Name: Quelle und Weg der Pyrrolizidinalkaloid-Kontamination in Teeproben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Erfahren Sie die zuverlässige Detektion von 15 Pyrrolizidinalkaloiden in Teeproben mittels Adsorbensmethode. Diese kostengünstige Technik ermöglicht effiziente Extraktion und bessere Wiederfindungsraten für Lebensmittelsicherheitsanalysen.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Scientific Foundation of China (32102244), dem National Agricultural Products Quality and Safety and Risk Assessment Project (GJFP2021001), der Natural Scientific Foundation of Anhui Province (19252002) und dem USDA (HAW05020H) unterstützt.

Für die vorliegende Studie wurden folgende Unkrautarten gesammelt: Ludwigia prostrata Roxb., Murdannia triquetra (Wall. ex C. B. Clarke) Bruckn., Ageratum conyzoides L., Chenopodium ambrosioides, Trachelospermum jasminoide (L.) Lem., Ageratum conyzoides L., Emilia sonchifolia (L.) DC, Ageratum conyzoides L. und Crassocephalum crepidioides (Benth.) S. Moore. Die frischen Teeblätter wurden von der Sorte Longjing 43# Teebäume gepflückt, und die getrockneten Teeproben waren kommerziell erhältlicher Tee, der nach dem Herstellungsverfahren für grünen Tee verarbeitet wurde (siehe Materialtabelle).
1. Probenentnahme
<ol><li>Sammle 40 echte Proben.<ol><li>Sammle zufällig 10 Unkraut, 10 Erde und 10 frische Teeblätter aus mehreren Teegärten. HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurde der Boden in einer Tiefe von 20 cm mit einer Probenmenge von 200 g beprobt.</li>
		<li>Sammle nach dem Zufallsprinzip 10 getrocknete Teeprodukte (250 g) aus einem Supermarkt.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammle Proben von Unkraut, Erde und frischen Teeblättern, um die Kontaminationsquelle von PAs im Tee zu untersuchen.<ol><li>Legen Sie fünf Probenahmepunkte im selben Teegarten fest, mit drei Wiederholungen an jedem Punkt.</li>
		<li>Sammeln Sie Ageratum conyzoides L. Unkrautproben mit dem höchsten PA-Gehalt, der üblicherweise in Teegärten zu finden ist. HINWEIS: Die Probenmenge betrug für die vorliegende Studie 250 g.</li>
		<li>Sammeln Sie die Bodenproben. HINWEIS: Bei den Bodenproben handelte es sich um rhizosphärischen Boden von A. conyzoides in einer Tiefe von 20 cm mit einer Probenmenge von 200 g.</li>
		<li>Sammle die frischen Teeblätter von verschiedenen Teilen der Teepflanzen, darunter eine Knospe mit zwei Blättern, eine Knospe mit drei Blättern, eine Knospe mit vier Blättern und reife Blätter. HINWEIS: Die Probenmenge betrug 250 g.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Probenbehandlung
<ol><li>Behandeln Sie die Proben vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Mahlen Sie die getrockneten Tee- und Bodenproben mit einer Mühle, passieren Sie die pulverisierten Proben durch ein 200-Mesh-Sieb und lagern Sie sie bei −20 °C. HINWEIS: Der getrocknete Tee war ein handelsübliches Teeprodukt (siehe Materialtabelle), daher wurde er zur Lagerung direkt zerkleinert und gesiebt. Die Bodenproben (200 g) wurden an einem belüfteten Ort im Dunkeln etwa eine Woche lang an der Luft getrocknet.</li>
		<li>Homogenisieren Sie das Gras und die frischen Teeblätter mit einem Homogenisator und lagern Sie sie bei −20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine Probebehandlung der getrockneten Teeprodukte, der frischen Teeblätter und des Unkrauts durch.<ol><li>Wiegen Sie 1,00 g jeder Probe (getrocknete Teeprodukte, frische Teeblätter und Unkraut) ab und geben Sie sie in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml 0,1 mol/l Schwefelsäurelösung hinzu und wirbeln Sie 2 min lang für die Festphasenextraktion (mit SPE-Kartusche, siehe Materialtabelle) und 1 min für die Adsorptionsmittelreinigung. Führen Sie die Ultraschallextraktion23 15 Minuten lang durch und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 9.390 x g bei Raumtemperatur. Anmerkungen: Die Leistung des Ultraschalloszillators betrug 290 W, die Schwingungsfrequenz 35 kHz und die Temperatur war auf 30 °C eingestellt.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Pipette mit Kunststoffspitze.</li>
