Name: Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 3 min 38 s
Description: Lernen Sie eine schnelle Aptamer-basierte Methode zur Theophyllin-Detektion mittels isothermer G-Quadruplex-Amplifikation. Dieses Protokoll ermöglicht visuelle oder quantitative Ergebnisse mit minimalem Hintergrundsignal.

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Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Entwicklungsförderung von Aptagen LLC unterstützt.

Siehe Ergänzende Tabelle 1 (die Reaktionsaufbautabelle) für die Herstellung von Röhrchen, einschließlich der spezifischen Volumina und Konzentrationen der Reaktionskomponenten. Das hier demonstrierte Protokoll verwendet ein vormontiertes Detektionsplattform-Kit, wie in der Materialtabelle beschrieben. Alle Komponenten müssen auf Eis gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.
1. Herstellung von Ribozym
HINWEIS: Die primäre Nachweiskomponente ist ein allosterisches (Aptamer-reguliertes) Ribozym, das Theophyllin erkennt (siehe Ergänzende Tabelle 2).
<ol><li>Sammeln Sie 5 U T4-Polynukleotidkinase (0,5 μl, siehe Materialtabelle) in einem PCR-Röhrchen, das zur Aktivierung der Ribozym-Spaltprodukte verwendet wird. Anmerkungen: Diese Komponente wird zuerst hinzugefügt, damit der Benutzer die korrekte Abgabe des Enzyms sehen kann.</li>
	<li>Geben Sie 1 μl vorbereiteten 5x Ribozympuffer (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen (PCR-Röhrchen).</li>
	<li>Um die Spezifität visuell nachzuweisen, werden 1,5 μl 2 mM Theophyllin (Ziel) oder 2 mM Koffein (Kontrolle) (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen als Testproben gegeben. HINWEIS: Für die Erstellung einer Standardkurve wird empfohlen, bei 3,125 mM Analyt zu beginnen und fünffache Verdünnungen bis 0,001 mM zu testen.</li>
	<li>Mischen Sie jedes Probenröhrchen gründlich, indem Sie 5-10 Mal pipettieren.</li>
	<li>Geben Sie 2 μl 600 nM RNA mit einer für das Target spezifischen aptameren Domäne (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen, um eine Endkonzentration von 240 nM in 5 μl Testlösung zu erreichen, mischen Sie dann schnell durch Pipettieren und legen Sie es auf einen kalten Block, um das Hintergrundsignal zu minimieren. HINWEIS: Es ist wichtig, zunächst alle Reaktionen ohne Ribozym vorzubereiten, da die Selbstspaltungsreaktion sofort beginnt, wenn Ribozym mit Ribozympuffer kombiniert wird, und einen erheblichen Hintergrund erzeugen kann.</li>
	<li>Sobald alle Reaktionsgefäße vorbereitet sind, inkubieren Sie jede Probe (5 μL) bei Raumtemperatur (23 °C) genau 3 Minuten lang mit einem Timer. Legen Sie die Probenröhrchen nach der Inkubation sofort wieder in Eis (4 °C) ein.</li>
</ol>2. GQ-EXPAR
<ol><li>Geben Sie 3,5 μl Nickase-Polymerase-Enzymgemisch (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut. HINWEIS: Die erforderlichen Enzymkonzentrationen hängen von den Erkennungssequenzen, den Enzymtypen und den Reaktionstemperaturen ab, deren Kombination empirisch bestimmt wurde.</li>
	<li>Geben Sie 31,5 μl EXPAR-Reaktionsmischung mit Templat, Nukleotiden und Reaktionspuffer (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und jede Pipette, um sie zu mischen. HINWEIS: Die Komponentenkonzentrationen sind auf der Grundlage der Enzyme und Sequenzen der Polymeraseprodukte optimiert.</li>
