Name: Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Synthese zyklischer zellpenetrierender Peptide mit aromatischen Quervernetzungen zur Verbesserung der Hydrophobizität und Permeabilität biologischer Barrieren. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Arzneistoffabgabe an Tumorzellen ohne Metallkatalysatoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wird von der Natural Science Foundation of China (21708031), der China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075) unterstützt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung
Anmerkungen: Führen Sie alle Vorgänge in einem Betriebsabzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.
<ol><li>Montieren Sie die manuelle Peptidsynthesevorrichtung im Abzug (Abbildung 1). Setzen Sie die Dreiwegehähne (siehe Materialtabelle) auf den Vakuumverteiler (siehe Materialtabelle) und schließen Sie sie an den Stickstoff (N2) an. Stellen Sie sicher, dass Sie die ungenutzten Einlässe verschließen.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 10-ml-Polypropylensäule (siehe Materialtabelle) an den Dreiwegehähnen. Lassen Sie das Reaktionsgemisch oder die Lösungsmittel mit einem Gummipipettenkolben oder einem Vakuum über einen Abfallabscheider aus der Polypropylensäule ab.</li>
</ol>2. Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid (FITC-R8) und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid (FITC-sR8-4)
HINWEIS: Die Peptide wurden gemäß einem Standardprotokoll der Fmoc-basierten Festphasenpeptidsynthese (SPPS) synthetisiert25. Das 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA-Harz (Rink-Amid-MBHA-Harz, siehe Materialtabelle) wurde während der gesamten Studie verwendet.
VORSICHT: N, N-Dimethylformamid (DMF), N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA), Morpholin und Dichlormethan (DCM) sind alle farblos und schädlich, wenn sie eingeatmet oder über die Haut aufgenommen werden. Äther ist hochentzündlich. 1,2-Ethanedithiol (EDT) ist eine besonders geruchsintensive Substanz. Trifluoressigsäure (TFA) ist stark korrosiv und ihr Säuregehalt ist 10 bis5 Mal so hoch wie der von Essigsäure. Folglich sollten alle Reagenzien und Chemikalien mit Schutzausrüstung in einem Abzug behandelt werden.
<ol><li>Bereiten Sie das Harz für die Peptidsynthese vor.<ol><li>Berechnen Sie die für die Synthese benötigte Harzmasse:Masse des Harzes (mg) = Zunder (mmol) / Harzbeladungskapazität (mmol/g) × 1.000 (mg/g) HINWEIS: Zum Beispiel die Masse des Eisbahnamid-MBHA-Harzes (0,572 mmol/g) für 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol/g × 1.000 mg/g = 350 mg.</li>
		<li>Fügen Sie 4-5 ml DMF zur erforderlichen Menge Harz hinzu und geben Sie es in die 10-ml-Polypropylensäule (Schritt 1.2), wobei N2 30 Minuten lang sanft sprudelt, um das Harz ausreichend aufzuquellen, und lassen Sie dann das ZMS ab.</li>
		<li>Fügen Sie dem Harz 4-5 ml 50% Morpholin/DMF (v/v) hinzu, blasen Sie N2 30 Minuten lang 2x lang sanft auf, um die N-terminale Fmoc-Gruppe zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann abtropfen. Waschen Sie das Harz anschließend 3x gründlich, indem Sie 4-5 ml DMF in die Säule geben und jedes Mal mindestens 1 Minute lang mit N2 sprudeln. Waschen Sie das Harz weiterhin mit DCM (3x) und DMF (3x) auf die gleiche Weise.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Fmoc-geschützte Aminosäurekopplung wie unten beschrieben durch. HINWEIS: Die Kopplung von Arginin in einer manuellen Synthese im 0,2-mmol-Maßstab wird hier als Beispiel beschrieben.<ol><li>Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5-Äquiv., 648,8 mg) und 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-Tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU, 4,9 Äquivalent, 372,6 mg) in 5 ml DMF in einem Zentrifugenröhrchen lösen.</li>
		<li>Zur Aktivierung der Kupplungsreaktion wird DIPEA (entspricht 10, 348,4 μl) zugegeben und dann das Reaktionsgemisch mit Harz in die 10-ml-Polypropylensäule überführt (hergestellt in Schritt 2.1.3). Dann rühren Sie die Mischung vorsichtig mitN2-Sprudel für 1-2 h.</li>
		<li>Die Kupplungsreaktion (Schritt 2.2.1 und Schritt 2.2.2) einmal wiederholen.</li>
		<li>Nach Abschluss der Kopplung das Reaktionsgemisch abtropfen lassen und das Harz nacheinander mit DMF, DCM und DMF jeweils 3x für jeweils mindestens 1 min waschen.</li>
		<li>Führen Sie die Kopplung jeder Aminosäure in geordneten Schritten durch: Fügen Sie dem Harz 4-5 ml 50% Morpholin/DMF (v/v) hinzu, sprudeln Sie 30 Minuten lang 2x vorsichtig mitN2, um die N α-Fmoc-Gruppe zu entfernen, waschen Sie dann das Harz (wie in Schritt 2.2.4 gezeigt) und fahren Sie mit der Kopplung der nächsten Aminosäure fort (wie in Schritt 2.2.1 und Schritt 2.2.2 gezeigt). Fahren Sie mit mehreren Zyklen dieses Schritts fort, um die Synthese des gewünschten Peptids zu erreichen. HINWEIS: Dieser Vorgang kann hier pausiert werden. Kondensieren Sie das Harz mit Methanol und trocknen Sie das Harz mit einem kontinuierlichen Fluss von N2. Verschließen Sie die Polypropylensäule und lagern Sie das Harz dann einige Tage bei 4 °C (oder bei −20 °C bei längerer Lagerung). Quellt das Harz mit 4-5 ml DMF für 0,5-1 h auf, bevor eine neue Synthese beginnt. Wenn Sie direkt mit dem nächsten Schritt fortfahren, ist es nicht erforderlich, das Harz zu kondensieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Markieren Sie die Peptide wie unten beschrieben mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC).<ol><li>Koppeln Sie das Beta-Alanin als Abstandshalter für die FITC-Markierung mit dem gleichen Verfahren wie bei der Aminosäurekopplung in Schritt 2.2.</li>