		<li>Befolgen Sie die obigen Schritte, um die Extraktion einmal zu wiederholen. Kombinieren Sie die beiden Überstände.<ol><li>Aktivieren Sie die SPE-Kartuschen mit 5 ml Methanol und 5 ml deionisiertem Wasser. Geben Sie 10 ml Überstand in die voraktivierte Kartusche und führen Sie eine Probenreinigung durch.</li>
			<li>Nachdem der Füllstand der Probenlösung die obere Schicht der Kartuschen erreicht hat, werden die Analyten mit 5 mL 1%iger Ameisensäurelösung und dann 5 mL Methanol eluiert. Verwerfen Sie das Eluat.</li>
			<li>Mit 5 mL Methanol (mit 0,5 % Ammoniakwasser) eluiert, das Eluat durch einen 0,22 μm Membranfilter filtrieren und mittels UPLC-MS/MS analysieren (siehe Materialtabelle).</li>
		</ol></li>
		<li>Führen Sie eine Probenreinigung mit Adsorptionsmitteln durch.<ol><li>2 ml des Überstandes (Schritt 2.2.4) werden in ein 10-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben, das mit den Adsorptionsmitteln von GCB:PSA:C18 (10 mg:20 mg:15 mg, siehe Materialtabelle) gefüllt ist, 1 min lang vortexiert und bei 9.390 x g 8 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
			<li>1 ml des Überstands wird vor der Analyse mittels UPLC-MS/MS durch einen 0,22 μm Membranfilter geleitet.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie eine Behandlung der Bodenproben durch.<ol><li>Wiegen Sie eine 1,00 g Bodenprobe. Geben Sie es in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 0,1 ml 0,1 mol/l Trinatriumcitratlösung hinzu (siehe Materialtabelle), um den pH-Wert des Bodens auf 6,0 einzustellen.</li>
		<li>2 Minuten stehen lassen und dann 10 ml 0,1 mol/l Schwefelsäure-Methanollösung hinzufügen, 2 Minuten lang wirbeln und 30 Minuten schütteln und dann 30 Minuten lang eine Ultraschallextraktion durchführen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 9.390 x g und übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette mit Kunststoffspitze in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Befolgen Sie die obigen Schritte, um die Extraktion zu wiederholen und den Überstand zweimal zu kombinieren. ANMERKUNG: Die Reinigungsmethode war die gleiche wie in Schritt 2.2.5.1 und Schritt 2.2.5.2.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Instrumentelle Analyse
<ol><li>Nachweis der 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Gras und Erde (Proben aus Schritt 2) mit einem handelsüblichen UPLC-MS/MS-System (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Stellen Sie die Säulentemperatur auf 40 °C, die Durchflussrate auf 0,250 ml/min und das Injektionsvolumen auf 3 μl ein.</li>
	<li>Stellen Sie die mobile Phase A ein: Methanol (enthält 0,1 % Ameisensäure + 1 mmol/l Ammoniumformiat) und die mobile Phase B: Wasser (enthält 0,1 % Ameisensäure + 1 mmol/l Ammoniumformiat).</li>
	<li>Stellen Sie ein Gradientenelutionsverfahren ein: 10 % A von 0,0 min bis 0,25 min, 10 %-30 % A von 0,25 min bis 6,0 min, 30 %-40 % A von 6,0 min bis 9,0 min, 40 %-98 % A von 9,0 min bis 9,01 min, das 1,9 min gehalten wurde, und 98 %-100 % A von 11,0 min bis 11,1 min, das 2,9 min gehalten wurde.</li>
	<li>Stellen Sie die Parameter des Massenspektrometers ein: Ionisationsmodus, Elektrospray-positive Ionenquelle (ESI+); Zerstäuberdruck, 7,0 bar; Kapillarspannung, 4,0 kV; Kegelloch-Rückblasstrom, 150 l/h; Lösemittelgasdurchfluss, 800 l/h; Lösemitteltemperatur, 400 °C; Aufprallgasstrom, 0,25 ml/min.</li>
</ol>

<ol><li>Schramm, S., Kohler, N., Rozhon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolizidine+alkaloids%3A+Biosynthesis%2C+biological+activities+and+occurrence+in+crop+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Pyrrolizidine alkaloids: Biosynthesis, biological activities and occurrence in crop plants.</a> Molecules. 24 (3), 498(2019).</li>
<li>EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientific+opinion+on+pyrrolizidine+alkaloids+in+food+and+feed%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">Scientific opinion on pyrrolizidine alkaloids in food and feed.</a> EFSA Journal. 9 (11), 134(2011).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+and+regulation+of+hepatotoxic+pyrrolizidine+alkaloids+in+food%3A+A+critical+review+of+recent+research%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Determination and regulation of hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids in food: A critical review of recent research.</a> Food and Chemical Toxicology. 119, 50-60 (2018).</li>