	<li>Sobald alle Proben vorbereitet sind, inkubieren Sie jede vorbereitete Probe (40 μL) bei 55 °C genau 5 Minuten lang mit einem Timer. Wenn möglich, inkubieren Sie auf einem Thermocycler, obwohl ein beheizter Deckel nicht erforderlich ist.</li>
	<li>Legen Sie die Probenröhrchen nach dem Inkubationsschritt sofort wieder in Eis (4 °C) ein.</li>
</ol>3. Farbentwicklung
<ol><li>Geben Sie 2 μl Hemin-Lösung (25 μM, siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.</li>
	<li>Geben Sie 58 μl der handelsüblichen TMB-Lösung (siehe Materialtabelle) in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Farbentwicklungsreaktion (100 μL) bei Raumtemperatur für mindestens 3 min und bis zu 30 min. Anmerkungen: (Optional) Die Farbentwicklung kann durch Zugabe von 20 μl 2 M Schwefelsäure gestoppt werden.</li>
	<li>Lesen Sie die Proben qualitativ mit dem Auge ab oder quantifizieren Sie die Ergebnisse mit einem Absorptionsplatten-Lesegerät bei 450 nm, wenn die Farbentwicklungsreaktionen mit Schwefelsäure gestoppt werden.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tang, J., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+allosteric+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Rational design of allosteric ribozymes.</a> Chemical Biology. 4 (6), 453-459 (1997).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Liao, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+colorimetric+system+for+detecting+target+antigens+by+a+three-stage+signal+transformation-amplification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A simple colorimetric system for detecting target antigens by a three-stage signal transformation-amplification strategy.</a> Biochemistry. 57 (34), 5117-5126 (2018).</li>
<li>Soukup, G. A., Emilsson, G. A., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+molecular+recognition+of+RNA+aptamers+by+allosteric+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection.</a> Journal of Molecular Biology. 298 (4), 623-632 (2000).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
<li>Cheng, X., Liu, X., Bing, T., Cao, Z., Shangguan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+peroxidase+activity+of+G-quadruplex-hemin+complexes+and+its+application+in+ligand+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">General peroxidase activity of G-quadruplex-hemin complexes and its application in ligand screening.</a> Biochemistry. 48 (33), 7817-7823 (2009).</li>
<li>Nie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-triggered+isothermal+exponential+amplification+strategy+in+ultrasensitive+homogeneous+label-free+electrochemical+nucleic+acid+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Reporter-triggered isothermal exponential amplification strategy in ultrasensitive homogeneous label-free electrochemical nucleic acid biosensing.</a> Chemical Communications. 50 (47), 6211-6213 (2014).</li>
<li>Tabuchi, T., Yokobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-free riboswitches.</a> RSC Chemical Biology. 2 (5), 1430-1440 (2021).</li>
<li>Ao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+an+expression+platform+in+the+SELEX+cycle+to+select+DNA+aptamer+binding+to+a+disease+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Integration of an expression platform in the SELEX cycle to select DNA aptamer binding to a disease biomarker.</a> ACS Omega. 7 (12), 10804-10811 (2022).</li>
</ol>