		<li>Führen Sie eine FITC-Markierung von Peptiden auf dem Harz durch, indem Sie eine Mischung aus FITC (5 Äquiv.), DIPEA (10 Äquiv.) und DMF in die Polypropylensäule geben und 8 Stunden lang im Dunkeln reagieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Für die Synthese von FITC-sR8-4 wird die Cyclisierung des linearen Peptids wie unten beschrieben durchgeführt.<ol><li>Geben Sie eine Mischung aus TFA/Triisopropylsilan (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) für 2 Minuten in die Polypropylensäule, um die Cys (Trt)-Schutzgruppe selektiv zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann ab. Wiederholen Sie den obigen Vorgang, bis die gelbliche Lösung farblos wird, um die Trt-Schutzgruppe vollständig zu entfernen.</li>
		<li>Führen Sie anschließend mindestens 3x sequentielle Waschvorgänge des Harzes mit DMF und DCM durch. Danach 4,4'-Bis(brommethyl)biphenyl (2 Äquiv.) in DMF mit DIPEA (4 Äquiv.) lösen, in die Säule geben und 4 h reagieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Spalten Sie die Peptide wie beschrieben: Waschen Sie das Harz nach Abschluss der Peptidsynthese zweimal zweimal für 5 min mit 4-5 mL Methanol und trocknen Sie es mit einem kontinuierlichen Fluss von N2. Behandeln Sie das Harz mit einem wirksamen Spaltcocktail TFA/TIS/H 2 O (95/2,5/2,5, v/v/v) oder TFA/TIS/EDT/H 2 O (92,5/2,5/2,5/2,5, v/v/v/v) für Cysteinhaltige Peptide, wobei Sie etwa 1 ml Spaltcocktail pro 100 mg Harz verwenden. Behandeln Sie das peptidgebundene Harz 2-3 h lang, um das Peptid zu spalten, und entfernen Sie dann das TFA vorsichtig mit einem Strom vonN2.</li>
	<li>Um die rohen Peptide zu erhalten, werden 4-5 ml Diethylether in die gespaltene Peptidzubereitung gegeben, um die rohen Peptide auszufällen, und bei 10.000 × g für 4 min zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie das Peptid 3 Minuten lang in einem wirksamen Abzug an der Luft trocknen.</li>
	<li>Analyse der Peptide: Lösen Sie ein rohes Peptid in kleinem Maßstab (gespalten aus ca. 10 mg peptidgebundenem Harz) in 800 μl Acetonitril (ACN)/H2O (1/1, v/v) und analysieren Sie es anschließend mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Aufreinigung der Peptide mittels RP-HPLC und LC-MS.<ol><li>Lösen Sie 50 mg Rohpeptidprodukt in 4 ml ACN/H2O(1/1, v/v) auf und injizieren Sie die Lösung in ein RP-HPLC-System, das mit einer C18-Säule ausgestattet ist (4,6 mm x 150 mm, Porengröße: 120 Å, Partikelgröße: 4 μm; siehe Materialtabelle). Das Peptid wird mit einer mobilen Phase eluiert, die 0,1 % TFA/H2O (v/v) und ACN enthält, mit einem Gradienten von 10 % bis 90 % ACN über 30 Minuten. Konventionelle Peptide wurden bei 220 nm und FITC-markierte Peptide bei 494 nm detektiert.</li>
		<li>Sammeln Sie die Fraktionen, die dem Hauptpeptidpeak entsprechen, wie er durch MS identifiziert wurde, und lyophilisieren Sie dann die gewünschten Peptidfraktionen. Lagern Sie das gereinigte Peptid bei −20 °C. HINWEIS: Die gefundenen m/z des gereinigten FITC-R8 lauten wie folgt: [M + 3 H]3+: 576,63; [M + 4 H] 4+: 432,72; [M + 5 H] 5+: 346,39; [M + 6 H] 6+: 288,85. Die gefundenen m/z des gereinigten FITC-sR8-4 lauten wie folgt: [M + 3 H]3+: 704.74; [M + 4 H] 4+: 528,77; [M + 5 H] 5+: 423,34; [M + 6 H] 6+: 352,91. MS-Analysebedingungen: Instrument: ESI (Sondenvorspannung: +4,5 kV; Detektor: 1,2 kV); Gasdurchfluss des Verneblers: 1,5 l/min; gekrümmte Desolvationslinie (CDL): −20 V; CDL-Temperatur: 250 °C; Blocktemperatur: 400 °C; Flussrate: 0,2 ml/min; mobile Phase: 50 % H2O/50 % ACN.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Quantifizierung der FITC-markierten Peptide
<ol><li>Lösen Sie eine kleine Menge des gereinigten Peptids in DMSO als Stammlösung (z. B. 40 μmol/ml).</li>
	<li>Messen Sie die Absorption bei 494 nm (A 494) von 2 μl der Stammlösung in498 μl 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS, pH 7,4) mit einer Mikrotiterplatte (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Multitechnologie-Mikroplatten-Readers (siehe Materialtabelle). Der Verdünnungsfaktor beträgt 500 μL/ 2 μL = 250, und die Weglänge der Mikrotiterplatte beträgt 0,5 mm.</li>
	<li>Berechnen Sie die Konzentration der Stammlösung mit der folgenden Formel: Konzentration (mM) = A494 × Verdünnungsfaktor / 0,05 (cm) / 77.000 (cm−1· M−1) × 1.000 (mM·M−1)</li>
	<li>Stellen Sie eine angemessene Verdünnung ein, so dass der gemessene A494-Wert zwischen 0,1 und 1,0 liegt. Anmerkungen: Die Messungen sollten mehrmals wiederholt werden, um sicherzustellen, dass die gemessene Konzentration genau ist. Der Extinktionskoeffizient von 77.000 cm−1· M−1 geht aus der FITC-Gruppe hervor.</li>
