Name: Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Mechanik poroelastischer Actomyosin-Gele als Modellsystem des Zellzytoskeletts. Diese in-vitro-Methode ermöglicht die Quantifizierung von Gel- und Lösungsmitteldynamik ohne aufwendige Geräte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir bedanken uns bei Dina Aranovich für die Proteinreinigung und -kennzeichnung. G.L. dankt dem israelischen Ministerium für Wissenschaft, Technologie und Raumfahrt für das Jabotinsky-Promotionsstipendium. A.B.G. dankt der Israel Science Foundation (Grant 2101/20) und dem Ministry of Science and Technology - State of Israel (Grant 3-17491) für die finanzielle Unterstützung.

1. Glasoberflächenbehandlung und Passivierung:
HINWEIS: Dieser Abschnitt umfasst drei Hauptschritte (siehe Abbildung 1): (i) Reinigung und Hydrophilierung, (ii) Silanisierung und (iii) Oberflächenpassivierung.
<ol><li>Reinigung und Hydrophilierung<ol><li>Verwenden Sie Piranha-Lösung für die Reinigung von Glasoberflächen. HINWEIS: Die Piranha-Lösung ist ein Gemisch aus 30 % H2 O2 und 70 %H2 SO4 (Materialtabelle). Sein Hauptziel ist es, organische Verunreinigungen von Deckglasoberflächen zu entfernen und die OH-Gruppen auf der Glasoberfläche freizulegen. Auf diese Weise wird die Glasoberfläche hydrophil.</li>
		<li>Legen Sie 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) Glasdeckgläser (Materialtabelle) in einen selbstgebauten Polytetrafluorethylenhalter (Grundfläche: 5,5 cm x 5,5 cm). Übertragen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein 400-ml-Becherglas (Materialtabelle) und inkubieren Sie ihn 2 h lang mit 300 ml Piranha-Lösung. Führen Sie diesen Schritt auf Eis und in einer chemischen Haube durch. Anmerkungen: Die an der Halterbasis verschraubte Polytetrafluorethylenstange ist 12 cm lang und damit länger als der Becher (11 cm), was ein sicheres Umsetzen/Herausziehen des Halters in/aus der Piranha-Lösung ermöglicht. Da die Piranha-Lösung immer noch sehr reaktiv und sehr heiß sein kann, ist es unbedingt erforderlich, die Reaktion zu stoppen. Der einfachste Weg, die Reaktion zu stoppen, besteht darin, die Piranha-Lösung in (Leitungs-)Wasser zu gießen, um eine 50-fache Verdünnung (mindestens) zu erreichen. Die Lösung kann dann bedenkenlos entsorgt werden. Bewahren Sie die gebrauchte Piranha-Lösung niemals in einer geschlossenen Glasflasche auf – dies könnte zu einer Flaschenexplosion führen.</li>
		<li>Füllen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein sauberes Becherglas, das mit frischem doppelt destilliertem Wasser (DDW) gefüllt ist, um überschüssigen Piranha von den Deckgläsern zu waschen.</li>
		<li>Füllen Sie das Becherglas in ein Beschallungsbad (Materialtabelle) und beschallen Sie es 10 Minuten lang bei 80 Hz bei voller Leistung bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male mit frischem DDW. Verwenden Sie jedes Mal frisches DDW.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanisierung<ol><li>Füllen Sie den Halter in ein sauberes Becherglas (400 ml), das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist (Materialtabelle) und dann in ein Beschallungsbad (Materialtabelle). Beschallung bei 80 Hz bei voller Leistung für 30 min bei 25 °C.</li>
		<li>Nach der Beschallung wird der Halter in eine Silanlösung überführt, die mit 15 ml DDW, 3,1 ml Essigsäure (Materialtabelle), 340 ml Methanol und 7,6 ml Silan ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan) hergestellt wurde (Materialtabelle). Den Becher mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren. Anmerkungen: Die Herstellung und Handhabung der Silanlösung muss in einer chemischen Haube erfolgen. Geben Sie nach dem Silanisierungsschritt die verbrauchte Silanlösung (Abfall) in eine spezielle Glasflasche in der Chemikalienhaube.</li>
		<li>Am nächsten Tag wird der Halter für 15 s in ein sauberes Becherglas gefüllt, das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist. Setzen Sie dann den Halter in ein sauberes Becherglas ein, nicht bevor Sie den Boden des Polytetrafluorethylenhalters getrocknet haben, um überschüssiges Methanol zu entfernen. Stellen Sie das Becherglas in den Ofen (Materialtabelle), um die Glasdeckgläser 5 min bei 120 °C zu trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Oberflächenpassivierung mit einem inerten Polymer<ol><li>Erreichen Sie eine Oberflächenpassivierung, indem Sie die Glasdeckgläser mit einem inerten Polymer inkubieren (Materialtabelle). Nehmen Sie für jedes Experiment zwei Deckgläser und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit einer Parafilmschicht beschichtet ist, die zunächst mit Ethanol (EtOH) gereinigt wurde (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (Materialtabelle).</li>
		<li>Inkubieren Sie jedes Deckglas mit 1 ml eines 4 mg·ml−1 5 kDa molekularen Methoxy-Polyethylenglykolmaleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Materialtabelle) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Materialtabelle) für 1 h bei 22 °C. Anmerkungen: Durch das Platzieren der Deckgläser auf einer hydrophoben Parafilmschicht wird die hydrophile PEG-Polymerlösung auf die Oberfläche des Glasdeckglases beschränkt. Die Inkubationszeit ist entscheidend für eine optimale Passivierung. Verwenden Sie die Inkubationszeiten zwischen 45 min und 2 h. Oberhalb dieser Inkubationszeit kann sich die Oberfläche der Glasdeckgläser verschlechtern, was zu Proteinadhäsion und Transparenzverlust führt.</li>