Aptagen, LLC produziert und vermarktet ein GQ-EXPAR-Demonstrationskit für diejenigen, die direkte Erfahrungen mit einem Aptamer-basierten Detektionssystem machen möchten.

Die hier vorgestellte Methode nutzt den Übergang zwischen einer anfänglich ungeordneten Sekundärstruktur in einem allosterischen Ribozym und der zusätzlichen Stabilität, die durch die Bindung des Ziels an die aptamere Domäne verliehen wird, um das cis-spaltende Hammerkopf-Ribozym zu aktivieren. Die Stabilität des Ribozyms wurde angepasst, um die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Targets zu minimieren und gleichzeitig die Bindung des Targets zur Wiederherstellung der aktiven Struktur zu ermöglichen. Darüber hinaus...

Aptamere sind in der Regel einzelsträngige DNA oder RNA, die durch einen evolutionären Prozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität für die gewünschten Ziele ausgewählt werden1. Zusätzlich zur Bindungsfähigkeit können Aptamere mit Motiven verknüpft werden und diese mit Signalausgangsfunktionen2,3 steuern, wodurch das Signal verstärkt und die Empfindlichkeit des Systems verbessert wird. Das G-Quadruplex-System der isothermen exponentiellen Verstärkungsreaktion (GQ-EXPAR) ist ein dreiteiliges System (Abbildung 1), das ein visuelles Signal entwickelt, wenn aufeinanderfolgende Komponenten zu einem einzigen Reaktionsgefäß hinzugefügt werden, um einen visuellen Ausgang4 zu erzeugen. Dieses System ermöglicht den Nachweis eines bestimmten Ziels, hierin Theophyllin, in einer gegebenen Probe innerhalb von 15 Minuten unter Verwendung eines optimierten Arbeitsablaufs, um eine schnelle, spezifische Detektion eines Ziels von Interesse zu ermöglichen. Diese Methode muss für Proben in Betracht gezogen werden, bei denen eine spezifische Quantifizierung der Zielkonzentration weniger besorgniserregend ist als eine hohe Spezifität der Reaktion in kurzer Zeit.
Ein allosterischer Riboschalter, ein strukturwechselndes RNA-Molekül (Ribozym), das sich selbst spaltet, erzeugt das initiale Signal. Dieses Konstrukt basiert auf dem Hammerhai-Ribozym, wobei in Stamm II eine aptamere Domäne als Regulator der Spaltaktivität eingeführt wurde. Seine Selbstspaltungsfunktion wird aktiviert, wenn seine aptamere Domäne bei der Bindung an sein Zielstabilisiert wird 5. Andernfalls ist der Switch in seinem nativen Zustand inaktiv.
Die anschließende exponentielle Amplifikationsreaktion (EXPAR) nutzt die Freisetzung des selbstgespaltenen RNA-Strangs aus der ersten Stufe, um eine isotherme Amplifikationsreaktion6 auszulösen. Das Amplifikationsprodukt von EXPAR hat die Peroxidaseaktivität7, die als Grundlage für die letzte Stufe des Systems dient. Wenn einige Substrate in Verbindung mit dem Peroxidabbau oxidiert werden, erzeugen sie eine Fluoreszenzleistung, die mit verschiedenen Geräten gemessen werden kann. Andere gängige Substrate können ersetzt werden, um ein farbiges Produkt für die visuelle Detektion herzustellen. EXPAR und die Peroxidaseaktivität seiner Amplifikationsprodukte wirken als 2-stufiger Signalverstärker, der die Empfindlichkeit im Vergleich zu herkömmlichen Strategien auf höhere Konzentrationen erhöht 7,8.
Der Nachweis von Theophyllin im Vergleich zu Koffein wird als Beispiel für die Spezifität dieser Nachweisplattform verwendet, da sie sich nur um eine einzige Methylgruppe unterscheiden (Abbildung 2). Diese Demonstration des Systems erzeugt einen kolorimetrischen Ausgang für den visuellen Nachweis von mindestens 500 nM Theophyllin.