</ol>4. Stabilität von Peptiden im fötalen Kälberserum (FBS)
<ol><li>Inkubieren Sie das Peptid in einer Konzentration von 100 μM mit 250 μL 25% FBS/H2O(v/v) bei 37 °C. Nach einer Inkubationszeit von 0 h, 1 h, 2 h und 4 h werden 10 μl Aliquots entnommen und dann 150 μl 12%ige Trichloressigsäure, gelöst inH2O/ACN (1/3, v/v), hinzugefügt, um die Serumproteine auszufällen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 × g für 5 min und analysieren Sie den Überstand mittels HPLC (wie in Schritt 2.8 beschrieben), um das Ausmaß des Peptidabbaus zu bestimmen.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis der Peakfläche bei 1 h, 2 h und 4 h zu dem bei 0 h, um den Anteil des nicht abgebauten Peptids zum entsprechenden Zeitpunkt zu erhalten. Das Ergebnis ist der Durchschnitt von drei parallelen Stichproben.</li>
</ol>5. Zelluläre Aufnahme der Peptide
<ol><li>Fluoreszenzmikroskopische Bildgebung<ol><li>Legen Sie ein rundes Deckglas in eine 12-Well-Platte. Dann 1 x 105 Zellen gleichmäßig auf Deckgläser beimpfen und über Nacht mit 2 ml Medium kultivieren. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS. HINWEIS: In dieser Studie wurden HeLa-Zellen und 4T1-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, siehe Materialtabelle) kultiviert, das mit 10 % FBS in einem bei 37 °C befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 ergänzt wurde.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml 3 μM FITC-markierten Peptiden in FBS-freiem DMEM für 1 h bei 37 °C. Entfernen Sie anschließend das peptidhaltige Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS.</li>
		<li>Die Zellen mit 1 ml Hoechst 33258 für 15 min anfärben. Beobachten Sie die Internalisierung jedes Peptids mit einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) mit der gleichen Fluoreszenzintensität und Belichtungszeit. HINWEIS: Die folgenden Einstellungen wurden für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Objektiv: Plan-Apochromat: 63 x/1,40 Öl DIC M27; Kanal 1 für FITC: Anregungsfilter: 450-490 nm, Emissionsfilter: 500-550 nm, Belichtungszeit: 230 ms; Kanal 2 für Hoechst 33258: Anregungsfilter: 335-383 nm, Emissionsfilter: 420-470 nm, Belichtungszeit: 27 ms.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchflusszytometrische Analyse<ol><li>5 x 105 HeLa-Zellen gleichmäßig in 12-Well-Platten beimpfen und 24 h bei 37 °C in DMEM kultivieren. Entfernen Sie anschließend das Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml 3 μM FITC-markierten Peptiden in FBS-freiem DMEM für 1 h bei 37 °C. Entfernen Sie das peptidhaltige Medium, dissoziieren Sie die Zellen mit 0,25 % (w/v) Trypsin und 0,53 mM EDTA in PBS für 5 min und sammeln Sie die Zellen dann durch Zentrifugation bei 306 × g für 4 min. Waschen Sie das Zellpellet mit PBS.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml 0,05 % (w/v) Trypanblau in PBS für 3 Minuten, um die oberflächengebundene Fluoreszenz zu löschen, und führen Sie eine quantitative Analyse der intrazellulären Fluoreszenz mit einem Durchflusszytometer durch (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Durchflusszytometrie-Einstellungen: Anregung: 488 nm, Emission: 530 nm. Trypanblau kann auch die Fluoreszenz abgestorbener Zellen unterdrücken und bei der Analyse der Peptidaufnahme helfen, lebende und tote Zellen zu unterscheiden.</li>
		<li>Behandlung und Analyse von 4T1-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach dem gleichen Protokoll wie bei HeLa-Zellen. Sammeln Sie 5 x 105 Zellen pro Probe und stellen Sie drei parallele Proben pro Gruppe auf.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Untersuchung der Zell-zu-Zell-Penetration der Peptide mit Hilfe von Transwell-Modellen
<ol><li>Inokulieren Sie 1 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM in einer 12-Well-Kammer mit einem Gewebekulturplatteneinsatz (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 24 h lang in einem bei 37 °C befeuchteten Inkubator mit5 % CO2. Anschließend wird das Medium entnommen und die Zellen in den Kammern mit 1 mL 10 μM FITC-R8 oder FITC-sR8-4 (mittels HPLC gereinigt) in FBS-freiem DMEM für 1 h inkubiert.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium, das die Peptide enthält, und waschen Sie die Zellen 3x mit 1 ml PBS. Geben Sie 1 ml frisches FBS-freies DMEM in die Kammern und inkubieren Sie dann die HeLa-Zellen in der Kammer mit der Gewebekulturplatte für 2 h mit den HeLa-Zellen auf den runden Deckgläsern am Boden.</li>
	<li>Fixieren Sie die HeLa-Zellen mit 2,5 % Glutaraldehyd für 15 min auf den runden Deckgläsern und färben Sie die Zellen dann 15 min lang mit DAPI an. Beobachten Sie dann die HeLa-Zellen auf den Deckgläsern unter einem Fluoreszenzmikroskop. Behandeln und untersuchen Sie 4T1-Zellen mit dem gleichen Protokoll wie HeLa-Zellen.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly%28mannitol-co-PEI%29+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li>