		<li>Spülen Sie am Ende des Inkubationsprozesses jedes Deckglas mit 5 ml DDW aus und trocknen Sie es mit einem Fluss vonN2 (Gas). Trocknen Sie die Deckgläser nicht unter Vakuum. Da die Deckgläser nach der Passivierung feucht gehalten werden müssen, geben Sie sofort 1 ml 10 mM Tris auf die pegylierten Oberflächen. Verwenden Sie die Deckgläser innerhalb von 2 Stunden. Anmerkungen: Die verschiedenen Schritte müssen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden, um eine Kontamination der Glasoberfläche zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protein-Reinigung
<ol><li>Reinigen Sie G-Aktin aus Acetonpulver der Skelettmuskulatur von Kaninchen mit der Gelfiltrationsmethode24.<ol><li>Die Aktinreinigung dauert 1 Woche. Bewahren Sie das gereinigte G-Aktin in G-Puffer auf (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP und 1 mM DTT) und lagern Sie es auf Eis. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 2 Wochen. Anmerkungen: Ersetzen Sie das Eis alle paar Tage.</li>
		<li>Markierung des Aktins mit einem maleimidmodifizierten Fluoreszenzfarbstoff16 (Materialtabelle). Reinigen Sie das GST-Fascin nach der Methode von Ono et al.25. Beide Proteine werden in flüssigem N2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie ein Standardprotokoll zur Aufreinigung von Myosin II aus dem Skelettmuskel26 des Kaninchens. Der gereinigte Myosin-II-Puffer (Dimere) enthält 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl und 35 % w/v Saccharose. Das Myosin wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert. Anmerkungen: Die hohe Konzentration von KCl hält die Myosinmotoren in einer dimeren Form, während der hohe Anteil an Saccharose sicherstellt, dass die Aktivität der Motoren beim Einfrieren nicht beeinträchtigt wird. Verwenden Sie eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten, wenn Sie mit Myosin II-Stammlösungen arbeiten (Materialtabelle).<ol><li>Markierung der Myosin-II-Dimere mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Materialtabelle) an Paaren von technisch hergestellten Cysteinresten19,27. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine Hühnermagen-RLC-Mutante A26. Das markierte Myosin II wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert. HINWEIS: Dieses Markierungsverfahren stellt sicher, dass das markierte Myosin als natives Myosin II-Protein aktiv ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektralphotometer (Materialtabelle), um die Absorption der Stammproteinlösungen zu messen, und leiten Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Beer-Lambert-Gesetz unter Verwendung der folgenden Extinktionskoeffizienten ab: G-Aktin (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-Fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), Myosin-II-Dimer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), und RLC-Mutante A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung
HINWEIS: Polymerisieren Sie die Aktinmonomere in Gegenwart großer Aggregate von Myosin-II-Motoren und dem starken passiven Vernetzer Fascin zur Herstellung makroskopisch kontraktiler elastischer Aktomyosin-Netzwerke19,23. Die Zugabe von fluoreszierenden Kügelchen zur Lösung ermöglicht es, den Lösungsmittelfluss während der Gelkontraktion zu verfolgen.
<ol><li>Proteinlösung ("Aktomyosin")<ol><li>Mit Ausnahme von G-Aktin sollten die Proteine in kleinen Aliquoten bei −80 °C aufbewahrt und vor der Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden. Das Gesamtvolumen der Aktomyosinlösung beträgt 40 μl.</li>
		<li>Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie 10 mM Tris pH 7,4, 2 mMMgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ein ATP-Regeneriersystem (0,5 mg·ml−1 Kreatinkinase und 5 mM Kreatinphosphat), 200 μM EGTA (Chelate Ca2+ -Ionen), eine Anti-Bleichlösung (0,1 mg·ml−1 Glukoseoxidase, 0,018 mg·ml−1 Katalase und 5 mg·ml−1 Glukose), 5 μM G-Aktin, 280 nM GST-Faschin und 1,67 nM Myosin II. Der prozentuale Anteil an markiertem G-Aktin beträgt 5% (molare Prozentzahl). Anmerkungen: Verwenden Sie einen geringen Prozentsatz an markiertem G-Aktin, um die Sättigung des Fluoreszenzsignals in den fortgeschrittenen Stadien der Gelkontraktion zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von Myosin-II-Motoraggregaten<ol><li>Fügen Sie der Proteinlösung die Myosinmotoren in Form von Aggregaten hinzu. Um große Myosin-Aggregate (150 Myosin-Dimere/Aggregat) zu bilden, wird die Myosin-Stammlösung mit 10 mM Tris pH 7,4 verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 mM KCl zu erreichen.</li>
		<li>Bewahren Sie die verdünnte Myosinlösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf und geben Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Die Motoren sind bis zu 2 h voll aktiv.</li>
	</ol></li>
	<li>Messung des Lösemittelflusses<ol><li>Um den Lösungsmittelfluss durch die Gelporen zu verfolgen, fügen Sie die fluoreszierenden Kügelchen der Aktomyosinlösung hinzu. Reduzieren Sie die Wechselwirkung zwischen den Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk, indem Sie die Beads passivieren. In der Praxis inkubieren Sie 1 μl Kügelchen (Materialtabelle) mit 5 μM G-Aktin für 20 min bei RT und entfernen dann überschüssiges G-Aktin durch Zentrifugation (Materialtabelle) (Bedingungen: 6.000 x g für 5 min bei 4 °C).</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Schritt mit 10 mg·ml−1 Rinderserumalbumin (BSA) (Materialtabelle), um (möglicherweise) die verbleibende unbeschichtete Oberfläche zu blockieren. Verwenden Sie die Kügelchen in einer Endverdünnung von 1:10.000 vol/vol in den Experimenten. Anmerkungen: Es ist wichtig, den Durchmesser der Perlen so an die Gelporengröße anzupassen, dass das Verhältnis von Perle zu Porengröße in allen Phasen <1 beträgt.</li>
