min. Pipettieren Sie die Gewebesuspension alle 20 Minuten 10 Mal auf und ab.</li>
		<li>Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-μm-Zellsieb, um unverdautes Gewebe und Klumpen zu entfernen. Fügen Sie 25 ml des Zellwaschpuffers hinzu, um das Originalröhrchen zu spülen, und übertragen Sie es dann, um das Zellsieb zu spülen. Als nächstes wird die Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb gefiltert, um Zellklumpen weiter zu entfernen.</li>
		<li>Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie dann die Zellprobe in 1x RBC-Lysepuffer für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
		<li>Fügen Sie viermal mehr Volumen des Zellwaschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml des Zellwaschpuffers. Bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml des Zellwaschpuffers.</li>
		<li>Mischen Sie 18 μl der Zellsuspension mit 2 μl Acridinorange (AO)/Propidiumiodid (PI)-Färbelösung (9:1) und geben Sie 10 μl der Mischung in einen Objektträger der Zählkammer. Bewerten Sie die Zellzahlen und die Viabilität mit einem automatischen Zellzähler.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute myocardial infarction.</a> Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incident+heart+failure+in+patients+with+coronary+artery+disease+undergoing+percutaneous+coronary+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727(2021).</li>
<li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+in+myocardial+injury%2C+repair%2C+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling.</a> Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).</li>
<li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+revisited%3A+Inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444(2014).</li>
<li>Tzahor, E., Dimmeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coalition+to+heal-the+impact+of+the+cardiac+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment.</a> Science. 377 (6610), 4443(2022).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Massaia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gene+expression+to+understand+the+dynamic+architecture+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167(2018).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+the+temporal+diversity+and+dynamics+of+cardiac+immunity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction.</a> Small Methods. 6 (3), 2100752(2022).</li>
<li>Tombor, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+reveals+endothelial+plasticity+with+transient+mesenchymal+activation+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction.</a> Nature Communications. 12 (1), 681(2021).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2581(2011).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).</li>
<li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+the+healthy+and+diseased+heart+reveals+cytoskeleton-associated+protein+4+as+a+new+modulator+of+fibroblasts+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Garcia-Flores, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from the human placenta.</a> Nature Protocols. , (2022).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+dissect+the+immunological+network+of+autoimmune+myocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis.</a> Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14, 935-936 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Ziel dieses Artikels war es, ein Protokoll zur Isolierung einzelner Nicht-Kardiomyozyten aus Mäuseherzen nach Myokardinfarkt zu beschreiben. Das Protokoll kann angewendet werden, um verschiedene Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung mit hoher Qualität zu isolieren, darunter Immunzellen, Endothelzellen und Fibroblasten. Drei wesentliche Faktoren sind entscheidend, um eine qualitativ hochwertige Zellsuspension für die Einzelzellsequenzierung zu erhalten. Die erste ist die Einstellung der enzymatischen Verdauung. Es ist wi...

Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen, deren Sterblichkeit weltweit zunimmt1. Der Myokardinfarkt wird durch eine unzureichende Durchblutung des umgebenden Myokards verursacht, was auf einen Verschluss der Koronararterien zurückzuführen sein kann, der bei einer atherosklerotischen Plaqueruptur auftritt. Obwohl die perkutane Koronarintervention (PCI) die Sterblichkeitsraten von Patienten mit akutem Myokardinfarkt gesenkt hat, bleibt die hohe Prävalenz der Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt ein Problem2. Die wichtigste Pathophysiologie, die der Herzinsuffizienz nach einem Herzinfarkt zugrunde liegt, ist die kompensatorische Reaktion des Körpers auf Herzverletzungen, bei der der abgestorbene Herzmuskel durch nicht-kontraktile fibrotische Narben ersetzt wird. Diese adaptiven Reaktionen beruhen maßgeblich auf lokalen Entzündungen, die durch die Interaktionen zwischen mehreren Zelltypen und Herzgewebezellen vermittelt werden, und diese Entzündung wird nun als potenzielles therapeutisches Ziel angesehen, um die fibrotische Narbenbildung zu reduzieren und somit vor einer Herzinsuffizienz nach einem Myokardinfarkt zu schützen 3,4. Interessanterweise erfährt die Mikroumgebung an der Infarktstelle einen zeitabhängigen Übergang der infiltrierenden Zelltypen und -funktionen in verschiedenen Stadien von MI 1,5. Viele Studien haben gezeigt, dass Nicht-Kardiomyozyten (z. B. Immunzellen, Fibroblasten und Endothelzellen) eine zentrale Rolle bei der Entzündung nach einem Myokardinfarkt und der Gewebereparatur spielen 5,6. In den letzten Jahren wurde die Einzelzellsequenzierung in großem Umfang als leistungsfähiges Werkzeug zur Aufklärung der Beteiligung und Funktion von Nicht-Kardiomyozyten in der Mikroumgebung nach einem Myokardinfarkteingesetzt 7,8. Dies gibt Einblicke in die Pathophysiologie der Post-MI-Verletzung und -Reparatur sowie in die Entwicklung potenzieller Therapien gegen die Post-MI-Herzinsuffizienz.
Die Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine Technik, mit der ganze Transkriptome mithilfe von Next-Generation-Sequencing (NGS) sehr detailliert untersucht werden können7,8,9. In jüngster Zeit hat die Entwicklung von scRNA-Seq das biomedizinische Forschungsfeld revolutioniert. Im Vergleich zur konventionellen Massensequenzierung analysiert scRNA-Seq Genexpressionsprofile und transkriptionelle Heterogenität auf Einzelzellebene 7,8. Diese Technik fördert maßgeblich die Erforschung der zellulären Pathophysiologie von MI 9,10, indem sie verschiedene zirkulierende Zelltypen in der Post-MI-Mikroumgebung identifiziert und die Interaktion zwischen Kardiomyozyten und Nicht-Kardiomyozyten aufdeckt. Diese Ergebnisse tragen außerdem dazu bei, neue therapeutische Angriffspunkte für die Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt zu finden. Im Allgemeinen umfasst das scRNA-seq-basierte Post-MI-Experiment drei Hauptabschnitte: (1) die Etablierung eines Post-MI-Tiermodells; (2) die Herstellung der Zellsuspension; und (3) Probensequenzierung und Datenanalyse. Auffällig ist, dass die Herstellung der Zellsuspension der kritischste Schritt bei der Vorbereitung des scRNA-Seq-Experiments ist, da die Qualität der Zellsuspension die Genauigkeit der Ergebnisse bestimmt.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um eine Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension aus dem Herzgewebe nach einem Myokardinfarkt zu extrahieren. Bezeichnenderweise sind die spezifischen Details zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und Auflösung der Zellen enthalten. Inzwischen sind die in diesem Protokoll verwendeten Geräte, wie z. B. chirurgische Kits für Mäuse, Beatmungsgeräte für Nagetiere und Zentrifugen, in den meisten Tierversuchszentren und biomedizinischen Labors zu finden, und daher sind die Versuchskosten für dieses Protokoll relativ gering. Darüber hinaus kann dieses Protokoll unter Berücksichtigung von Zeitpunkten und Infarktorten als Variablen angewendet werden, um eine Vielzahl von klinischen Szenarien zu simulieren, insbesondere für die Komplikationen nach dem Myokardinfarkt.

<table><tbody><tr><td>Acridinorange / Propidiumiodid Fleck</td><td>Logos biosystems</td><td>F23001</td><td></td></tr><tr><td>Automatisiert&nbsp; Zelle&nbsp; Zähler</td><td>Logos biosystems</td><td>L20001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Servicebio</td><td>G5001</td><td>Zytoprotektive Wirkung</td></tr><tr><td>Zellzählung Objektträger</td><td>Logos biosystems</td><td>L12001</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td>Verdauungsenzyme</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td>Verdauungsenzyme</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>Verhindern Sie das Verklumpen</td></tr><tr><td>der Zellen Falcon&nbsp; 40 Mio. Jahre m Zellsieb</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>Zellklumpen entfernen</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; 70 Mio. Jahre m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Entfernen Sie unverdautes Gewebe und Klumpen</td></tr><tr><td>Flow Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>OU QING SI</td><td></td><td></td></tr> 10054963976859 <tr><td>Nadelhalter</td><td>FST</td><td>12061-01</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Pinzette</td><td>RWD</td><td>F14012-10</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic Scerns</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Servicebio</td><td>G4202-500ML</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysepuffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702-120ml</td><td>Rote Blutkörperchen entfernen</td></tr><tr><td>Rippenretraktor</td><td>FST</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Nagetierbeatmungsgerät</td><td>Harvard</td><td>730043</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Lösungsmittel&nbsp; Lösung des Enzyms</td></tr><tr><td>Sterile Schere</td><td>RWD</td><td>S14014-10</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung einer nicht-kardiomyozyten-zellsuspension für die einzelzell-rna-sequenzierung aus einem erwachsenen mausherzen nach myokardinfarkt