<li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+paclitaxel+delivery+facilitated+by+a+dual-functional+CPP+with+a+hydrophobic+hairpin+tail%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).</li>
<li>Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+on+drug+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A view on drug resistance in cancer.</a> Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+in+situ+self-assembly+of+polymer-peptide+conjugates+that+attack+solid+tumors+deeply%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply.</a> Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).</li>
<li>Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nanoparticle+design+for+overcoming+biological+barriers+to+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).</li>
<li>Tian, Y., Zhou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cell-penetrating+peptides+and+their+functionalization+of+polymeric+nanoplatforms+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+Classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Turner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+%28PNA%29+as+inhibitors+of+HIV-1+Tat-dependent+trans-activation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).</li>
<li>Tunnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+short+cell-penetrating+peptides+for+enhanced+tumor+cell-and-tissue+dual-penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration.</a> Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).</li>
<li>Komin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+for+transcellular+cargo+delivery%3A+Structure-function+relationship+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action.</a> Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).</li>
<li>Dietrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+permeable+stapled+peptide+inhibitor+of+Wnt+signaling+that+targets+%CE%B2-catenin+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions.</a> Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stapling+of+unprotected+helical+peptides+via+photo-induced+intramolecular+thiol-yne+hydrothiolation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation.</a> Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).</li>
<li>De Araujo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+%CE%B1-helicity+of+cyclic+pentapeptides+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).</li>
<li>Chu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+cell+penetration+by+stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">Towards understanding cell penetration by stapled peptides.</a> Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).</li>
<li>Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+in+shape%3A+Controlling+peptide+bioactivity+and+bioavailability+using+conformational+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints.</a> ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stapling+architecture+on+physiochemical+properties+and+cell+permeability+of+stapled+%CE%B1-helical+peptides%3A+A+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study.</a> ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).</li>
<li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+An+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li>
<li>Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+short+%CE%B1-helices+stabilized+by+the+hydrogen+bond+surrogate+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach.</a> Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).</li>
<li>Baek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+stapled+p53+peptide+bound+to+Mdm2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).</li>
<li>Traboulsi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrocyclic+cell+penetrating+peptides%3A+A+study+of+structure-penetration+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proline-derived+transannular+N-cap+for+nucleation+of+short+%CE%B1-helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides.</a> Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).</li>
<li>Muppidi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+proteolytically+stable%2C+cell-permeable+peptide-based+selective+Mcl-1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).</li>
<li>Wiradharma, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cationic+amphiphilic+%CE%B1-helical+peptides+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents.</a> Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).</li>
<li>Jones, A. T., Sayers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+Tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die chemische Stabilisierung von Peptiden unter Einbeziehung von Konformationsbeschränkungen hat sich als effektive Strategie zur Verbesserung der Stabilität und Zellpermeabilität des Peptids26 erwiesen. In diesem Protokoll wird ein schrittweises Vorgehen für die Synthese zyklischer CPPs mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg beschrieben. Im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Quervernetzungen22,27</...