	</ol></li>
	<li>Einfluss der Viskosität der Lösung<ol><li>Kontrollieren Sie die Viskosität der Lösung, indem Sie der Aktomyosinlösung Glycerin (Materialtabelle) hinzufügen. Die Zugabe von Glycerin in einem Gewichtsprozentbereich von 0 % bis 34 % induziert eine entsprechende Erhöhung der Lösungsviskosität von η ω auf 2,76 η ω, wobei η ω die Viskosität von Wasser bei 20 °C28 ist. HINWEIS: Bei der Arbeit mit Glycerin ist es wichtig, eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten zu verwenden (Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Durchführen eines Experiments
<ol><li>Hausgemachtes Probenhalter-Handling<ol><li>Nehmen Sie eines der PEG-passivierten Deckgläser, legen Sie einen gefetteten Parafilm-Abstandshalter darauf und legen Sie es in den Probenhalter. Anmerkungen: Man kann den Parafilm-Abstandshalter durch einen beliebigen Abstandshalter ersetzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung der Aktomyosinlösung<ol><li>Bereiten Sie die Aktomyosinlösung auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu, indem Sie die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile einbauen, die Myosin-II-Motoraggregate hinzufügen und zuletzt EGTA hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gut. Die Zugabe von EGTA initiiert die Polymerisation des Aktomyosin-Netzwerks, die den Startzeitpunkt des Experiments festlegt.</li>
	</ol></li>
	<li>Geben Sie 1,1 μl dieser Lösung auf das am Halter befestigte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf. Schrauben Sie den Halter fest, um die Probe zu versiegeln. Bei diesem Vorgang wird der Tropfen leicht zusammengedrückt, der eine scheibenartige Form annimmt. Die Tropfendurchmesser liegen zwischen 2.800 und 3.000 μm.</li>
	<li>Setzen Sie den Probenhalter auf das Mikroskop und starten Sie die Aufnahme. Bereiten Sie das Mikroskop im Voraus vor, um die anfängliche Erfassungszeit zu verkürzen. Es dauert in der Regel 1-2 Minuten nach dem Mischen, um mit der Probenbildgebung zu beginnen.</li>
</ol>5. Mikroskopie-Techniken
<ol><li>Bilden Sie die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Materialtabelle) ab, das von einer speziellen Software (Materialtabelle) gesteuert wird.<ol><li>Verwenden Sie niedrige Vergrößerungen von 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR Objektiv (Materialtabelle), um den gesamten Gelbereich zu visualisieren und seine makroskopische Kontraktion mit der Zeit zu verfolgen.</li>
		<li>Verwenden Sie ein 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-Objektiv (Table of Materials), um die Porosität und Struktur des Netzwerks zu charakterisieren und die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks mit der Zeit zu verfolgen. HINWEIS: Dieses Objektiv ist auch nützlich, um die Myosin-II-Motoraggregate innerhalb des Netzwerks zu lokalisieren und die Bewegung fluoreszierender Kügelchen durch die Gelporen zu verfolgen. Höhere Vergrößerungen können auf Kosten eines reduzierten Sichtfelds verwendet werden, was im zweifarbigen Bildmodus noch wichtiger ist (Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Die Proben werden bei 488 nm (Aktin/Fluoreszenz-Beads) und 561 nm (Myosin-Motoraggregate/Fluoreszenz-Beads) angeregt. Erfassen Sie die Bilder mit einer Geschwindigkeit von 100 ms pro Bild mit einer speziellen Software (Table of Materials) im Streaming-Modus mit einer EMCCD-Kamera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (Table of Materials). HINWEIS: Die Intensität der Leuchtstofflampe (Materialtabelle) sollte auf dem niedrigstmöglichen Wert gehalten werden, um eine Signalsättigung während der Netzwerkkontraktion zu vermeiden.</li>
	<li>Simultane zweifarbige Bildgebung<ol><li>Verwenden Sie diesen Modus für zwei Zwecke: (i) Detektion der Lokalisation der Myosinmotoraggregate innerhalb des Aktinnetzwerks und (i) Charakterisierung des nach außen gerichteten Lösungsmittelflusses innerhalb und außerhalb während der Netzwerkkontraktion.</li>
		<li>Die Aktin- und Myosin-II-Motoren werden bei 488 nm bzw. 561 nm angeregt und die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera (Materialtabelle) mit einer Dual-Emission-Apparatur (Materialtabelle) aufgenommen. Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktingel (488 nm) und die fluoreszierenden Kügelchen (561 nm) abzubilden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Genesis%2C+Modulation%2C+and+Regeneration+of+Skeletal+Muscle+In+Molecular+Biology+of+the+Cell.+4th+edition%22">Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition</a>. , Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Howard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+J+%22Mechanics+of+Motor+Proteins+and+the+Cytoskeleton%22">Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton</a>. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).</li>
<li>Mogilner, A., Manhart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+mechanics%3A+Coupling+cytoplasmic+flow+with+active+cytoskeletal+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Fluid+Mechanics%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).</li>
<li>Bausch, A. R., Kroy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bottom-up+approach+to+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">A bottom-up approach to cell mechanics.</a> Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).</li>