<li>Keuth, O., Humpf, H. U., Fürst, P. Pyrrolizidine Alkaloids: Analytical Challenges. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeuth%2C+O+%22Encyclopedia+of+Food+Chemistry%22">Encyclopedia of Food Chemistry</a>. Melton, L., Shahidi, F., Varelis, P. 1, Elsevier. 348-355 (2019).</li>
<li>Huang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolizidine+alkaloids+and+its+source+analysis+in+tea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Safety+%26+Quality%22%5BJournal%5D)">Pyrrolizidine alkaloids and its source analysis in tea.</a> Journal of Food Safety & Quality. 9 (2), 229-236 (2018).</li>
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<li>Li, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+study+of+pyrrolizidine+alkaloid-induced+hepatic+sinusoidal+obstruction+syndrome+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Proteomic study of pyrrolizidine alkaloid-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in rats.</a> Chemical Research in Toxicology. 28 (9), 1715-1727 (2015).</li>
<li>Jia, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+enantioselective+synthesis+of+a+pyrrolizidine-alkaloid-inspired+compound+collection+with+antiplasmodial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Catalytic enantioselective synthesis of a pyrrolizidine-alkaloid-inspired compound collection with antiplasmodial activity.</a> The Journal of Organic Chemistry. 83, 7033-7041 (2018).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+evidence+of+pyrrolizidine+alkaloid+N-oxide-induced+hepatic+sinusoidal+obstruction+syndrome+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">First evidence of pyrrolizidine alkaloid N-oxide-induced hepatic sinusoidal obstruction syndrome in humans.</a> Archives of Toxicology. 91 (12), 3913-3925 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Huo, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+veno-occlusive+disease+associated+with+toxicity+of+pyrrolizidine+alkaloids+in+herbal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Netherlands+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatic veno-occlusive disease associated with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations.</a> Netherlands Journal of Medicine. 68 (6), 252-260 (2010).</li>
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<li>Kowalczyk, E., Kwiatek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+sum+parameter+method+for+the+determination+of+pyrrolizidine+alkaloids+in+teas%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">Application of the sum parameter method for the determination of pyrrolizidine alkaloids in teas.</a> Food Additives & Contaminants: Part A. 37 (4), 622-633 (2020).</li>
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<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolizidine+alkaloids+in+tea%3A+A+review+of+analytical+methods%2C+contamination+levels+and+health+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolizidine alkaloids in tea: A review of analytical methods, contamination levels and health risk.</a> Food Science. 42 (17), 255-266 (2021).</li>
<li>Nowak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecific+transfer+of+pyrrolizidine+alkaloids%3A+An+unconsidered+source+of+contaminations+of+phytopharmaceuticals+and+plant+derived+commodities%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interspecific transfer of pyrrolizidine alkaloids: An unconsidered source of contaminations of phytopharmaceuticals and plant derived commodities.</a> Food Chemistry. 213, 163-168 (2016).</li>
<li>Selmar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+pyrrolizidine+alkaloids+between+living+plants%3A+A+disregarded+source+of+contaminations%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Transfer of pyrrolizidine alkaloids between living plants: A disregarded source of contaminations.</a> Environmental Pollution. 248, 456-461 (2019).</li>