<table><tbody><tr><td>3,3',5,5'-Tetramethylbenzidindihydrochlorid (TMB)-Lösung mit H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"</td><td>PerkinElmer</td><td>FOOD-1806-1000</td><td>Reagenz zur Farbentwicklung. Minimieren Sie die Licht- und Atmosphäreneinwirkung. Zuvor BIOO Scientific Katalognummer 1806. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhre 3-2.</td></tr><tr><td>5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3"</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>Kundenspezifisch</td><td>optimiertes QtQ47-DNA-Template für EXPAR zur Herstellung von G-Quadruplex, grundiert durch G-Quadruplex. Dies wird für den "exponentiellen" Teil von EXPAR verwendet, um die Menge an DNAzyme, die für die Farbentwicklung in Schritt 3 verwendet wird, schnell zu erhöhen. Das Template enthält ein 3'-Biotin, um eine unbeabsichtigte Verlängerung durch die Bst 2.0 DNA-Polymerase während der EXPAR. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2 zu verhindern.</td></tr><tr><td>5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>Benutzerdefinierte</td><td>Theophyllin-recognierende allosterische Ribozymsequenz (selbstspaltendes Ribozym, reguliert durch RNA-Aptamerdomäne für Theophyllin), modifiziert von Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A. und Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Geliefert im Apta-beacon Demonstrationskit als Röhrchen 1-3.</td></tr><tr><td>5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3'</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>Kundenspezifisch</td><td>optimiertes P3tQ49-DNA-Template für EXPAR zur Herstellung von G-Quadruplex, grundiert mit P3-Spaltprodukt. Dies wird in Schritt 2 verwendet, um das Spaltprodukt in DNAzyme zu übersetzen, das für die Farbentwicklung in Schritt 3 verwendet wird. Das Template enthält ein 3'-Biotin, um eine unbeabsichtigte Verlängerung durch die Bst 2.0 DNA-Polymerase während der EXPAR. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2 zu verhindern.</td></tr><tr><td>5x Ribozyme Puffer</td><td>Aptagen, LLC</td><td>N/A</td><td>5x Zusammensetzung: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Verwendet in Schritt 1. im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhre 1-4 geliefert.</td></tr><tr><td>Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstrationskit</td><td>Aptagen, LLC</td><td>GQ-EXPAR-TMB</td><td>Das Demo-Kit demonstriert die Spezifität des kolorimetrischen Assays durch den Nachweis schwieriger niedermolekularer Ziele, Theophyllin versus Koffein, die sich nur durch eine einzige Methylgruppe unterscheiden.</td></tr><tr><td>Bst 2.0 DNA-Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td><td>Isotherme Amplifikationspolymerase mit Strangverdrängungsaktivität. Teil des Nickase-Polymerase-Mixes, hergestellt bei 9,375 U/uL. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-1.</td></tr><tr><td>Puffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6003SVIAL</td><td>Kombiniert mit 2 μl 10-fachem isothermem Amplifikationspuffer und 27,5 μl nukleasefreiem Wasser, um 1,11-fachen EXPAR-Puffer in EXPAR Mix herzustellen. Dieses Produkt ersetzt das zuvor verwendete B7203SVIAL, das Teil der ursprünglichen Systementwicklung war (gleiche Zusammensetzung außer nicht-rekombinantem BSA). Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.</td></tr><tr><td>Caffeine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0750-100G</td><td>Aptamer Gegenziel (Kontrolle), hergestellt mit nukleasefreiem Wasser. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Tube 1-1.</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>Teil des EXPAR-Reaktionsgemisches. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.</td></tr><tr><td>EXPAR Reaktionsgemisch</td><td>Aptagen, LLC</td><td>N/A</td><td>0,44 mM dNTPs, 0,38 &mu; M P3tQ49, 0,38 &mu; M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 &mu; g/ml BSA, 0,0635 % Tween 20, Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td>Resuspendiert in DMF auf eine Endkonzentration von 25 μM. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Tube 3-1.</td></tr><tr><td>Isothermer Amplifikationspuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0537SVIAL</td><td>Kombiniert mit 2 μl 10x Puffer 3.1 und 27.5 &micro; L nukleasefreies Wasser zur Herstellung von 1,11x EXPAR Puffer im EXPAR Mix. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-2.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Amresco (VWR)</td><td>E525-500ML</td><td>Hammerhead-Ribozym-Cofaktor, notwendig für die Selbstspaltung. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 1-3.</td></tr><tr><td>MJ PTC-100 Thermocycler</td><td>MJ Research, Inc.</td><td>PTC-100</td><td>Thermocycler zur Kontrolle der Inkubationstemperaturen. Es kann jeder Thermocycler oder Heißblock verwendet werden.</td></tr><tr><td>N, N-Dimethylformamid (DMF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056-100ML</td><td>Wird verwendet, um Hemin zu resuspendieren und die Haltbarkeit im Gefrierschrank zu maximieren. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 3-1.</td></tr><tr><td>Nickase-Polymerase Mix</td><td>Aptagen, LLC</td><td>N/A</td><td>Nt.BstNBI (9.375 Einheiten/&mu; L) und Bst 2.0 DNA-Polymerase (0,5 Einheiten/&mu; L). Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhre 2-1.</td></tr><tr><td>Nt.BstNBI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0607S</td><td>Nicking-Enzym, um eine kontinuierliche isotherme Amplifikation zu ermöglichen. Teil des Nickase-Polymerase-Mixes, hergestellt bei 0,5 U/uL. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 2-1.</td></tr><tr><td>T4 Kinase Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201SVIAL</td><td>Puffer für Enzyme, die zur Entfernung von cyclischem Phosphat erforderlich sind. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 1-4.</td></tr><tr><td>T4-Polynukleotidkinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td>Entfernt zyklisches Phosphat nach der Spaltung, damit das Spaltprodukt die isotherme Amplifikationsreaktion auslösen kann. Lieferung im Apta-Beacon-Demonstrationskit als PCR-Röhrchen.</td></tr><tr><td>Tecan GENios FL</td><td>Tecan</td><td>Genios-FL TWT</td><td>Plattenlesegerät zur Messung des Absorptionssignals aus den Ergebnissen von Schritt 3.</td></tr><tr><td>Theophyllin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633-50G</td><td>Aptamer-Target, hergestellt mit nukleasefreiem Wasser. Lieferung im Apta-Beacon Demonstration Kit als Röhrchen 1-2.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB14043-01000</td><td>Aptamer-Bindungspuffer. Teil des Apta-Beacon Demonstration Kit Tube 1-4.</td></tr></tbody></table>