<li>Moeendarbary, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytoplasm+of+living+cells+behaves+as+a+poroelastic+material%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material.</a> Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).</li>
<li>Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+cell+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Animal cell hydraulics.</a> Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).</li>
<li>Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-equilibration+of+hydrostatic+pressure+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells.</a> Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).</li>
<li>Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+fluid+flow+in+rapidly+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular fluid flow in rapidly moving cells.</a> Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).</li>
<li>Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actomyosin+breakage+triggers+shape+oscillations+in+cells+and+cell+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments.</a> Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).</li>
<li>Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+reconstitution+of+synthetic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Toward the reconstitution of synthetic cell motility.</a> Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).</li>
<li>Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+actin-based+motility+depend+on+surface+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters.</a> Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+feedback+controls+motor+activity+and+mechanical+properties+of+self-assembling+branched+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks.</a> Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).</li>
<li>Carvalho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+or+myosin+contraction%3A+two+ways+to+build+up+cortical+tension+for+symmetry+breaking%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005(2013).</li>
<li>Dayel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+reconstitution+of+actin-based+symmetry+breaking+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000201(2009).</li>
<li>Manhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+regulation+of+the+dynamic+steady+state+of+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks.</a> eLife. 8, 42413(2019).</li>
<li>Siton, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortactin+releases+the+brakes+in+actin-based+motility+by+enhancing+WASP-VCA+detachment+from+Arp2%2F3+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches.</a> Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).</li>
<li>Pontani, L. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+an+actin+cortex+inside+a+liposome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of an actin cortex inside a liposome.</a> Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).</li>
<li>Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+does+it+all%3A+Assembly%2C+remodeling%2C+and+disassembly+of+actin+networks+are+governed+by+myosin+II+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity.</a> Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).</li>
<li>Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+gels%3A+Dynamics+of+patterning+and+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Active gels: Dynamics of patterning and self-organization.</a> Physical Biology. 3 (4), 264(2006).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7 (1), 12615(2016).</li>
<li>Ideses, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+buckling+of+contractile+poroelastic+actomyosin+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets.</a> Nature Communications. 9 (1), 2461(2018).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction%3A+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Ono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+actin+binding+region+and+a+protein+kinase+C+phosphorylation+site+on+human+fascin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).</li>
<li>Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMargossian%2C+SS+%22In+Methods+in+Enzymology%22">In Methods in Enzymology</a>. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).</li>
<li>Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+the+myosin+light+chain+region+by+single+molecule+total+internal+reflection+fluorescence+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).</li>
<li>Cheng, N. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol%E2%88%92water+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+Physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li>
<li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).</li>
<li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).</li>
<li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).</li>
<li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Hier wird ein in vitro Ansatz verwendet, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zellzytoplasmas zu charakterisieren, das sich nachweislich als poroelastisches Material verhält 3,5. Die Rheologie des Zellzytoskeletts (Zytoplasma) wurde durch eine poroelastische Diffusionskonstante charakterisiert, die bestimmt, wie lange es dauert, bis sich die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit n...