In den letzten Jahrzehnten gab es rasante Fortschritte bei der Entwicklung von zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) für die Verabreichung von Medikamenten. CPPs werden häufig als molekulare Transporter zur Behandlung einer Reihe von lebensbedrohlichen Krankheiten eingesetzt, darunter neurologische Erkrankungen1,2, Herzerkrankungen3, Diabetes4, Dermatose5 und Krebs 6,7. Krebs ist nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung, die mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsrate einhergeht, trotz breit angelegter Forschungsbemühungen8. Ein ernsthaftes Hindernis für die Behandlung von Krebs ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren wie der kompakten extrazellulären Matrix (EZM), abnormen Tumorgefäßen, multiplen Membranbarrieren und hohem interstitiellen Flüssigkeitsdruck (IFP)9. Daher wird die Entwicklung neuartiger CPPs mit überlegener Fähigkeit, Ladungen über biologische Barrieren hinweg zu transportieren, als eine wesentliche Strategie für die Krebsbehandlung angesehen10,11.
CPPs können hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften in kationische, amphipathische und hydrophobe CPPs eingeteilt werden12. Unter diesen sind das positiv geladene HIV-TAT-Peptid und das synthetische Polyarginin von erheblicher Bedeutung in der biomedizinischen Forschung und wurden ausgiebig untersucht, um die intrazelluläre Wirkstoffverabreichung zu erleichtern13. Tunnemann et al. berichteten, dass eine Mindestlänge von acht Argininen für eine effiziente Zellpenetration der synthetischen Polyarginin-Peptide unerlässlich ist, basierend auf einer Zellpermeabilitätsstudie, die mit R3- bis R12-Peptiden durchgeführt wurde14. Diese CPPs haben jedoch aufgrund ihrer schnellen Hydrolyse in vivo in der Regel kurze Plasmahalbwertszeiten. Darüber hinaus ist wenig über die Optimierung der chemischen Struktur von CPPs bekannt, um ihre Transbarrierefähigkeit zu erhöhen, da es schwierig ist, mehrere Zellmembranen zu durchdringen15. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu durchdringen, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Im Jahr 2020 entdeckten Komin et al.16 ein CPP namens CL-Peptid, das ein Helix-Motiv (RLLRLLR) und einen Polyarginin-Schwanz (R7) zur Durchquerung der Epithel-Monoschicht enthält. Eine Reihe von CL-Peptidvarianten wurde ebenfalls synthetisiert, indem das helikale Muster verändert wurde. Diese Erkundung könnte ein wichtiger Leitfaden für die Entwicklung neuartiger CPPs für die Lieferung von Ladungen über biologische Barrieren hinweg sein. Darüber hinaus optimierten Dietrich et al. die Zellpermeabilität des StAX-Peptids, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg hemmten, indem sie die Gesamthydrophobie der Peptide erhöhten17.
Die Konformationsrestriktion von unstrukturierten linearen Peptiden durch Cyclisierung ist ein effektiver Weg, um ihre proteolytische Stabilität und Permeabilität zu verbessern18,19,20. Die strukturelle Verstärkung erhöht die Proteaseresistenz zyklischer Peptide und macht sie in vivo im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken stabiler. Darüber hinaus kann die Cyclisierung von Peptiden potenziell das polare Peptidrückgrat maskieren, indem sie intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen fördert und so die Membranpermeabilität der Peptide21 erhöht. In den letzten zwei Jahrzehnten haben sich chemoselektive Cyclisierungsmethoden zu effektiven Strategien für die Konstruktion zyklischer Peptide mit unterschiedlichen Architekturen entwickelt, wie z. B. reiner Kohlenwasserstoff, Lactam, Triazol, m-Xylol, Perfluoraryl und anderen Querverbindungen22,23. Die biologische Barriere, die durch die ausgeklügelte Tumormikroumgebung auferlegt wird, könnte das Eindringen von Medikamenten in solide Tumore verringern24. Wir haben bereits festgestellt, dass die zyklischen CPPs eine überlegene Resistenz gegen enzymatische Verdauung aufwiesen als ihre linearen Gegenstücke20. Darüber hinaus ist die Gesamthydrophobie der Peptide entscheidend für ihre verbesserte Zellpermeabilität22. Basierend auf den oben diskutierten Studien kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Kombination aus einem positiv geladenen Muster, einer erhöhten Gesamthydrophobie und einer verbesserten Proteolysestabilität die Permeabilität von CPPs über biologische Barrieren hinweg erhöht. In einer kürzlich durchgeführten Studie haben wir zwei zyklische CPPs mit aromatischen Vernetzungen an den Positionen i und i+7 identifiziert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine verbesserte Permeabilität in Tumorzellen und -geweben aufweisen15. In dieser Arbeit werden ein prägnantes Syntheseprotokoll für die Synthese fluoreszenzmarkierter zyklischer CPPs und die wichtigsten Schritte zur Untersuchung ihrer Permeabilität vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Aladdin</td><td>K1722093</td><td>Gestank</td></tr><tr><td>2-(7-Azobenzotriazol)-N,N,N',N'-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU)</td><td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-Bis(brommethyl)biphenyl</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>4T1-Zellen wurden in DMEM-Medium kultiviert, das mit 10 % FBS (Hykllon) in einem 37 > C befeuchteter Inkubator mit 5 % CO2.</td></tr><tr><td>Acetonitril&nbsp;</td><td>Adamas</td><td>1484971</td><td>Toxizität</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Energie</td><td>W330229</td><td>die Haut schädlich</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>entzündliches</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>hautschädlich</td></tr><tr><td>Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrospray Ionisations-Massenspektrometer</td><td>Wasser</td><td>G2-S Tof</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA)</td><td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat-Isomer ( FITC)</td><td>Energy</td><td>E0801812500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&beta; Ala-OH</td><td>Adamas</td><td>51341C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>HeLa-Zellen wurden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS (Hykllon) in einem 37 > C befeuchteter Inkubator mit 5 % CO2.</td></tr><tr><td>Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie</td><td>Agilent Agilent</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Säule</td><td>Agilent</td><td>Poroshell EC-C18 120, 4,6 > 150 mm (Porengröße 120 & Aring;, Partikelgröße 4 &mu; m)</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilisator</td><td>SP Scientific</td><td>Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>Toxizität</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte</td><td>Thermo &mu; Tropfplatte</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>reizend</td></tr><tr><td>Multi-Technologie Mikroplatten-Reader</td><td>Thermo</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamin</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>reizend</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid</td><td>Energie</td><td>B020051</td><td>schädlich für die Haut</td></tr><tr><td>Poly-Prep Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>Polypropylen-Chromatographiesäulen</td></tr><tr><td>Rink Amide MBHA Harz (0,572 mmol/g)</td><td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwege-Absperrhähne</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Einsatz für Gewebekulturplatten</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td><td>ätzende</td></tr><tr><td>Triisopropylsilan</td><td>HEOWNS</td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumverteiler</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

