CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Die Herstellung genetisch veränderter Mäuse und die Analyse ihres Phänotyps ermöglicht es uns, bestimmte Genfunktionen in vivo im Detail zu verstehen. Zahlreiche wichtige Erkenntnisse wurden an genmodifizierten Tiermodellen gewonnen. Die Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht es, lange DNA zu implantieren, um Stammzellen mit akzeptabler Effizienz ohne Medikamentenauswahl zu implantieren.

Die Technik ist nicht nur für die grundlegenden Lebenswissenschaften von Vorteil, sondern die Erkenntnisse werden auch in angewandten Wissenschaften wie Medizin und Tierwissenschaften umgesetzt. Das Verfahren wird von Dr. Chihiro Emori, einem Assistenzprofessor, und Dr. Manabu Ozawa, einem außerordentlichen Professor aus meinem Labor, demonstriert. Nach der Vorbereitung des embryonalen Fibroblasten der Maus bereiten Sie die mit Gelatine überzogene Zellkulturschale wie im Manuskript beschrieben vor und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang in einem feuchten Inkubator.

Entfernen Sie die Gelatinelösung, waschen Sie das Gericht zweimal mit PBS und lagern Sie es bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur. Gefrorenes MEF-Material mitotisch inaktiviert, indem man ein Wasserbad auf 37 Grad Celsius für eine Minute temperiert. Legen Sie den MEF einen Tag vor der ESC-Aussaat auf eine mit Gelatine beschichtete 60-Millimeter-Schale.

Ein gefrorenes ESC-Standardrohr wie zuvor gezeigt auftauen und einmal 10 bis fünf ESCs auf eine 60-Millimeter-Schale mit vorgesetztem MEF legen. Dann fügen Sie vier Milliliter ESC-Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie die Schale, bis die ESC 50 bis 70% Konfluenz erreicht. Nachdem Sie das kultivierte ESC mit vier Milliliter PBS gewaschen haben, verdauen Sie es mit 800 Mikrolitern 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius.

Sobald das Trypsin mit einem Milliliter ESCM inaktiviert ist, fügen Sie einen Milliliter frisches ESCM zu den Zellen hinzu, geben Sie das Medium in ein Röhrchen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 280 G für fünf Minuten. Nachdem Sie die Zellen in einem Milliliter frischem ESCM resuspendiert haben, zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung. Nachdem Sie einmal 10 bis zum fünften ESC in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und dreimal mit PBS durch Zentrifugation gewaschen haben, resuspendieren Sie das ESC-Pellet in 12 Mikroliter Cas9 RNP-DNA-Mischung und mischen Sie es gut durch sanftes Pipettieren, um ein Sprudeln zu vermeiden.

Dann servieren Sie den hängenden ESC für die Elektroporation. Als nächstes kultivieren Sie die elektropolierten ES-Zellen in einer 60-Millimeter-Schale mit vier Milliliter ECSM mit mitotisch inaktiviertem MEF und wechseln das Medium täglich. Drei bis fünf Tage nach der Elektroporation waschen Sie die ESCs mit vier Milliliter PBS und verdauen sie dann mit 800 Mikrolitern 0,25% Trypsin EDTA und Kultur in einem feuchten Inkubator.

Danach fügen Sie zwei Milliliter ESCM hinzu, um die Trypsinverdauung zu stoppen. Sobald die Zellmischung pelletiert ist, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem ESCM und zählen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler mit Trypanblau-Färbung. Die ES-Zellen werden einmal 10 zu den dritten Zellen pro 60-Millimeter-Schale mit ESCM und MEF durchgelassen.

Stellen Sie sicher, dass Sie das Medium wechseln, bis die Kolonie aufnimmt. Fünf bis sieben Tage nach der ersten Passage, sobald das ESCM aus der ESC-Kulturschale abgesaugt ist, fügen Sie vier Milliliter PBS hinzu. Nehmen Sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette einzelne ESC-Kolonien mit fünf Mikrolitern PBS unter einem Stereomikroskop auf.

Legen Sie die einzelnen Kolonien in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden, die 15 Mikroliter 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung enthält. Nach dem Inkubieren der 96-Well-Platte stoppen Sie die Trypsinverdauung, indem Sie 80 Mikroliter ESCM hinzufügen und ESC-Kolonien durch Pipettieren in einzelne Zellen dissoziieren. Für die PCR-Genotypisierung werden 40 Mikroliter ESC-Suspension in eine mit Gelatine beschichtete, dosierfreie 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern ESCM pro Vertiefung überführt.

Um das gefrorene ESC-Material herzustellen, werden die verbleibenden 60 Mikroliter ESC-Suspension in eine Vertiefung einer mit Gelatine beschichteten 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern ESCM und Feeder MEF überführt. Lagern Sie einzelne ESC-Klone, die in der 24-Well-Platte kultiviert werden, bis sie eine Konfluenz von 60 bis 80% erreichen, und gewinnen Sie einzelne ESC-Klone durch Trypsinisierung zurück, wie bereits gezeigt. Nach der Gewinnung des Zellpellets durch Zentrifugation resuspendieren Sie das in 500 Mikroliter Zellgefriermedium, um die Zellen bei minus 80 Grad Celsius einzufrieren.