Lebende Zellen haben einzigartige mechanische Eigenschaften. Neben der Fähigkeit, passiv auf einwirkende Kräfte zu reagieren, sind sie auch in der Lage, aktiv Kräfte als Reaktion auf äußere Reize zu erzeugen1. Diese Eigenschaften, die für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, insbesondere während der Zellmotilität, unerlässlich sind, werden in erster Linie auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosin-Molekularmotoren und akzessorischen Proteinen ist. Diese Aktomyosin-Netzwerke weisen intrinsische Selbstorganisations- und Kontraktionseigenschaften auf, die von den Myosin-Motorproteinen angetrieben werden, die die Aktinfilamente vernetzen und aktiv mechanische Spannungen in dem Netzwerk erzeugen, das durch ATP-Hydrolyse angetrieben wird2.
Zahlreiche experimentelle und theoretische Studien wurden durchgeführt, um die Materialeigenschaften des Zytoskeletts3 zu untersuchen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält4. Das bedeutet, dass sich das Zytoskelett auf kurzen Zeitskalen wie ein elastisches Material verhält und sich auf langen Zeitskalen aufgrund der Vernetzung von Proteinen und der Ablösung (und Wiederanheftung) des Myosinmotors wie eine viskose Flüssigkeit verhält, wodurch sich das Netzwerk dynamisch drehen kann. In vielen Situationen kann das viskoelastische Modell jedoch nicht die experimentellen Ergebnisse beschreiben, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett und allgemeiner das Zellzytoplasma als poroelastisches aktives Material beschreibt 5,6. Zwei Hauptmerkmale charakterisieren diese Art von Materialien. (i) Das erste Hauptmerkmal ist die Erzeugung eines Flusses des eindringenden Zytosols (des "Lösungsmittels") durch die Gelporen durch Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren angetrieben werden, was Prozessen wie Zellblasen7, Motilität8 und Zellformoszillationen9 zugrunde liegt. Die Entstehung solcher zytosolischen Flüsse kann lokal sein, zum Blebbing, oder global, wie bei der Zellmotilität. Im letzteren Fall treiben die kontraktil aufgebrachten Spannungen an der Zellrückseite den Fluss der zytosolischen Flüssigkeit in Richtung Zellfront an, wodurch der Proteinpool wieder aufgefüllt wird, der für die Lamellipodien-Assemblierung benötigtwird 8. (ii) Das zweite Hauptmerkmal besteht darin, dass die Relaxation von Spannungen diffusiv ist und durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität des Gels und der Viskosität des Lösungsmittelsabhängt 5. Die poroelastische Diffusionskonstante bestimmt, wie schnell das System auf eine aufgebrachte Spannung reagiert. Höhere Diffusionskonstanten entsprechen einer schnelleren Spannungsumverteilung. Dies wiederum bestimmt, wie lange es dauert, bis die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit nach mechanischer Belastung, sei es von außen oder von innen, wie z. B. den aktiven kontraktilen Belastungen, die von Myosinmotoren erzeugt werden, innerhalb der Zelle umverteilt wird. Diese Beispiele zeigen somit, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind und nicht getrennt voneinander behandelt werden können3.
Da Zellen ihre mechanischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise regulieren können, ist das Zusammenspiel zwischen Netzwerkmechanik und Strömungsdynamik noch wenig verstanden. Ein leistungsfähiger alternativer Ansatz ist die Verwendung von in vitro rekonstituierten Systemen, die eine vollständige Kontrolle über die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile und die Systemparameter ermöglichen, wodurch diese Modellsysteme optimal für die physikalische Analyse geeignet sind10,11. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um den Einfluss der Proteinzusammensetzung und der Systemgeometrie auf die Aktin-basierte Motilität 12,13,14,15,16,17,18 und die 2D-Musterung von Aktomyosin-Netzwerken 19,20,21,22 zu untersuchen und das Zusammenspiel zwischen Netzwerkkontraktilität und Fluidströmungsdynamik poroelastischer Aktomyosingele, das im Mittelpunkt dieser Arbeitsteht 23.
In diesem Manuskript wird die Herstellung von kontraktilen elastischen Aktomyosin-Netzwerken mit kontrollierbaren Dimensionen und Materialeigenschaften auf der Grundlage der Arbeiten von Ideses et al.23 diskutiert. Die Dynamik des kontrahierenden Gels und des drainierten Lösungsmittels wird analysiert und quantifiziert, wodurch gezeigt wird, dass diese Aktomyosingele als poroelastisches aktives Material beschrieben werden können. Die Untersuchung des Einflusses der Lösungsmittelviskosität auf die Spannungsdiffusionsfähigkeit bestätigt die poroelastische Natur dieser Netzwerke. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden bereitgestellt. Schließlich werden auch die experimentellen Herausforderungen, die häufigsten Fallstricke und die Relevanz der experimentellen Ergebnisse für das Zellzytoskelett diskutiert.

