Konstruktion zyklischer zellpenetrierender Peptide zur verbesserten Durchdringung biologischer Barrieren

Ein gravierendes Hindernis für die Krebsbehandlung ist der eingeschränkte Zugang von Therapeutika zu tieferen Tumorzellen aufgrund physiologischer Barrieren. Daher ist die Entwicklung neuartiger molekularer Transporter, die in der Lage sind, biologische Barrieren zu behandeln, dringend erwünscht, um die Effizienz der Wirkstoffabgabe zu verbessern. Der Zweck dieses Verfahrens besteht darin, die zyklischen zellpenetrierenden Peptide für eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration zu synthetisieren.

Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die Peptidcyclisierung einfach durch Substitutionsreaktionen mit Cystein und Harz erreicht werden kann, ohne dass Metallkatalysatoren erforderlich sind. Der Einbau aromatischer Vernetzungen verbessert die Gesamthydrophobie der Peptide im Vergleich zu den hydrophilen Lactam- oder Triazol-Querverbindungen und erhöht dadurch deren Permeabilität. Montieren Sie zunächst die manuelle Peptidsyntheseapparatur im Abzug.

Setzen Sie die Dreiwegehähne auf den Vakuumverteiler und schließen Sie sie an Stickstoff an. Stellen Sie sicher, dass Sie die ungenutzten Einlässe verschließen. Befestigen Sie eine 10-Milliliter-Polypropylensäule an den Dreiwegehahnen und lassen Sie das Reaktionsgemisch oder die Lösungsmittel mit einem Gummipipettenkolben oder einem Vakuum über einen Abfallabscheider aus der Polypropylensäule ab.

Um das Harz für die Peptidsynthese vorzubereiten, fügen Sie 4 bis 5 Milliliter DMF zur erforderlichen Harzmenge hinzu und überführen Sie es 30 Minuten lang mit sanftem Stickstoffsprudeln in die Polypropylensäule, um das Harz ausreichend aufzuquellen. Lassen Sie das ZMS ab und fügen Sie dem Harz 4 bis 5 Milliliter 50%Morpholin/DMF hinzu. Sprudeln Sie den Stickstoff 30 Minuten lang vorsichtig, um die N-terminale Fmoc-Gruppe zu entfernen, und lassen Sie die Mischung dann abtropfen.

Waschen Sie das Harz dreimal gründlich, indem Sie 4 bis 5 Milliliter DMF in die Säule geben und jedes Mal mindestens 1 Minute lang mit Stickstoff sprudeln. Waschen Sie das Harz auf die gleiche Weise dreimal mit Dichlormethan und dreimal mit DMF. Als nächstes werden 648,8 Milligramm Fmoc und PBF-geschütztes Arginin und 372,6 Milligramm HATU in 5 Millilitern DMF in einem Zentrifugenröhrchen gelöst.

Fügen Sie 348,4 Mikroliter DIPEA hinzu, um die Kupplungsreaktion zu aktivieren, und übertragen Sie das Reaktionsgemisch mit Harz in die Polypropylensäule. Rühren Sie das Gemisch 1 bis 2 Stunden lang vorsichtig mit sprudelndem Stickstoff und wiederholen Sie dann die Kupplungsreaktion einmal. Lassen Sie das Reaktionsgemisch ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DMF, Dichlormethan und erneut DMF jeweils dreimal für jeweils mindestens 1 Minute.

Entfernen Sie die Fmoc-Schutzgruppe und waschen Sie das Harz gemäß dem zuvor gezeigten Verfahren, bevor Sie mit der Kopplung der nächsten Aminosäure fortfahren. Als nächstes koppeln Sie das Beta-Alanin als Abstandshalter für die FITC-Markierung mit dem gleichen Verfahren, das für die Aminosäurekopplung gezeigt wird, und fügen Sie dann im Dunkeln eine Mischung aus FITC, DIPEA und DMF zur Polypropylensäule hinzu, um eine FITC-Markierung von Peptiden auf dem Harz durchzuführen. Die Reaktion würde fast 8 Stunden dauern.

Um die Cyclisierung des linearen Peptids durchzuführen, wird der Polypropylensäule 2 Minuten lang eine Mischung aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Dichlormethan zugegeben, um die Trityl-schützende Gruppe von Cystein selektiv zu entfernen. Lassen Sie die Mischung abtropfen und wiederholen Sie den Vorgang, bis die gelbliche Lösung farblos wird, um die Trityl-Schutzgruppe vollständig zu entfernen. Führen Sie das Harz mindestens dreimal nacheinander mit DMF und Dichlormethan aus und lösen Sie 4 ,4'Bis-Brommethyl-biphenyl in DMF mit DIPEA auf.

Geben Sie die Lösung in die Säule und reagieren Sie 4 Stunden lang. Waschen Sie das Harz zweimal für jeweils fünf Minuten mit 4 bis 5 Millilitern Methanol und trocknen Sie es mit einem kontinuierlichen Stickstoffstrom. Bei Cysteinhaltigen Peptiden behandeln Sie das Harz mit einem wirksamen Spaltcocktail aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Wasser oder Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan, 1 ,2-Ethanedithiol und Wasser.

