Entschlüsselung des molekularen Mechanismus und der Funktion von porenbildenden Toxinen mit Leishmania major

Der Mechanismus der Resistenz gegen porenbildende Toxine ist kaum verstanden. Unser Protokoll ermöglicht Funktion und Mechanismus zur Porenbildung von Toxinen mit Leishmania major, einem genetisch bedienbaren und physiologisch relevanten System. Der Hauptvorteil des Zytotoxizitätstests besteht darin, die Zelllebensfähigkeit mehrerer Phänotypen auf Einzelzellebene in einem Mitteldurchsatz-Assay zu vergleichen, wenn er mit Toxinen in Echtzeit konfrontiert wird.

Membranstörende Mittel wie Amphotericin B sind Frontline-Therapien für Leishmania. Dieser Assay ermöglicht die Identifizierung von Wirkstoffen, die Amphotericin B und/oder neue membranschädigende Wirkstoffe potenzieren. Dieser Assay bietet Einblicke in Bereiche wie Reparaturreaktion und Signalwege im Zusammenhang mit Reparaturreaktionen.

Dieser Assay kann auf Protozoen wie Trypanosoma und Naegleria fowleri angewendet werden. Die Menschen finden es schwierig, die Toxin-Serienverdünnungsreihe zu verstehen. Der beste Rat, den ich geben kann, ist, ein Schema der seriellen Verdünnungsreihe zu zeichnen, bevor Sie das Experiment einrichten.

Reservieren Sie zunächst 0,5 Milliliter verarbeitete Promastigoten in einem separaten Röhrchen als ungefärbte Kontrolle. Fügen Sie zwei Milligramm pro Milliliter Propidiumiodid oder PI zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu den verbleibenden Promastigoten hinzu. Wirbel für drei Sekunden.

Fügen Sie verarbeitete Promastigoten zu jeder Vertiefung einer V-Boden-, 96-Well-Platte oder Marsh-Rohre hinzu und platzieren Sie die Platte oder das Rohrgestell in einem Winkel von etwa 45 Grad auf dem Eis. Fügen Sie 100 Mikroliter Assay-Puffer mit Propidiumiodid zu jeder No-Toxin-Kontrolle hinzu. Überprüfen Sie, ob das Steuerelement korrekt hinzugefügt wurde, indem Sie Röhren mit einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern, die dunkler erscheinen, visuell identifizieren.

Fügen Sie das Toxinvolumen zur höchsten Verdünnung hinzu. Dann verdünnen Sie das Toxin seriell. Pipettieren Sie mindestens achtmal nach oben und unten, um das Mischen zu gewährleisten.

Ausgehend von der niedrigsten Toxinkonzentration fügen Sie schnell 100 Mikroliter Toxin in die richtige Reihe hinzu und fahren Sie fort, bis das gesamte Toxin in die Zellen gegeben wurde. Verschließen Sie die Platte mit Dichtband. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 Grad Celsius verpacken und transportieren Sie die Platte zum Durchflusszytometer.

Beginnen Sie für die Datenerfassung mit der Einrichtung des Durchflusszytometers und der Erfassungssoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers und den Richtlinien pro Einrichtung. Stellen Sie unter Verwendung der ungefärbten L.major-Promastigotenprobe die Tore für die Vorwärts- und Seitenstreuung und die anfänglichen Fluoreszenzparameter basierend auf den ausgewählten Farbstoffen ein. Verwenden Sie einfach gefärbte Kontrollen, stellen Sie die Tore für den Lebensfähigkeitsfarbstoff und alle fluoreszierend markierten Toxine ein.

Überwachen Sie die Vorwärtsstreuung im Zeitverlauf für Mikroverstopfungen und erfassen Sie mehr als 10.000 gesteuerte Ereignisse für jede Probe auf dem Zytometer. Für die Datenanalyse werden die gesamten einzelligen L.major-Promastigoten durch Gating auf Vorwärts- und Seitenstreuung und Zeit nach Bedarf gegatet. Verwenden Sie Höhe oder Fläche wie für das Durchflusszytometer empfohlen.

Identifizieren und markieren Sie tote Zellen als PI hoch. Organisieren Sie die Dosis-Wirkungs-Kurve in Excel für die Analyse. Bestimmen Sie den durchschnittlichen PI-Wert für jede Bedingung zwischen den beiden technischen Replikaten.

Fügen Sie die Toxinkonzentration und die durchschnittliche prozentuale spezifische Lyse zusammen mit experimentellen Details und / oder rohen prozentualen PI-hohen Berechnungen hinzu. Beschriften Sie vier weitere Spalten als Modelliert, Residuen, Parameter und Parameterwerte. Überprüfen Sie, ob die ersten Spalten den experimentellen Parametern, der Toxinkonzentration und der prozentspezifischen Lyse entsprechen.

Initialisieren Sie die Parameter L, k und c, indem Sie die Werte in die Spalte Parameterwerte eingeben. Erstellen Sie in der Spalte Modelliert das Logistikmodell. Berechnen Sie in der Spalte Residuen das Quadrat der Differenz zwischen der modellierten Zahl und der tatsächlichen spezifischen Lyse.

Summieren Sie in der Spalte Parameterwerte neben SUMME alle Werte in der Spalte Residuen. Initialisieren Sie in der Spalte Parameterwerte neben LC50 die Gleichung, um die LC50 aus den ermittelten Werten zu berechnen. Öffnen Sie den Solver auf der Registerkarte Daten.

Wählen Sie als festgelegtes Ziel die Zelle aus, die die Summe der berechneten Residuen enthält. Ändern Sie die variablen Zellen für die Parameterwerte L, k und c.

Ändern Sie für negative k-Werte Gleichungen, indem Sie negative Eins von k ausschließen, um k in positiv zu ändern. Verwenden Sie die GRG Nonlinear Solving-Methode, und klicken Sie auf Lösen. Überprüfen Sie die Kurve und ob der LC50 automatisch berechnet wird.

Überprüfen Sie die Passung, indem Sie sowohl die prozentspezifische Lyse als auch die Modellierung gegen die Toxinkonzentration grafisch darstellen. Die Sphingolipid-defizienten SPT2-Knockout-Promastigoten reagierten sowohl im serumfreien M199 als auch im Tyrode-Puffer empfindlich auf SLO. Wildtyp- und SPT2-Add-Back-Promastigoten waren resistent gegen SLO in serumfreiem M199, hatten aber weniger als 20%spezifische Lyse im Tyrode-Puffer.

Die SPT2-Knockout-Promastigoten waren in Tyrodes Puffer etwa achtmal empfindlicher gegenüber SLO als in M199. Diese Daten zeigen, dass die Toxinempfindlichkeit je nach verwendetem Puffer variieren kann. Eine 120-Kilodalton-Bande wurde für Phospho-MEK in den L.major-Promastigoten beobachtet.

Für die Gesamt-MEK wurden Banden bei etwa 120 Kilodalton und 55 Kilodalton beobachtet, die mit den Größen von MRK1 bzw. LmxMKK übereinstimmen. Phospho-ERK wies ähnliche Banden nach, während die ERK-Antikörperfärbung in diesem Assay nicht robust war. Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist die ordnungsgemäße Handhabung des Toxins.

Leishmania kann als genetisch beherrschbares Modell verwendet werden, um die Reparatur von Plasmamembranen zu untersuchen und neue Einblicke in die Membranreparaturmechanik während der Leishmania-Bakterieninteraktion im Mitteldarm der Sandfliege zu gewinnen.