<li>Izcara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+and+modified+QuEChERS+method+with+mesostructured+silica+as+clean-up+sorbent+for+pyrrolizidine+alkaloids+determination+in+aromatic+herbs%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Miniaturized and modified QuEChERS method with mesostructured silica as clean-up sorbent for pyrrolizidine alkaloids determination in aromatic herbs.</a> Food Chemistry. 380, 132189(2022).</li>
<li>Izcara, S., Casado, N., Morante-Zarcero, S., Sierra, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniaturized+QuEChERS+method+combined+with+ultrahigh+liquid+chromatography+coupled+to+tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+pyrrolizidine+alkaloids+in+oregano+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">A miniaturized QuEChERS method combined with ultrahigh liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids in oregano samples.</a> Foods. 9 (9), 1319(2020).</li>
<li>Van Wyk, B. E., Stander, M. A., Long, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senecio+angustifolius+as+the+major+source+of+pyrrolizidine+alkaloid+contamination+of+rooibos+tea+%28Aspalathus+linearis%29%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Senecio angustifolius as the major source of pyrrolizidine alkaloid contamination of rooibos tea (Aspalathus linearis).</a> South African Journal of Botany. 110, 124-131 (2017).</li>
<li>Johnson, A. E., Molyneux, R. J., Merrill, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+toxic+range+plants.+Variation+in+pyrrolizidine+alkaloid+content+of+Senecio%2C+Amsinckia%2C+and+Crotalaria+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry of toxic range plants. Variation in pyrrolizidine alkaloid content of Senecio, Amsinckia, and Crotalaria species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 33 (1), 50-55 (1985).</li>
<li>Vrieling, K., de Vos, H., van Wijk, C. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+concentrations+of+pyrrolizidine+alkaloids+in+Senecio+jacobaea%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the concentrations of pyrrolizidine alkaloids in Senecio jacobaea.</a> Phytochemistry. 32 (5), 1141-1144 (1993).</li>
<li>Han, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+optimization%2C+validation+and+application+of+ultra+high+performance+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+pyrrolizidine+alkaloids+and+pyrrolizidine+alkaloid+N-oxides+in+teas+and+weeds%5BTitle%5D)+AND+%22Food+control%22%5BJournal%5D)">Development, optimization, validation and application of ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for the analysis of pyrrolizidine alkaloids and pyrrolizidine alkaloid N-oxides in teas and weeds.</a> Food control. 132, 108518(2022).</li>
<li>Bodi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+pyrrolizidine+alkaloids+in+tea%2C+herbal+drugs+and+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">Determination of pyrrolizidine alkaloids in tea, herbal drugs and honey.</a> Food Additives & Contaminants: Part A. 31 (11), 1886-1895 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine effektive, sensitive Methode zu entwickeln, um die Kontaminationswege und Quellen von PAs in Teeproben sowie die Verteilung von PAs in verschiedenen Teilen der Teepflanzen zu untersuchen. In dieser Studie konnten jedoch nur 15 PAs erfolgreich auf der chromatographischen Säule abgetrennt werden, was im Vergleich zu der großen Anzahl von Alkaloiden in Pflanzenarten eine sehr geringe Anzahl ist 3,4. Dies bezog sich nicht nur...

Als Sekundärmetaboliten schützen Pyrrolizidinalkaloide (PAs) Pflanzen vor Pflanzenfressern, Insekten und Krankheitserregern 1,2. Bisher wurden in mehr als 6.000 Pflanzenarten weltweit über 660 PAs und PA-N-Oxide (PANOs) mit unterschiedlichen Strukturen gefunden 3,4. PA-produzierende Pflanzen kommen hauptsächlich in den Familien Asteraceae, Boraginaceae, Fabaceae und Apocynaceaevor 5,6. PAs werden leicht zu instabilen Dehydropyrrolizidinalkaloiden oxidiert, die eine starke Elektrophilie aufweisen und Nukleophile wie DNA und Proteine angreifen können, was zu Leberzellnekrosen, Venenverschlüssen, Zirrhose, Aszites und anderen Symptomen führt 7,8. Das Hauptzielorgan der PA-Toxizität ist die Leber. PAs können auch Lungen-, Nieren- und andere Organtoxizität sowie erbgutverändernde, krebserregende und entwicklungsbedingte Toxizität verursachen 9,10.
