Name: In vitro Spaltungstests mit gereinigten rekombinanten Drosophila-Caspasen für das Substrat-Screening (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Erfahren Sie die Expression und Reinigung rekombinanter Drosophila-Caspasen Dronc und Drice für In-vitro-Spaltungstests. Diese Methode ermöglicht das Hochdurchsatz-Screening potenzieller Substrate zur Untersuchung apoptotischer Prozesse.

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Wir danken Dr. Elif Kamber-Kaya für ihre Hilfe bei der Etablierung des Protokolls im Labor. Dr. Guy Salvesen stellte freundlicherweise die DriceC211A Mutante9 zur Verfügung. Diese Arbeit wurde durch einen MIRA-Preis des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) der National Institutes of Health (NIH) unter der Fördernummer 2R35GM118330 finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

1. Rekombinante Caspase-Expression in Bakterien
<ol><li>Klonen Sie das interessierende Gen (Caspase oder mutmaßliches Substrat) in einen bakteriellen Expressionsvektor mit N- und/oder C-terminalen Tags unter Verwendung von Standardprotokollen23. HINWEIS: Tags können die Löslichkeit der rekombinanten Proteine erhöhen und werden zur Reinigung der rekombinanten Proteine verwendet. Hier werden Dronc, Drice und ihre katalytischen Mutanten in den Vektor pET28a geklont, der einen N-terminalen 6xHis-Tag liefert (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (Grundinformationen siehe Zusatztabelle 1).</li>
	<li>Die Vektoren mit den interessierenden Genen werden unter Verwendung der Standardverfahren 23,24 in kompetente BL21 (DE3) pLysS E. coli-Zellen umgewandelt. Die Transformationsmischung auf LB-Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum (Kanamycin im Falle von pET28a) beschichten, um transformierte Bakterien auszuwählen. (Siehe Zusatztabelle 2.)</li>
	<li>Wählen Sie eine Kolonie von der Platte und inokulieren Sie in 5 ml LB-Medium, das das entsprechende Antibiotikum enthält, um über Nacht bei 37 ° C bei 220 U / min auf einer Schüttelplattform zu wachsen.</li>
	<li>Am nächsten Tag bereiten Sie 30-50 ml (pro Probe) LB-Medium mit Antibiotikum vor und fügen Sie 1 ml der über Nacht gewachsenen Kultur hinzu. Die optische Dichte bei 600 nm (OD600) mit einem Biophotometer/Spektralphotometer sollte zwischen 0,1 und 0,2 liegen.</li>
	<li>Die Kultur wird bei 37 °C bei 220 U/min auf einer Schüttelplattform gezüchtet, bis OD600 0,6 erreicht. Überprüfen Sie den OD600 jede Stunde, bis er 0,6 erreicht. Dies dauert etwa 2 bis 3 Std.</li>
	<li>Um die Proteinexpression (Caspase) zu induzieren, fügen Sie IPTG zu einer Endkonzentration von 0,1-0,2 mM hinzu (verdünnen Sie 1:1.000-1:500 aus IPTG-Brühe, siehe Zusatztabelle 2).</li>
	<li>Die Kulturen 3 h lang bei 30 °C bei 220 U/min wachsen lassen. HINWEIS: Zeit und Temperatur hängen davon ab, welche Art von Protein exprimiert wird und wie gut es löslich ist. Diese Bedingungen müssen möglicherweise angepasst werden, wenn verschiedene Caspasen oder Substrate exprimiert werden.</li>
	<li>Nach 3 h die Kulturen in 50-ml-Zentrifugenröhrchen für 20 min bei 4 °C bei 2.000 x g herunterschleudern. Entsorgen Sie den Überstand und fahren Sie mit dem Pellet fort. HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt und später fortgesetzt werden. Bakterienpellets können bei -80 °C eingefroren werden.</li>