<table><tbody><tr><td>(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>175617</td><td>Lagerung unter Argonatmosphäre bei 4 μde; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Bio-Lab Ltd</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>Verdünnt mit DMSO, gelagert unter Argonatmosphäre bei -20 & Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A20347</td><td>Verdünnt mit DMSO, gelagert unter Argonatmosphäre bei -20 &Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>A3059</td><td>Gelagert bei 4 Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>C9322</td><td>Die Lagerflasche wird unter trockener Atmosphäre (Kieselgel) bei -20 &° aufbewahrt; C</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Mezel-Glaser</td><td>CG2222-1.5</td><td>Nach der Piranha-Behandlung in milliQ-Wasser aufbewahrt und innerhalb von 3 Wochen verwendet</td></tr><tr><td>Kreatinkinase</td><td>Roche Life Science Products</td><td>10736988001</td><td>Frisch in Glycinpuffer zubereitet, auf Eis gelagert und innerhalb von 3 Tagen verbraucht. Die Vorratsflasche wird unter trockener Atmosphäre (Kieselgel) bei 4° aufbewahrt; C</td></tr><tr><td>Kreatinphosphat</td><td>Roche Life Science Produkte</td><td>10621714001</td><td>Wenn es aufgelöst ist, sollte es bei -20 & Grad aufbewahrt werden; C und innerhalb von 3 Monaten verbraucht. Die Vorratsflasche wird unter Argonatmosphäre aufbewahrt und bei 4 Grad gelagert; C</td></tr><tr><td>DTT</td> Roche <td>Life Science Products</td><td>10708984001</td><td>Wenn es aufgelöst ist, sollte es bei -20 ° C aufbewahrt werden; C und innerhalb von 3 Monaten verwendet</td></tr><tr><td>Dual-View-System für simultane Bildgebung</td><td>Photometrics</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Kamera</td><td>Andor Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD Kamera</td><td>Photometrics</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzlampe</td><td>Rapp Optoelektronische</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>200 nm</td></tr><tr><td>Durchmesser Glukose</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>Wenn aufgelöst, sollte es bei -20 & Grad aufbewahrt werden; C und innerhalb von 3 Monaten verbraucht.</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>G7141</td><td>Gehalten in -20 &°; C und innerhalb von 3 Monaten verbraucht. Das Brühpulver wird unter Argonatmosphäre aufbewahrt und bei -20 μg aufbewahrt; C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>216763</td><td>gelagert bei 4 & Grad; C&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>Methanol</td><td>Bio-Lab Ltd</td><td>1368052100</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>442615</tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMI3000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&nbsp;</td><td>Mw = 5000 Da. Aufgeteilt in kleine Chargen nach Gewicht. Gelagert unter Argonatmosphäre bei -20 °; C</td></tr><tr><td>Nilrote Mikrosphären</td><td>Spherotech</td><td>FP-2056-2&nbsp;</td><td>2300 nm Durchmesser</td></tr><tr><td>Objektiv (10x)</td><td>Leica Germany</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL Numerische Apertur = 0,3</td></tr><tr><td>Objektiv (2,5x)</td><td>Leica Germany</td><td>506304</td><td>&nbsp; Plan-NEOFLUAR Numerische Apertur = 0,075</td></tr><tr><td>Ofen</td><td>WTC Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS Puffer</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Shutter Driver</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel</td><td>Merck</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Elma</td><td>Elmasonic P</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Carlo Erba Reagenzien</td><td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System</td><td>Photometrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spektralphotometer</td><td>Pharmacia</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td>1&ndash; 10 μl</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Datenquantifizierung&nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td>Steuerungssoftware des optischen Bildgebungssystems; Datenquantifizierung (Partikelverfolgungsanalyse, Netzwerkmaschenweite)</td></tr></tbody></table>