konstruktion zyklischer zellpenetrierender peptide zur verbesserten durchdringung biologischer barrieren

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

Krebs ist eine große Herausforderung für die globale Gesundheit. Die komplexe Mikroumgebung des Tumors schränkt jedoch im Allgemeinen den Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen ein, was zu einem Tumorrezidiv führt. Um die begrenzte Durchdringung biologischer Barrieren zu überwinden, wurden zellpenetrierende Peptide (CPPs) mit ausgezeichneter Membrantranslokationsfähigkeit entdeckt und haben sich als nützliche molekulare Transporter für den Transport verschiedener Frachten in Zellen erwiesen. Konventionelle lineare CPPs weisen jedoch im Allgemeinen eine beeinträchtigte proteolytische Stabilität auf, was ihre Permeabilität über biologische Barrieren hinweg einschränkt. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die biologische Barrieren durchdringen können und eine verbesserte proteolytische Stabilität aufweisen, sehr wünschenswert, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe in biomedizinischen Anwendungen zu fördern. Wir haben zuvor eine Reihe von kurzen zyklischen CPPs mit aromatischen Vernetzungen synthetisiert, die im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken eine überlegene Permeabilität in Krebszellen und -geweben aufwiesen. In dieser Arbeit wird ein prägnantes Protokoll für die Synthese des fluoreszenzmarkierten zyklischen Polyarginin-R8-Peptids und seines linearen Gegenstücks sowie wichtige Schritte zur Untersuchung ihrer Zellpermeabilität beschrieben.

In diesem Protokoll wurde ein Syntheseverfahren vorgestellt, um das lineare Polyarginin R8 in seine cyclische Form zu bringen. Die SPPS wurde manuell mit einer einfachen Apparatur durchgeführt (Abbildung 1). Der detaillierte Syntheseprozess von SPPS ist in Abbildung 2 dargestellt. Kurzzeitig war das Harz ausreichend aufgequollen, gefolgt von der Entschützung der N α-Fmoc-Schutzgruppe. Anschließend wurde die N α-Fmoc-geschützte Aminosä...

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von zyklischen zellpenetrierenden Peptiden mit aromatischen Querverbindungen und die Bewertung ihrer Permeabilität über biologische Barrieren hinweg.

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Cancer has been a grand challenge in global health. However, the complex tumor microenvironment generally limits the access of therapeutics to deeper ...