aptamer-basierte target-detektion durch eine 3-stufige isotherme g-quadruplex-amplifikationsreaktion

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamere sind Zielerkennungsmoleküle, die mit hoher Affinität und Spezifität binden. Diese Eigenschaften können genutzt werden, um andere Moleküle mit der Fähigkeit zur Signalerzeugung zu steuern. Für das hier beschriebene System aktiviert die Zielerkennung durch eine aptamere Domäne, Stamm II eines modifizierten Hammerkopf-Ribozyms, das selbstspaltende Ribozym, indem das anfänglich unstrukturierte Konstrukt stabilisiert wird. Die cis-spaltende RNA wirkt an der Verbindungsstelle von Stamm III und Stamm I, wodurch zwei Spaltprodukte entstehen. Das längere Spaltprodukt führt zu einer isothermen exponentiellen Amplifikationsreaktion (EXPAR) der beiden ähnlichen katalytisch aktiven G-Quadruplexe. Diese resultierenden Amplifikationsprodukte katalysieren die Peroxidase-Reduktion, die mit der Reduktion eines kolorimetrischen Substrats mit einer Leistung gekoppelt ist, die mit bloßem Auge wahrgenommen werden kann. Das in der vorliegenden Studie beschriebene 3-teilige System verbessert Nachweismodalitäten wie Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs), indem es in nur 15 Minuten ein visuell detektierbares Signal erzeugt, das das Vorhandensein von nur 0,5 μM Theophyllin anzeigt.

Die in Abbildung 1 dargestellte Detektionsplattform wandelt die aptamerische Zielerkennung in kurzer Zeit in visuell deutliche Unterschiede zwischen den Probenpräparaten (Target vs. Nicht-Ziel, Abbildung 2) um. Ein allosterisches Ribozym, das von Soukup et al.5 identifiziert wurde, diente als Ausgangspunkt für die Erstellung einer weniger verrauschten Sequenz mit Reaktion auf das Target über die Kontroll- und Negativproben. Das optimierte...

Das vorliegende Protokoll demonstriert die Verwendung eines schnellen, 3-stufigen, Aptamer-basierten exponentiellen Amplifikations-Assays zur Detektion von Targets. Probenvorbereitung, Signalverstärkung und Farbentwicklung werden behandelt, um dieses System zu implementieren, um das Vorhandensein von Theophyllin gegenüber dem von Koffein zu erkennen.

Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, das Signal von Bindungsereignissen in eine Form zu bringen, die bei geringem Ressourcenverbrauch visuell erkennbar ist oder mit absorptionsbasierter Instrumentierung quantifiziert werden kann. Dies ist ein relativ schnelles Ein-Topf-Protokoll, um das Vorhandensein des Aptamer-Ziels in einer Probe von Interesse zu bestimmen. Die Ergebnisse können mit einer Standard-Kalibrierkurve verglichen werden, wenn eine Quantifizierung gewünscht wird.Der Einzelne muss beim Übertragen und Mischen der Lösungen sehr genau vorgehen, da ein unzureichendes Mischen zu negativen Ergebnissen führt. Stellen Sie außerdem sicher, dass Reagenzien und Lösungen bis zur Verwendung gekühlt aufbewahrt werden, um das Hintergrundsignal zu minimieren. Beginnen Sie mit der Aktivierung der Ribozym-Spaltprodukte, indem Sie fünf Einheiten der T4-Polynukleotidkinase in ein PCR-Röhrchen geben.Geben Sie dann einen Mikroliter vorbereiteten 5X-Ribozym-Puffer in jedes Probenröhrchen. Um die Spezifität visuell nachzuweisen, geben Sie 1,5 Mikroliter zweimillimolares Theophyllin oder zwei millimolares Koffein als Testproben in jedes Probenröhrchen und mischen Sie jede Probe gründlich durch fünf- bis 10-maliges Pipettieren. Als nächstes werden zwei Mikroliter 600 nanomolare RNA, die eine zielspezifische aptamere Domäne enthält, in jedes Probenröhrchen gegeben und anschließend pipettiert, um die Komponenten schnell zu mischen.Legen Sie nun die Röhre auf einen kalten Block, um das Hintergrundsignal zu minimieren. Nachdem Sie alle Reaktionsgefäße vorbereitet haben, inkubieren Sie jede Probe genau drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation legen Sie die Probenröhrchen sofort wieder in Eis ein.Geben Sie 3,5 Mikroliter Nicase-Polymerase-Enzymmischung in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es gut. Geben Sie dann 31,5 Mikroliter EXPAR-Reaktionsmischung mit Templatnukleotiden und Reaktionspuffer in jedes Probenröhrchen und mischen Sie es durch Pipettieren. Sobald alle Proben vorbereitet sind, inkubieren Sie die vorbereitete Probe bei 55 Grad Celsius fünf Minuten lang mit einem Timer.Setzen Sie die Probenröhrchen nach der Inkubation sofort wieder in das Eis ein. Geben Sie zwei Mikroliter Häminlösung in jedes Probenröhrchen für die Farbentwicklung und mischen Sie es gut. Geben Sie dann 58 Mikroliter der handelsüblichen TMB-Lösung in jedes Probenröhrchen, mischen Sie es gut und inkubieren Sie es für die Farbentwicklung.Lesen Sie die Proben qualitativ mit dem Auge ab oder quantifizieren Sie die Ergebnisse mit einem Absorptionsplattenleser, wie im Manuskript beschrieben. Das optimierte Konstrukt konnte in 30 Minuten nur 500 nanomolare Theophylline erkennen. Probenpräparate, die dem Target ausgesetzt sind, erzeugen eine blaue Farbe, während Proben, die kein Target enthalten, farblos bleiben.Aus dem am A450 gemessenen Signal wurde nach 30 Minuten Farbentwicklung eine Standardkurve erstellt. Es ist wichtig, die Proben auf Eis zu halten, wenn keine Inkubationen durchgeführt werden, da selbst die optimierte RNA immer noch eine geringe Hintergrundaktivität aufweist.

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Split-Hybridisierungssonde unter Verwendung eines DNA-Fluoreszenz-Leuchtaptamers als Signalreporter für die sequenzspezifische Nukleinsäureanalyse

Diese Studie präsentiert eine robuste Methode zur Isolierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraneinsätze, wodurch die Trennung von totalen Neuronen versus Neuriten und RNA-Reinigung ermöglicht wird. In Kombination mit RTddPCR ermöglicht der Ansatz eine absolute Quantifizierung von Low-Copy-Transkripten, was Studien zum mRNA-Transport und der lokalen Übersetzung mit hoher Sensitivität, Reproduzierbarkeit und breiter experimenteller Anwendbarkeit erleichtert.

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Lernen Sie eine schnelle Aptamer-basierte Methode zur Theophyllin-Detektion mittels isothermer G-Quadruplex-Amplifikation. Dieses Protokoll ermöglicht visuelle oder quantitative Ergebnisse mit minimalem Hintergrundsignal.

Aptamer-basierte Target-Detektion durch eine 3-stufige isotherme G-Quadruplex-Amplifikationsreaktion

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