die mechanik (poro-)elastischer kontraktiler actomyosin-netzwerke als modellsystem des zellzytoskeletts

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Zellen können aktiv ihre Form verändern und beweglich werden, eine Eigenschaft, die von ihrer Fähigkeit abhängt, ihre innere Struktur aktiv neu zu organisieren. Diese Eigenschaft wird auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosinmotoren und akzessorischen Proteinen ist, die intrinsische Kontraktionseigenschaften aufweisen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält. Dieses Modell kann jedoch nicht immer die experimentellen Ergebnisse erklären, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett als poroelastisches aktives Material beschreibt - ein elastisches Netzwerk, das in Zytosol eingebettet ist. Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren erzeugt werden, treiben den Fluss des Zytosols durch die Gelporen an, was darauf schließen lässt, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind. Ein Hauptmerkmal der Poroelastizität ist die diffusive Relaxation von Spannungen im Netzwerk, die durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität und der Viskosität des Zytosols (Lösungsmittels) abhängt. Da Zellen viele Möglichkeiten haben, ihre Struktur und Materialeigenschaften zu regulieren, ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Mechanik des Zytoskeletts und die Dynamik des Zytosolflusses gekoppelt sind, noch wenig verstanden. Hier wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Materialeigenschaften von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem für das Zellzytoskelett zu charakterisieren. Die Gelkontraktion wird durch die motorische Kontraktilität des Myosins angetrieben, die zur Entstehung eines Flusses des eindringenden Lösungsmittels führt. Der Artikel beschreibt, wie diese Gele hergestellt und Experimente durchgeführt werden. Wir diskutieren auch, wie der Lösungsmittelfluss und die Gelkontraktion sowohl auf lokaler als auch auf globaler Ebene gemessen und analysiert werden können. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden angegeben. Abschließend werden die experimentellen Herausforderungen und häufigen Fallstricke diskutiert, einschließlich ihrer Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Pro Versuch werden zwei Glasdeckgläser verwendet. Die Glasdeckgläser werden mit PEG-Polymeren gereinigt und passiviert. Die Passivierung ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die gelösten Proteine bereits in frühen Versuchsstadien an den Glasoberflächen haften und um die Wechselwirkung des kontrahierenden Netzwerks mit den Glaswänden zu minimieren. Gelingt es nicht, eine gute Passivierung zu erreichen, kann dies zu einer ineffizienten Kontraktion führen und im Extremfall sogar die Bildung von Aktinnetzwerken hemmen.</...