Ein gravierendes Hindernis für die Krebsbehandlung ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu behandeln, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Der Zweck dieses Verfahrens besteht darin, die zyklischen zellpenetrierenden Peptide für eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration zu synthetisieren.Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Peptidcyclisierung einfach durch Substitutionsreaktionen mit Cystein und Harz erreicht werden kann, ohne dass Metallkatalysatoren erforderlich sind. Der Einbau aromatischer Vernetzungen verbessert die Gesamthydrophobie der Peptide im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Querverbindungen und erhöht dadurch deren Permeabilität. Montieren Sie zunächst die manuelle Peptidsyntheseapparatur im Abzug.Setzen Sie die Dreiwegehähne auf den Vakuumverteiler und schließen Sie sie an Stickstoff an. Stellen Sie sicher, dass Sie die ungenutzten Einlässe verschließen. Befestigen Sie eine 10-Milliliter-Polypropylensäule an den Dreiwegehahnen und lassen Sie das Reaktionsgemisch oder die Lösungsmittel mit einem Gummipipettenkolben oder einem Vakuum über einen Abfallabscheider aus der Polypropylensäule ab.Um das Harz für die Peptidsynthese vorzubereiten, fügen Sie 4 bis 5 Milliliter DMF zur erforderlichen Harzmenge hinzu und überführen Sie es 30 Minuten lang mit sanftem Stickstoffsprudeln in die Polypropylensäule, um das Harz ausreichend aufzuquellen. Lassen Sie das ZMS ab und fügen Sie dem Harz 4 bis 5 Milliliter 50%Morpholin/DMF hinzu. Sprudeln Sie den Stickstoff 30 Minuten lang vorsichtig, um die N-terminale Fmoc-Gruppe zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann abtropfen.Waschen Sie das Harz dreimal gründlich, indem Sie 4 bis 5 Milliliter DMF in die Säule geben und jedes Mal mindestens 1 Minute lang mit Stickstoff sprudeln. Waschen Sie das Harz auf die gleiche Weise dreimal mit Dichlormethan und dreimal mit DMF. Als nächstes werden 648,8 Milligramm Fmoc und PBF-geschütztes Arginin und 372,6 Milligramm HATU in 5 Millilitern DMF in einem Zentrifugenröhrchen gelöst.Fügen Sie 348,4 Mikroliter DIPEA hinzu, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren, und übertragen Sie das Reaktionsgemisch mit Harz in die Polypropylensäule. Rühren Sie das Gemisch 1 bis 2 Stunden lang vorsichtig mit sprudelndem Stickstoff und wiederholen Sie dann die Kupplungsreaktion einmal. Lassen Sie das Reaktionsgemisch ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DMF, Dichlormethan und erneut DMF jeweils dreimal für jeweils mindestens 1 Minute.Entfernen Sie die Fmoc-Schutzgruppe und waschen Sie das Harz gemäß dem zuvor gezeigten Verfahren, bevor Sie mit der Kopplung der nächsten Aminosäure fortfahren. Als nächstes koppeln Sie das Beta-Alanin als Abstandshalter für die FITC-Markierung mit dem gleichen Verfahren, das für die Aminosäurekopplung gezeigt wird, und fügen Sie dann im Dunkeln eine Mischung aus FITC, DIPEA und DMF zur Polypropylensäule hinzu, um eine FITC-Markierung von Peptiden auf dem Harz durchzuführen. Die Reaktion würde fast 8 Stunden dauern.Um die Cyclisierung des linearen Peptids durchzuführen, wird der Polypropylensäule 2 Minuten lang eine Mischung aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Dichlormethan zugegeben, um die Trityl-schützende Gruppe von Cystein selektiv zu entfernen. Lassen Sie die Mischung abtropfen und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gelbliche Lösung farblos wird, um die Trityl-Schutzgruppe vollständig zu entfernen. Führen Sie das Harz mindestens dreimal nacheinander mit DMF und Dichlormethan aus und lösen Sie 4 ,4'Bis-Brommethyl-biphenyl in DMF mit DIPEA auf.Geben Sie die Lösung in die Säule und reagieren Sie 4 Stunden lang. Waschen Sie das Harz zweimal für jeweils fünf Minuten mit 4 bis 5 Millilitern Methanol und trocknen Sie es mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom. Bei Cysteinhaltigen Peptiden behandeln Sie das Harz mit einem wirksamen Spaltcocktail aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Wasser oder Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan, 1 ,2-Ethanedithiol und Wasser.Behandeln Sie das peptidgebundene Harz 2 bis 3 Stunden lang, um das Peptid zu spalten, und entfernen Sie dann die Trifluoressigsäure vorsichtig mit einem Stickstoffstrahl. Um die rohen Peptide zu erhalten, werden 4 bis 5 Milliliter Diethylether zu der gespaltenen Peptidzubereitung hinzugefügt, um die rohen Peptide auszufällen, und bei 10.000 x g für 4 Minuten zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie das Peptid 3 Minuten lang in einem wirksamen Abzug an der Luft trocknen.Lösen Sie das kleine Rohpeptid in 800 Mikrolitern Acetonitril auf und analysieren Sie es anschließend mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. 100.000 HeLa-Zellen in 2 Millilitern DMEM in einer 12-Well-Kammer mit Gewebekulturplatteneinsatz beimpfen und 24 Stunden lang in einem bei 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Entfernen Sie das Medium und inkubieren Sie die Zellen in den Kammern mit 1 Milliliter 10 mikromolaren FITC-R8 oder FITC-sR8-4 in FBS-freiem DMEM für 1 Stunde.Entfernen Sie danach das Medium mit den Peptiden und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 Milliliter PBS. Geben Sie 1 Milliliter frisches FBS-freies DMEM in die Kammern und inkubieren Sie dann die HeLa-Zellen in der Kammer mit dem Gewebekulturplatteneinsatz für 2 Stunden mit den HeLa-Zellen auf den runden Deckgläsern am Boden. Fixieren Sie die HeLa-Zellen 15 Minuten lang mit 2,5 % Glutaraldehyd auf den runden Deckgläsern und färben Sie die Zellen dann 15 Minuten lang mit DAPI an.Zum Schluss werden die HeLa-Zellen auf den Deckgläsern unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Eine schematische Darstellung der Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid wird hier vorgestellt. Die HPLC- und MS-Spektren des linearen R8-Peptids und des geklammerten R8-Peptids sind in dieser Abbildung dargestellt.Die Retentionszeit des geklammerten Peptids war wesentlich länger als die des linearen Analogons, was auf eine erhöhte Gesamthydrophobie des Peptids nach der Cyclisierung mit der hydrophoben Quervernetzung hinweist. Dieses grafische Bild stellt die Stabilität des linearen Peptids und des geklammerten Peptids in Gegenwart von 25%FBS dar. Das zyklische R8 bleibt nach 4-stündiger Inkubation mit FBS zu 77,3 % intakt, während sein lineares Gegenstück größtenteils abgebaut wurde, was auf eine verbesserte proteolytische Stabilität des zyklischen R8-Peptids hindeutet.Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen von HeLa-Zellen und 4T1-Zellen nach 1-stündiger Inkubation mit 3 mikromolaren FITC-markierten linearen R8-Peptid- und FITC-markierten geklammerten R8-Peptiden werden hier gezeigt. Es zeigt sich, dass die Zellen, die mit zyklischem R8 mit aromatischer Vernetzung behandelt wurden, eine höhere intrazelluläre Fluoreszenz aufwiesen als diejenigen, die mit ihrem linearen Gegenstück behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der durchflusszytometrischen Analyse erzielt.Um weiter zu untersuchen, ob zyklisches R8 eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration verleiht, wurden Transwell-Modelle verwendet, um die Barrierepermeabilität der Peptide von einer Zellschicht zur anderen zu simulieren. Das zyklische R8 zeigte deutlich eine höhere Transbarriere-Penetration als das lineare R8-Peptid, was durch eine signifikante Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz angezeigt wird. Die vollständige Entschützung der Tritylgruppe von Cystein und Harz ist wichtig für den nachfolgenden Cyclisierungsschritt.Außerdem hängt die Cyclisierungseffizienz aufgrund sterischer Effekte auch von den spezifischen Sequenzen und den Längen der Peptide ab. In einem solchen Fall wäre die Verwendung eines Harzes mit geringerer Beladungskapazität oder Cyclisierung der Peptide unter verdünnten Konzentrationen in der Lösungsphase hilfreich. Diese zyklischen Peptide zeigten eine verbesserte Zell-zu-Zell-Permeabilität im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken.Wir glauben, dass sie ein großes Potenzial für die Überwindung biologischer Barrieren darstellen und für weitere Anwendungen im Bereich der Medikamentenverabreichung verwendet werden.

construction-cyclic-cell-penetrating-peptides-for-enhanced

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Protein Transduktion ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Proteinen in Zellen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie DNA-Transfektion oder virale Transduktion dieser nicht-invasiven Paradigma ermöglicht hoch effiziente zelluläre Manipulation in eine titrierbare Weise umgehen zelluläre Toxizität und das Risiko der onkogenen Transformation durch permanente genetische Veränderung.