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Der Myokardinfarkt (MI) ist eine der häufigsten Herz-Kreislauf-Erkrankungen mit weltweit steigender Sterblichkeit. Nicht-Kardiomyozyten machen mehr als die Hälfte der gesamten Herzzellpopulation aus und tragen zur adaptiven Kompensation von Myokardverletzungen bei, einschließlich Entzündungsreaktionen, Gewebereparatur und Narbenbildung. Um die kardiale Mikroumgebung nach einem MI zu untersuchen, wird die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) häufig verwendet, um verschiedene Herzzelltypen und interzelluläre Kommunikation zu identifizieren. Unter den Verfahren der scRNA-seq-Probenvorbereitung ist die Herstellung der Zellsuspension einer der kritischsten Schritte, da die Zellviabilität die Qualität der scRNA-seq-Ergebnisse beeinflussen kann. Daher haben wir ein experimentelles Protokoll zur Herstellung einer nicht-kardiomyozytenartigen Zellsuspension aus Mäuseherzen nach einem Myokardinfarkt entwickelt, wobei der Schwerpunkt auf der Verbesserung der Zelllebensfähigkeit durch die Auswahl milder Verdauungsenzyme, die Kontrolle der Verdauungszeit und die Anwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) liegt. Schließlich isolierten wir CD45+ -Zellen aus der durch dieses Protokoll erhaltenen Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension und führten dann scRNA-seq durch.

Eine einzellige Suspension mit hoher Vitalität wurde durch die Umsetzung von Abschnitt 2 dieses Protokolls erhalten. Es konnten jedoch noch Zellfragmente beobachtet werden (Abbildung 1A); Daher wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) durchgeführt, um die Qualität weiter zu verbessern16. Nach FACS verringert sich die durchschnittliche Zellgröße von 9,6 μm auf 9,1 μm (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass der Anteil der Zellfragmente in ...

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung einer ausreichenden Anzahl einzelner nicht-kardiomyozyten mit hoher Viabilität aus einem Mausherzen nach einem Myokardinfarkt (MI). Dies kann für die anschließende Einzelzellsequenzierung, Durchflusszytometrie-Analyse und primäre Zellkultur verwendet werden.

Herstellung einer Nicht-Kardiomyozyten-Zellsuspension für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus einem erwachsenen Mausherzen nach Myokardinfarkt

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Unser Protokoll gewährleistet sowohl die Zellviabilität als auch die Isolationseffizienz von Einzelzellsuspensionen zu relativ geringen Kosten. Die relativ geringen Kosten und Anforderungen an die Laborausstattung sind die Hauptvorteile dieser Technik. Die Einzelzellsequenzierung zeigt die Heterogenität von Nicht-Kardiomyozyten in der kardialen Pathophysiologie auf und liefert auch Ideen für grundlegende und klinische Studien zu Herzerkrankungen.Dieses Protokoll kann in diesen Studien über das kardiovaskuläre Milieu nach einem Myokardinfarkt, wie z. B. die Beteiligung von Immunzellen, verwendet werden. Bei der erstmaligen Zubereitung schlage ich vor, besonders auf das Pepsin der Probe und die Verdauungszeit zu achten. Sobald die Puffer und Lösungen wie im Manuskript beschrieben vorbereitet sind, legen Sie eine euthanasierte Maus, die zwei Wochen zuvor einen Myokardinfarkt erlitten hatte, in Rückenlage auf den Operationstisch.Fixieren Sie die Hinterbeine mit Klebeband. Um das Herz zu entfernen, besprühen Sie den Körper mit 70%igem Ethanol. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Bauchhaut und die Muskeln, während Sie die Leber aussparen.Ohne das Herz zu punktieren, öffnen Sie vorsichtig den Brustkorb und füllen Sie die linke Herzkammer mit vorgekühlter PBS-Lösung, bis die Perfusionsflüssigkeit farblos läuft. Heben Sie das Herz mit einer Pinzette sanft an und schneiden Sie das überschüssige Gewebe, das an seiner Außenseite befestigt ist, mit einer Augenschere ab. Legen Sie das Herz in einen Milliliter vorgekühltes PBS in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Übertragen Sie das Herz in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die auf Eis gestellt wird. Pipettieren Sie 150 Mikroliter des kardialen Dissoziationspuffers in die Vertiefung und schneiden Sie das Herz mit einer Schere in einen Millimeter große Stücke. Das gehackte Herzgewebe wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt, das fünf Milliliter des Gewebedissoziationspuffers enthält.Legen Sie das Röhrchen in einen thermostatischen Schüttler. Pipettieren Sie die Aufhängung alle 20 Minuten 10 Mal auf und ab. Um Klumpen und unverdautes Gewebe zu entfernen, filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb mit 25 Millilitern Zellwaschpuffer.Spülen Sie das Zentrifugenröhrchen und das Zellensieb aus. Als nächstes filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, um weitere Zellklumpen zu entfernen. Die filtrierte Zellsuspension wird bei 300 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.Resuspendieren Sie die Zellprobe in fünf Volumina Erythrozytenlysepuffer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie nun vier Volumina des Zellwaschpuffers in Zellsuspension hinzu und zentrifugieren Sie, wie zuvor gezeigt. Nach dem Entsorgen des Überstandes werden die Zellen in 10 Milliliter des Zellwaschpuffers resuspendiert und erneut zentrifugiert.Am Ende der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in einem Milliliter Zellwaschpuffer resuspendiert. Nehmen Sie 18 Mikroliter der Suspension in ein anderes Zentrifugenröhrchen und fügen Sie zwei Mikroliter Acridin-Orangen-Propidiumiodid-Färbelösung hinzu. Geben Sie 10 Mikroliter dieser gefärbten Lösung in einen Objektträger der Zählkammer.Bewerten Sie die Zellzahlen und die Viabilität mit einem automatischen Zellzähler. Zellfragmente wurden in der einzelligen kardialen Suspension beobachtet. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung reduzierte effektiv den Anteil der Zellfragmente und die Zellverklumpung, was zu einer verringerten durchschnittlichen Zellgröße führte.Die RNA-Sequenzierung bewies eine offensichtliche Trennung von sieben Arten von Immunzellen, was durch das unüberwachte Clustering und die reduzierte T-verteilte stochastische Einbettung von Nachbarn gezeigt wurde. Jede Immunzelle zeigte eine hohe Expression klassischer Marker. Das Herzgewebe muss klein genug geschnitten werden, um eine unvollständige Verdauung zu vermeiden, die zu vielen Zellklumpen in der Zellsuspension führt.Die durch dieses Protokoll erhaltene Einzelzellsuspension kann in der Flussanalyse von primären Zellkulturen weiter angewendet werden. Dieses Protokoll kommt den Studien über die Mikroumgebung der Myokardinfektion zugute, die den Forschern helfen können, über das Herzgewebe hinauszublicken und die Myokardinfektion als systematisches Problem zu betrachten.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Einzel-Zell-Expression Profiling ermöglicht die detaillierte Genexpressionsanalyse einzelner Zellen. Wir beschreiben Methoden zur Isolierung von Kardiomyozyten, und die Vorbereitung der daraus resultierenden Lysate entweder für ganze Transkriptom-Mikroarray oder qPCR der spezifischen Ziele.