In vielen Ländern wurden Fälle von Vergiftungen bei Mensch und Tier gemeldet, die auf den Verzehr traditioneller Kräuter, Nahrungsergänzungsmittel oder Tees zurückzuführen sind, die PA enthalten, oder auf die indirekte Kontamination von Lebensmitteln wie Milch, Honig oder Fleisch (giftig durch den Verzehr von PAshaltigen Weideflächen)11,12,13. Die Ergebnisse der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) deuten darauf hin, dass Stoffe wie (Kräuter-)Tee eine wichtige Quelle für die Exposition des Menschen gegenüber PAs/PANOs sind14. Teeproben produzieren keine PAs, während PA-produzierende Pflanzen häufig in Teegärten zu finden sind (z. B. Emilia sonchifolia, Senecio angulatus und Ageratum conyzoides)15. Bisher wurde vermutet, dass der Tee bei der Ernte und Verarbeitung mit PAs aus den produzierenden Werken verunreinigt sein könnte. PAs wurden jedoch auch in einigen handgepflückten Teeblättern (d. h. in keinen PA-produzierenden Pflanzen) nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass es andere Kontaminationswege oder -quellen geben muss16. Es wurde ein Co-Kultivierungsexperiment von Kreuzkraut (Senecio jacobaea) mit Melisse (Melissa officinalis), Pfefferminze (Mentha piperita), Petersilie (Petroselinum crispum), Kamille (Matricaria recutita) und Kapuzinerkresse (Tropaeolum majus) durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass PAs in all diesen Pflanzen nachgewiesen wurden17. Es wurde nachgewiesen, dass PAs tatsächlich über den Boden zwischen lebenden Pflanzen übertragen und ausgetauscht werden18,19. Van Wyk et al.20 fanden heraus, dass Rooibos-Tee (Aspalathus linearis) an unkrautreichen Standorten stark kontaminiert war und PAs der gleichen Art und des gleichen Anteils enthielt. Es wurden jedoch keine PAs in Rooibos-Tee an unkrautfreien Standorten nachgewiesen.
Gegenwärtig wird die Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) mit hoher Selektivität und Sensitivität häufig bei der qualitativen und quantitativen Analyse von PA in landwirtschaftlichen Erzeugnissen und Lebensmitteln eingesetzt21,22. Die Probenbehandlungsmethode besteht in der Regel entweder aus der Festphasenextraktion (SPE) oder der QuEChERS-Aufreinigung (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe) von Extrakten komplexer Lebensmittelmatrices, mit denen die höchstmögliche Empfindlichkeit erreicht werden kann12,19. Es fehlen jedoch noch robuste Analysemethoden, die den Nachweis und die Quantifizierung von PAs in komplexen Matrices wie Erde, Unkraut und frischen Teeblättern ermöglichen.
In dieser Studie wurden 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Unkräutern und rhizosphärischen Bodenproben mit UPLC-MS/MS in Kombination mit einer Adsorptionsmittelreinigungsmethode analysiert. Darüber hinaus wurden 15 gepaarte unkraut- und unkrautrhizosphärische Bodenproben und 60 frische Teeblattproben an fünf Probenahmestellen im Teegarten Jinzhai in der Provinz Anhui, China, entnommen und auf 15 PAs analysiert. Diese Ergebnisse können eine Erhebungsmethode und einige Informationen über die Quelle und den Weg von PAs (Kontamination) in Teeproben liefern, um die Qualität und Sicherheit des Tees zu gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>Acetonitril (99,9 %)</td><td>Tedia Company,Inc.