Engineering zellpermeablen Protein

Dieses Protokoll Details eine Methode zur quantitativen Messung von Peptid-Translokation in große unilamellare Lipidvesikel. Diese Methode liefert auch Informationen über die Geschwindigkeit der Membran-Translokation und kann verwendet werden, um Peptide, die effizient und spontan Kreuz Lipid-Doppelschichten zu identifizieren.

Mess-Peptide Translokation in große unilamellare Vesikel

Dieses Video zeigt eine Technik, die biotinylierte zellpenetrierende Peptide verwendet, um intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen. Die zellpenetrierenden Peptide erleichtern es dem konjugierten Peptid, in eine Zelle einzudringen und spezifisch an seine interagierenden Proteine zu binden. Das Biotin ermöglicht nach der Bindung an Avidin die Reinigung des Komplexes der interagierenden Proteine aus einem Zelllysat.

Biotinylierte zellpenetrierende Peptidsonde zum Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Eine einfache und allgemeine Methode zur Synthese von zyklischen Peptiden mittels Mikrowellenbestrahlung wird skizziert. Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von zyklischen Peptiden des Rückgrats mit einer Sammlung verschiedener Konformationen unter Beibehaltung der Seitenketten und der pharmakophoren Einheiten und ermöglicht daher das Screening auf die bioaktive Konformation.

Entwicklung eines Backbone zyklische Peptid-Bibliothek als potentielle Antiparasiten Therapeutics unter Mikrowellenbestrahlung

Dies ist ein Protokoll zur intrazellulären Proteinprotein Interaktionen basierend auf Biotin-Avidin Pulldown-System mit der Neuheit kombinieren Zelle eindringen Sequenzen zu studieren. Der Hauptvorteil ist, dass die Zielsequenz mit lebenden Zellen statt Zelle Lysates inkubiert wird und daher die Interaktionen im Zusammenhang mit zellulären auftreten werden.

Biotinylierte Zelle eindringen Peptide, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu studieren

Hier werden Protokolle zur Herstellung von peptidbasierten kleinen unilamellalaren Vesikeln vorgestellt, die wachstumsfähig sind. Um die Vesiculo-Produktion des Membranpeptids zu erleichtern, sind diese Vesikel mit einem Transkriptions-Translation-System und dem Peptid-kodierenden Plasmid ausgestattet.

In Vesiculo Synthese von Peptid Membran Vorläufer für autonomeve Vesikelwachstum

Wir beschreiben Protokolle zur Bewertung des Grades der Transduktion durch zelldurchdringende Peptide unter Verwendung von Ex-vivo-Bildgebungssystemen, gefolgt von Paraffineinbettung, Schnitt- und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie am Beispiel von Kardial-Targeting-Peptid. In unserem Protokoll kann ein einzelnes Tier verwendet werden, um beide Arten der bildgebenden Bewertung der gleichen Organe zu erwerben, wodurch die Anzahl der Tiere, die für Studien benötigt werden, um die Hälfte wird.

In Vivo Imaging von Transduktionseffizienzen des Kardialen Peptids

Der Fluoreszenz-Leckage-Assay ist eine einfache Methode, die die Untersuchung von Peptid/Membran-Wechselwirkungen ermöglicht, um ihre Beteiligung an mehreren biologischen Prozessen und insbesondere die Fähigkeit von zelldurchdringenden Peptiden zu verstehen, Phospholipide-Doppelschichten während eines direkten zellulären Translokationsprozesses zu stören.

Fluoreszenz-Leckage-Assay zur Untersuchung der Membrandestabilisierung durch zelldurchdringendes Peptid

Dieses Protokoll stellt die Synthese zyklischer Peptide durch Bisalkylierung zwischen Cystein und Methionin und die einfache Thiol-In-Reaktion dar, die durch das Propargylsulfoniumzentrum ausgelöst wird.

Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum

Dieses Protokoll zielt darauf ab, biofunktionelle selbstorganisierende Peptide auf Zelladhäsion, Organoidmorphologie und Genexpression durch Immunfärbung zu bewerten. Wir werden eine Darmkrebszelllinie verwenden, um eine kostengünstige Möglichkeit zu bieten, Organoide für intensive Tests zu gewinnen.

Herstellung und Charakterisierung von kolorektalen Krebs-Organoiden aus der SW1222-Zelllinie in ultrakurzer selbstorganisierender Peptidmatrix

Lernen Sie die Synthese zyklischer zellpenetrierender Peptide mit aromatischen Quervernetzungen zur Verbesserung der Hydrophobizität und Permeabilität biologischer Barrieren. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Arzneistoffabgabe an Tumorzellen ohne Metallkatalysatoren.

Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Weitere Videos entdecken