Single Cell Transcriptional Profiling der erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

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Um die Zellteilung von Zellzyklusvariationen in Kardiomyozyten zu unterscheiden, präsentieren wir Protokolle mit zwei transgenen Mauslinien: Myh6-H2B-mCh-transgene Mäuse, zur eindeutigen Identifizierung von Kardiomyozytenkernen, und CAG-eGFP-Anillin-Mäuse, zur Unterscheidung der Zellteilung von Zellzyklusvariationen.

Visualisierung von Zellzyklus-Variationen und Bestimmung der Nukleation in postnatale Kardiomyozyten

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um verschiedene Teilmengen von Makrophagen und anderen nicht-immunen Zellen aus menschlichem und Mausmyokard zu isolieren, indem eine einzelzellige Suspension durch enzymatische Verdauung vorbereitet wird. Gating-Schemata für die Strömungszytometrie basierende Identifizierung und Charakterisierung isolierter Makrophagen werden ebenfalls vorgestellt.

Isolierung von Makrophagen-Teilmengen und Stromalzellen von Menschlichen und Maus-Myokardproben

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Wir entwickelten eine einfacheMethode zur Isolierung hochwertiger einzelner Mausherzzellen durch die antegrade Perfusionstechnik. Diese Methode ist Langendorff-frei und nützlich zur Isolierung von ventrikulären und vorhofialen Myozyten oder interstitiellen Zellen, wie Herzfibroblasten oder Vorläuferzellen.

Eine antegrade Perfusionsmethode zur Kardiomyozytenisolation von Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Präparation von Zellkernen beschreibt. Nach Mikrodissektion und enzymatischer Dissoziation von Herzgewebe in Einzelzellen wurden die Vorläuferzellen eingefroren, gefolgt von der Isolierung von reinen lebensfähigen Zellen, die für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung und den Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsanalysen verwendet wurden.

Zellkernisolierung aus kardialen Vorläuferzellen der Maus für die Erstellung von Epigenom- und Genexpressionsprofilen mit Einzelzellauflösung

Hier beschreiben wir ein zweistufiges Zellverdauungsprotokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension von Maus-Halsschlagadern.

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Lernen Sie die Isolierung lebensfähiger Nicht-Kardiomyozyten aus postinfarktigen Mäuseherzen für Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht Studien zur zellulären Heterogenität in der kardiovaskulären Pathophysiologie.

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