</td><td>21115197</td><td>CAS-Nr.: 75-05-8</td></tr><tr><td>Ammoniak (25%-28%)</td><td>Wuxi Zhanwang Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td>181210</td><td>CAS-Nr.: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Ammoniumformiat (97,0 %)</td><td>Anpel Laboratory Technoiogies (Shanghai)</td><td>G0860050</td><td>CAS-Nr.: 540-69-2</td></tr><tr><td>Carbon-GCB</td><td>CNW</td><td>B7760030</td><td>120-400 MESH, 10 g pro Karton</td></tr><tr><td>Zentrifuge Z 36 HK</td><td>HERMLE</td><td>Z36HK</td><td>30000&nbsp; U/min (min:10 rpm), Abmessungen (B x H x T):&nbsp; 71,5 cm&mal; 42 cm & mal; 51 cm</td></tr><tr><td>Handelsübliches Teeprodukt</td><td>Lvming, Qingshan, Luyuchun, Changling, Huixing, Wuyunjian, Heshengchun</td><td>loser Tee</td><td>Grüner Tee</td></tr><tr><td>Europin N-oxid (EuNO) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>323256</td><td>CAS-Nr:65582-53-8</td></tr><tr><td>Europine (Eu) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>98222</td><td>CAS-Nr:570-19-4</td></tr><tr><td>Formiat (98,0%)</td><td>Aladdin</td><td>E2022005</td><td>CAS-Nr:64-18-6</td></tr><tr><td>HC-C18</td><td>CNW</td><td>D2110060</td><td>40-63 &mu; m,100g.pro Box</td></tr><tr><td>Heliotrin (He) (98.0%)</td><td>BioCrick</td><td>906426</td><td>CAS-Nr.:303-33-3</td></tr><tr><td>Heliotrin-N-oxid (HeNO) (98.0%)</td><td>BioCrick</td><td>22581</td><td>CAS-Nr.:6209-65-0</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge TG16-WS</td><td>Genauigkeit</td><td>203158000</td><td>Max:16000 U/min, 330 & mal 390 x 300 mm (L & mal ; W &mal; H), Kapazität: 6 & mal; 50 mL</td></tr><tr><td>HSS T3 Säule</td><td>Wasser</td><td>186004976</td><td>ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 & mal 100 mm 1,8 &mu; m)</td></tr><tr><td>Intermediin (Im) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>114843</td><td>CAS-Nr:10285-06-0</td></tr><tr><td>Intermedine-N-oxid (ImNO) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>340066</td><td>CAS-Nr:95462-14-9</td></tr><tr><td>Jacobine (Jb) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>132282048</td><td>CAS-Nr:6870-67-3</td></tr><tr><td>Jacobin-N-oxid (JbNO) (98,0%)</td><td>ChemFaces</td><td>CFN00461</td><td>CAS-Nr:38710-25-7</td></tr><tr><td>Methylalkohol (99,9%)</td><td>Tedia Unternehmen, Inc.</td><td>21115100</td><td>CAS-Nr.: 67-56-1</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Agela</td><td>P19-00833</td><td>40-60 &mu; m, 60 & Aring; 100g.pro Packung</td></tr><tr><td>Retrorsin (Re) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>5281743</td><td>CAS-Nr:480-54-6</td></tr><tr><td>Retrorsin-N-oxid (ReNO) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>5281734</td><td>CAS-Nr:15503-86-3</td></tr><tr><td>Senecionin (Sc) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>5280906</td><td>CAS-Nr:130-01-8</td></tr><tr><td>Senecionin-N-oxid (ScNO) (98,0%)</td><td>BioCrick</td><td>5380876</td><td>CAS-Nr:13268-67-2</td></tr><tr><td>Seneciphyllin N-Oxid (SpNO) (98,0 %)</td><td>BioCrick</td><td>6442619</td><td>CAS-Nr.: 38710-26-8</td></tr><tr><td>Seneciphyllin (Sp) (98,0 %)</td><td>BioCrick</td><td>5281750</td><td>CAS-Nr.: 480-81-9</td></tr><tr><td>Senkirkin (Sk) (98,0 %)</td><td>BioCrick</td><td>5281752</td><td>CAS-Nr.: 2318-18-5</td></tr><tr><td>SPE PCX</td><td>Agilent Technologies</td><td>12108206</td><td>Cation Mixed Mode, 6 mL</td></tr><tr><td>Schwefelsäure (97 %)</td><td>Wuxi Zhanwang Chemical Reagent Co., Ltd. </td><td>1003019</td><td>CAS-Nr.: 7664-93-9</td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat</td><td>Sinpharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.