Behandeln Sie das peptidgebundene Harz 2 bis 3 Stunden lang, um das Peptid zu spalten, und entfernen Sie dann die Trifluoressigsäure vorsichtig mit einem Stickstoffstrahl. Um die rohen Peptide zu erhalten, werden 4 bis 5 Milliliter Diethylether zu der gespaltenen Peptidzubereitung hinzugefügt, um die rohen Peptide auszufällen, und bei 10.000 x g für 4 Minuten zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie das Peptid 3 Minuten lang in einem wirksamen Abzug an der Luft trocknen.

Lösen Sie das kleine Rohpeptid in 800 Mikrolitern Acetonitril auf und analysieren Sie es anschließend mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie. 100.000 HeLa-Zellen in 2 Millilitern DMEM in einer 12-Well-Kammer mit Gewebekulturplatteneinsatz beimpfen und 24 Stunden lang in einem bei 37 Grad Celsius befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Entfernen Sie das Medium und inkubieren Sie die Zellen in den Kammern mit 1 Milliliter 10 mikromolaren FITC-R8 oder FITC-sR8-4 in FBS-freiem DMEM für 1 Stunde.

Entfernen Sie danach das Medium mit den Peptiden und waschen Sie die Zellen dreimal mit 1 Milliliter PBS. Geben Sie 1 Milliliter frisches FBS-freies DMEM in die Kammern und inkubieren Sie dann die HeLa-Zellen in der Kammer mit dem Gewebekulturplatteneinsatz für 2 Stunden mit den HeLa-Zellen auf den runden Deckgläsern am Boden. Fixieren Sie die HeLa-Zellen 15 Minuten lang mit 2,5 % Glutaraldehyd auf den runden Deckgläsern und färben Sie die Zellen dann 15 Minuten lang mit DAPI an.

Zum Schluss werden die HeLa-Zellen auf den Deckgläsern unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Eine schematische Darstellung der Synthese von FITC-markiertem linearem R8-Peptid und FITC-markiertem geklammertem R8-Peptid wird hier vorgestellt. Die HPLC- und MS-Spektren des linearen R8-Peptids und des geklammerten R8-Peptids sind in dieser Abbildung dargestellt.

Die Retentionszeit des geklammerten Peptids war wesentlich länger als die des linearen Analogons, was auf eine erhöhte Gesamthydrophobie des Peptids nach der Cyclisierung mit der hydrophoben Quervernetzung hinweist. Dieses grafische Bild stellt die Stabilität des linearen Peptids und des geklammerten Peptids in Gegenwart von 25%FBS dar. Das zyklische R8 bleibt nach 4-stündiger Inkubation mit FBS zu 77,3 % intakt, während sein lineares Gegenstück größtenteils abgebaut wurde, was auf eine verbesserte proteolytische Stabilität des zyklischen R8-Peptids hindeutet.

Lebendzell-Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen von HeLa-Zellen und 4T1-Zellen nach 1-stündiger Inkubation mit 3 mikromolaren FITC-markierten linearen R8-Peptid- und FITC-markierten geklammerten R8-Peptiden werden hier gezeigt. Es zeigt sich, dass die Zellen, die mit zyklischem R8 mit aromatischer Vernetzung behandelt wurden, eine höhere intrazelluläre Fluoreszenz aufwiesen als diejenigen, die mit ihrem linearen Gegenstück behandelt wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit der durchflusszytometrischen Analyse erzielt.

Um weiter zu untersuchen, ob zyklisches R8 eine verbesserte Zell-zu-Zell-Penetration verleiht, wurden Transwell-Modelle verwendet, um die Barrierepermeabilität der Peptide von einer Zellschicht zur anderen zu simulieren. Das zyklische R8 zeigte deutlich eine höhere Transbarriere-Penetration als das lineare R8-Peptid, was durch eine signifikante Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz angezeigt wird. Die vollständige Entschützung der Tritylgruppe von Cystein und Harz ist wichtig für den nachfolgenden Cyclisierungsschritt.

Außerdem hängt die Cyclisierungseffizienz aufgrund sterischer Effekte auch von den spezifischen Sequenzen und den Längen der Peptide ab. In einem solchen Fall wäre die Verwendung eines Harzes mit geringerer Beladungskapazität oder Cyclisierung der Peptide unter verdünnten Konzentrationen in der Lösungsphase hilfreich. Diese zyklischen Peptide zeigten eine verbesserte Zell-zu-Zell-Permeabilität im Vergleich zu ihren linearen Gegenstücken.

Wir glauben, dass sie ein großes Potenzial für die Überwindung biologischer Barrieren darstellen und für weitere Anwendungen im Bereich der Medikamentenverabreichung verwendet werden.