Für die PCR-Genotypisierung werden ESC-Klone wie zuvor demonstriert kultiviert und ESCM aus jeder Vertiefung durch Aspiration entfernt, bevor sie zweimal mit 100 Mikrolitern PBS gewaschen werden. Nach dem Absaugen des PBS 100 Mikroliter Lysepuffer mit Proteinase K hinzufügen und gut mischen. Nun wird das ESC-Lysat in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und mindestens eine Stunde in einer Wärmekammer bei 65 Grad Celsius aufbewahrt.

Sobald die genomische DNA in 20 Mikrolitern DNase-freiem Wasser gelöst ist, bestimmen Sie die Reinheit und Konzentration der DNA mit einem Spektralphotometer. Nach der Durchführung der genomischen PCR mit locusspezifischen Primer-Sets zur Amplifikation der Zielregion überprüfen Sie die Sequenz und wählen Sie die ESC-Klone mit den gewünschten Knock-in-Sequenzen aus. Nach der Paarung der mit Hormon behandelten Weibchen mit den ICR-Männchen und dem Sammeln des Eileiters legen Sie die gesammelten Eileiter in FHM-Tropfen und gewinnen Sie die zweizelligen oder vierzelligen Embryonen zurück, indem Sie den Eileiter mit FHM spülen, indem Sie eine Spülnadel verwenden, die in das Infundibulum eingeführt wird.

Waschen Sie die gesammelten Embryonen, indem Sie sie mit einer Mundpipette in mehrere frische FHM-Tropfen geben. Die Kultur der Embryonen in 50 Mikrolitern KSOM-Tropfen auf einer 35-Millimeter-Zellkulturschale, die mit Mineralöl bedeckt war, wie zuvor demonstriert, für einen Tag, bis das Achtzell- oder Morula-Stadium erreicht ist. Bereiten Sie Glaspipetten für die Aufbewahrung der Embryonen und die ESC-Injektion mit einem Puller und einer Mikroschmiede vor.

Nachdem Sie eine FHM-haltige Haltepipette in einen Kapillarhalter integriert haben, der mit einem Mikroinjektor verbunden ist, stellen Sie ihn auf der linken Seite des Mikromanipulators auf. Schließen Sie eine Injektionspipette an einen anderen Mikroinjektor an und stellen Sie sie auf der rechten Seite auf. Richten Sie die beiden Pipetten gerade im Sichtfeld des Mikroskops aus.

Machen Sie fünf Mikroliter Tropfen von 12% Polyvinylpyrrolidon und fünf Mikroliter Tropfen FHM auf den gleichen Deckel einer 60-Millimeter-Schale, Seite an Seite. Die Tropfen mit Mineralöl bedecken. Übertragen Sie die Embryonen in fünf Mikroliter FHM-Tropfen und geben Sie ein bis fünf Mikroliter der ESC-Suspension in den embryohaltigen FHM-Tropfen.

Sobald die Injektionspipette mit Polyvinylpyrrolidon gewaschen wurde, bewegen Sie die Injektionspipette zu dem Tropfen, der die Embryonen und ES-Zellen enthält. Wählen Sie drei einzelne ESC-Dubletten, die gerade ihre Zellteilung in der Injektionspipette beendet haben. Halten Sie mit der Haltepipette einen Embryo im Achtzell- oder Morulastadium fest, der die Verdichtung durch Aspiration abgeschlossen hat, und machen Sie mit einem piezoelektrischen Impuls ein Loch in die Zona pellucida.

Stoßen Sie die sechszellige ESC in der Zona pellucida aus und ziehen Sie die Pipette aus den Embryonen. Waschen Sie die ESC-injizierten Embryonen vorsichtig mit mehreren KSOM-Tropfen mit einer Mundpipette und inkubieren Sie sie in einem neuen 50-Mikroliter-KSOM-Tropfen, der mit Mineralöl bedeckt ist, wie bereits gezeigt, bis sich die Embryonen zum Blastozystenstadium entwickelt haben. Ein PCR-Amplikon der für das Knock-in-Ziel spezifischen Größe wird erhalten und 9 von 22 Klonen zeigten eine Knock-in-spezifische Bande.

Diese Ergebnisse sind effizient und reproduzierbar für Gen-Knock-In ohne Medikamentenauswahl. Die optimale Größe der ESC-Kolonien zu ermitteln, ist für dieses Verfahren sehr wichtig. Vermeiden Sie es, zu große oder zu kleine Kolonien auszuwählen.

CRISPR Cas9-vermittelte direkte Genom-Editierung mit einer Zygote wäre anwendbar, um einfache Gen-Knockout-Mäuse herzustellen. Dieses CRISPR Cas9-vermittelte ESC-Gen-Targeting-Protokoll erleichtert die Produktion verschiedener genetisch veränderter Mäuse für zukünftige Analysen in den Biowissenschaften.