</td><td>20121009</td><td>CAS-Nr.: 6132-04-3</td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Supmile</td><td>KQ-600B</td><td>Innere Schlitzgröße: 500 x 300 x 150 mm; Kapazität: 22,5 L</td></tr><tr><td>UPLC-xevoTQMS</td><td>Waters</td><td>ZPLYY-003</td><td>Dreifacher vierstufiger Stabmassenanalysator, Waters Alliance 2695/Waters ACQUITY UPLC Flüssigphasensystem</td></tr><tr><td>Wasserbadthermostat Oszillator</td><td>Guoyu Instrument</td><td>SHY-2AHS</td><td>Oszillationszeiten: &nbsp; 60-300 mal/min, Konstanter Temperaturbereich: Raumtemperatur bis 100 &Grad; C</td></tr></tbody></table>

quelle und weg der pyrrolizidinalkaloid-kontamination in teeproben

Source and Route of Pyrrolizidine Alkaloid Contamination in Tea Samples

In Teeproben werden giftige Pyrrolizidinalkaloide (PAs) gefunden, die eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen. Die Quelle und der Weg der PA-Kontamination in Teeproben blieben jedoch unklar. In dieser Arbeit wurde eine Adsorptionsmethode in Kombination mit UPLC-MS/MS entwickelt, um 15 PAs im Unkraut Ageratum conyzoides L., A. conyzoides rhizosphärischem Boden, frischen Teeblättern und getrockneten Teeproben zu bestimmen . Die durchschnittlichen Gewinnungsraten lagen zwischen 78 % und 111 %, mit relativen Standardabweichungen von 0,33 % bis 14,8 %. Fünfzehn Paare rhizosphärischer Bodenproben von A. conyzoides und A. conyzoides sowie 60 frische Teeblattproben wurden aus dem Teegarten Jinzhai in der Provinz Anhui, China, entnommen und auf die 15 PAs analysiert . Nicht alle 15 PAs wurden in frischen Teeblättern nachgewiesen, mit Ausnahme von Intermedin-N-oxid (ImNO) und Senecionin (Sn). Der Gehalt an ImNO (34,7 μg/kg) war höher als der von Sn (9,69 μg/kg). Darüber hinaus konzentrierten sich sowohl ImNO als auch Sn in den jungen Blättern der Teepflanze, während ihr Gehalt in den alten Blättern geringer war. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PAs im Tee über den Weg von PA-produzierenden Unkräutern-Boden-frischen Teeblättern in Teegärten übertragen wurden.

Die optimierte Adsorptionsmittelreinigungs- und Analysemethode von 15 PAs in getrockneten Teeproben, frischen Teeblättern, Unkräutern und Erde wurde etabliert und mit der üblicherweise verwendeten Reinigungsmethode unter Verwendung der SPE-Kartusche verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wiederfindungsraten der 15 PAs in getrockneten Teeproben, Gras und frischen Teeblättern unter Verwendung der SPE-Kartusche 72 % bis 120 % betrugen, während die Wiederfindung unter Verwendung der Adsorptionsmittelreinigung 78 % bis ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Kontamination von Pyrrolizidinalkaloiden (PAs) in Teeproben von PA-produzierenden Unkräutern in Teegärten.

Quelle und Weg der Pyrrolizidinalkaloid-Kontamination in Teeproben

Toxic pyrrolizidine alkaloids (PAs) are found in tea samples, which pose a threat to human health. However, the source and route of PA contamination in ...