In dieser Arbeit wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Poroelastizität von Aktomyosingelen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Die Dynamik des Aktomyosingels und des eingebetteten Lösungsmittels wird quantifiziert, wodurch die Netzwerkporoelastizität nachgewiesen wird. Wir diskutieren auch die experimentellen Herausforderungen, häufige Fallstricke und die Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.

Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Wir haben einen in vitro Ansatz entwickelt, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zytoplasmas zu charakterisieren, von denen gezeigt wurde, dass sie sich als poroelastisches aktives Material verhalten. Diese Methode gibt Aufschluss darüber, wie die Kontraktilität von Myosin zur Entstehung eines Flüssigkeitsflusses beiträgt und wie Netzwerk- und Zytosolgeschwindigkeiten zeitlich und räumlich korrelieren. Dieser einfache Ansatz ermöglicht es uns, die mechanischen Eigenschaften von sich dynamisch entwickelnden Systemen zu extrahieren, ohne ausgeklügelte Geräte oder Techniken zu verwenden, bei denen herkömmliche Werkzeuge wie AFIM nicht eingesetzt werden können.Diese Methode kann Einblicke in die Rheologie poroelastischer Aktivmaterialien liefern, unabhängig von der Spezifität des aktiven Gels und der eingebetteten Flüssigkeit. Legen Sie zunächst 10 bis 12 Glasdeckgläser der Nummer 1,5 in einen selbstgemachten Polytetrafluorethylenhalter und bereiten Sie die Piranha-Lösung in einem 400-Milliliter-Becherglas vor. Bereiten Sie die Lösung auf Eis in einer chemischen Haube vor.Den Halter in den Piranha-gefüllten Becher

the-mechanics-poro-elastic-contractile-actomyosin-networks-as-model

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Bildung von Actomyosin-Bündeln in vitro und die Messung der Myosin-Ensemble-Krafterzeugung mittels optischer Pinzette wird vorgestellt und diskutiert.

Untersuchung der Myosin-Ensemblemechanik in Aktinfilamentbündeln mit einer optischen Pinzette

Die differentielle dynamische Mikroskopie (DDM) kombiniert Merkmale der dynamischen Lichtstreuung und Mikroskopie. Hier wird der Prozess der Verwendung von DDM zur Charakterisierung rekonstituierter Zytoskelettnetzwerke durch Quantifizierung der subdiffusiven und eingesperrten Dynamik von Partikeln in Vimentin-Netzwerken und der ballistischen Bewegung von aktiven Myosin-getriebenen Aktin-Mikrotubuli-Kompositen vorgestellt.

Quantifizierung der Zytoskelettdynamik mittels differentieller dynamischer Mikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Dieser Artikel stellt Protokolle für die Entwicklung und Charakterisierung abstimmbarer dreidimensionaler Verbundnetzwerke aus co-verschränkten Aktinfilamenten und Mikrotubuli vor. Verbundwerkstoffe unterliegen einer aktiven Umstrukturierung und ballistischen Bewegung, die von Myosin II- und Kinesinmotoren angetrieben wird, und werden durch die relativen Konzentrationen von Aktin, Mikrotubuli, Motorproteinen und passiven Vernetzern abgestimmt.

Rekonstitution und Charakterisierung von Aktin-Mikrotubuli-Verbundwerkstoffen mit abstimmbarer motorgetriebener Dynamik und Mechanik

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Traditional, zweidimensionalen Zellkultur-Techniken oft in veränderten Eigenschaften in Bezug auf die Differenzierung Marker, Zytokine und Wachstumsfaktoren führen. Dreidimensionale Zellkulturen in den rotierenden Zellkultursystem (RCCS) wiederherstellt Expression vieler dieser Faktoren, wie hier mit einem extravillösen Trophoblasten-Zelllinie gezeigt.

Rotierende Cell Culture Systems für Human Cell Culture: Human Trophoblastzellen als Modell

Wir haben eine Mikroverkapselung Technik als eine effektive Plattform für 3D-Vermehrung und Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Endoderm und dopaminerge (DA) Neurone optimiert. Es bietet auch eine Chance für Immun-Isolierung von Zellen aus dem Wirt während der Transplantation. Diese Plattform kann für andere Zelltypen angepasst werden.

Alginat-Mikrokapseln als 3D-Plattform für die Vermehrung und Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) auf verschiedenen Linien

Das Verfahren zeigt die Methodik der Magnet-Resonanz-Elastographie zur Überwachung der gentechnisch Ergebnis der Fett-und osteogene Gewebezüchtungen Konstruktionen, die durch nicht-invasive lokale Beurteilung der mechanischen Eigenschaften mit mikroskopischen Magnetresonanz-Elastographie (μMRE).

Magnet-Resonanz-Elastographie Methodik für die Beurteilung von Tissue Engineering gewonnenen Konstrukts Wachstum

Erfahren Sie die Mechanik poroelastischer Actomyosin-Gele als Modellsystem des Zellzytoskeletts. Diese in-vitro-Methode ermöglicht die Quantifizierung von Gel- und Lösungsmitteldynamik ohne aufwendige Geräte.

Die Mechanik (poro-)elastischer kontraktiler Actomyosin-Netzwerke als Modellsystem des Zellzytoskeletts

Weitere Videos entdecken