Die Entwicklung einer Nachweismethode für 15 Pyrrolizidinalkaloide in Unkraut, Erde, frischen Teeblättern und trockenen Teeproben kann technische Unterstützung bei der Erforschung der Quelle der Kontamination mit Pyrrolizidinalkaloiden in Tee bieten. Im Vergleich zur Festphasenextraktion kann die Adsorptionsmethode für Bodenproben Zeit, geringere Kosten und bessere Ausbeute für die Analyse von Pyrrolizidinalkaloiden sparen. Um mit der Extraktion der vorgewärmten getrockneten Teeprodukte, frischen Teeblätter oder Unkräuter zu beginnen, wiegen Sie ein Gramm einer Probe in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und geben Sie 10 Milliliter 0,1 Mol pro Liter Schwefelsäurelösung in das Röhrchen.Als nächstes wird die Probe zwei Minuten lang vortexiert, wenn sie mit Festphasenextraktion analysiert werden soll, und eine Minute lang, wenn sie mit Adsorptionsmittelreinigung analysiert werden soll. Anschließend wird die Probe 15 Minuten lang einer Ultraschallextraktion unterzogen, gefolgt von einer Zentrifugation bei 9.390 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie dann die überstehende Lösung mit einer Pipette mit Kunststoffspitze in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Nachdem Sie die Extraktion zweimal durchgeführt haben, kombinieren Sie die Überstände im Röhrchen. Um die Extraktion auf dem vorbereiteten Boden zu starten, wiegen Sie ein Gramm einer Probe in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 0,1 Milliliter 0,1 Mol pro Liter Trinatriumcitratlösung hinzu, um den pH-Wert des Bodens auf 6,0 einzustellen, und lassen Sie die Probe zwei Minuten lang stehen.Geben Sie dann 10 Milliliter 0,1 Mol pro Liter Schwefelsäure-Methanollösung in das Röhrchen und wirbeln Sie die Probe zwei Minuten lang, gefolgt von 30 Minuten Schütteln. Führen Sie als Nächstes die Ultraschallextraktion 30 Minuten lang durch, wie zuvor gezeigt. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 9.390 G.Übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette mit Kunststoffspitze in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nachdem Sie die Extraktion zweimal durchgeführt haben, kombinieren Sie die Überstände. Aktivieren Sie die Festphasenextraktion oder SPE-Kartusche mit fünf Millilitern Methanol, gefolgt von fünf Millilitern deionisiertem Wasser.Nach der Aktivierung werden 10 Milliliter des Überstands aus der Probenentnahme in die voraktivierte Kartusche gegeben. Nachdem der Füllstand der Probenlösung die obere Schicht der Kartuschen erreicht hat, eluieren Sie die Probenmatrix mit fünf Millilitern 1%iger Ameisensäurelösung, gefolgt von fünf Millilitern Methanol, und verwerfen Sie die Eluenten. Anschließend werden die Analyten mit fünf Millilitern Methanol eluiert, das 0,5 % Ammoniakwasser enthält.Filtern Sie den Eluenten durch einen 0,22-Mikron-Membranfilter, um ihn mittels UPLC-MS/MS zu analysieren. Um die Probenaufreinigung mit Adsorptionsmittel durchzuführen, bereiten Sie ein 10-Milliliter-Zentrifugenröhrchen vor, in dem das Adsorptionsmittel GCB, PSA und C18 im Verhältnis von 10 bis 20 bis 15 Milligramm enthält. Geben Sie dann zwei Milliliter des nach der Probenbehandlung gewonnenen Überstands hinzu.Als nächstes wird die Mischung aus Probe und Adsorptionsmittel eine Minute lang gewirbelt und bei 9.390 G acht Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Filtrieren Sie einen Milliliter des resultierenden Überstands durch einen 0,22-μm-Membranfilter in ein Probenfläschchen, bevor Sie ihn mittels UPLC-MS/MS analysieren. In der Studie wurde eine höhere prozentuale Rückgewinnung von 15 Pyrrolizidinalkaloiden aus frischen Teeblättern, getrockneten Teeproben und Gras mit der Adsorptionsmittelreinigungstechnik im Vergleich zur SPE-Kartuschenmethode erzielt.Die Wiederfindungsraten der Alkaloide im Boden mittels Adsorptionsmittelreinigung betrugen 79 bis 111 %.In den frischen Teeblättern, die an den fünf Probenahmestellen gesammelt wurden, wurde ein höherer Gehalt an intermedinem N-Oxid als an Senecionin nachgewiesen. Senecionin wurde in reifen Blättern der Probenahmestellen eins und zwei nicht nachgewiesen. Von den 11 Pyrrolizidinalkaloiden wurde nur intermedines N-oxid im Boden nachgewiesen, während Senecionin und intermedines N-oxid in verschiedenen Teilen der Teepflanzen nachgewiesen wurden.Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Gehalt an Intermedine N-oxid in einer Knospe mit zwei Blättern am höchsten ist. Wenn Sie dies zuerst versuchen, ist es am wichtigsten, 0,1 Milliliter 0,1 Mol pro Liter Trinatriumcitratlösung hinzuzufügen, um den pH-Wert Ihres Bodens auf 6,0 einzustellen. Diese Methode kann auf die Analyse von Alkaloiden in anderen essbaren Pflanzen angewendet werden und bietet auch eine natürliche Technik zur Erforschung der Quelle von Alkaloiden in ihnen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

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Quelle und Weg der Pyrrolizidinalkaloid-Kontamination in Teeproben

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