</ol>2. Extraktion rekombinanter Caspasen in kleinem Maßstab
<ol><li>Entfernen Sie die gefrorenen Röhrchen mit den pelletierten Kulturen aus der Lagerung bei -80 °C und halten Sie sie 10 min auf Eis, um das Pellet weich zu machen.</li>
	<li>Nach 10 min werden 0,6 ml bakterieller Zelllysepuffer (Zusatztabelle 2), ergänzt mit frisch zugegebenen Proteaseinhibitoren, 10 mg/ml Lysozym und 50 U/ml Benzonase in die pellethaltigen Röhrchen gegeben, wobei ein Pipettencontroller mit einer 1 ml serologischen Pipette verwendet wird.</li>
	<li>Lösen Sie das Pellet mit derselben Pipettenspitze auf, indem Sie auf und ab pipettieren, bis eine klare hellgelbe Lösung ohne Pelletpartikel sichtbar ist. 30 min auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Das Lysat in geeignete Zentrifugenröhrchen überführen und die Lysate bei 17.000 x g für 40 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Die Überstände werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dies ist der Rohextrakt, der die Caspasen enthält.</li>
	<li>Halten Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit der Reinigung mit Ni-NTA-Agarose fort.</li>
</ol>3. Reinigung von Caspasen mit His-Tags in kleinem Maßstab
<ol><li>Zu jedem Röhrchen der Caspase-Extrakte aus Schritt 2.5 werden 0,2 ml der 50%igen Aufschlämmung Ni-NTA-Agarose hinzugefügt. Drehen Sie die Rohre auf einem End-on-End-Rotator für 1 h bei 4 °C.</li>
	<li>Nach 1 h wird der Extrakt mit der Ni-NTA-Agarose in 1 ml Polypropylensäulen gegeben, wobei die Spitze intakt ist und in ein Gestell gelegt wird. 5 min stehen lassen.</li>
	<li>Nach 5 min die Kappe der Säulen entfernen und den Überstand durch Schwerkraft ausfließen lassen.</li>
	<li>Man gibt vorsichtig 1 ml des Waschpuffers (Zusatztabelle 2) zu den Säulen, ohne das verpackte Harz der Ni-NTA-Agarose zu stören, und wäscht es durch die Schwerkraft.</li>
	<li>Führen Sie den Waschschritt dreimal durch.</li>
	<li>Zur Elution der Caspasen legen Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen nach vollständigem Entleeren des Waschpuffers unter die Auffangdüse der Säulen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml des Elutionspuffers (ergänzt mit 1x Proteaseinhibitoren unmittelbar vor Gebrauch) zu jeder Säule hinzu und sammeln Sie das Eluat in den 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Das fein gereinigte Eluat hat eine transparente Farbe.</li>
	<li>Halten Sie die Eluate auf Eis und messen Sie die Konzentration der Proteine mit Bradford Assay25. Bestätigen Sie die Reinheit/Homogenität der gereinigten Caspasen durch SDS-PAGE gefolgt von Coomassie Blue Färbung26. HINWEIS: Die Ausbeute einer 50-ml-LB-Kultur liegt zwischen 0,5 und 1,5 mg Caspase-Protein. Da 0,5 ml Elutionspuffer für die Elution verwendet werden, liegt die Konzentration zwischen 1 und 3 mg/ml. Es ist wichtig, die gereinigten Caspase-Eluate für In-vitro-Spaltungstests am selben Tag der Lyse und Reinigung zu verwenden, da diese Caspase-Präparate über Nacht an Aktivität verlieren.</li>
</ol>4. Expression des mutmaßlichen Caspase-Substrats in zellfreien Expressionssystemen
HINWEIS: In diesem Protokoll wird Drice, das natürliche Substrat von Dronc, sowohl durch rekombinante Expression in E. coli (siehe Abschnitt 3 oben) als auch durch Expression in Kaninchenretikulozytenlysat (RRL), einem zellfreien Expressionssystem für Säugetiere, hergestellt (dieser Abschnitt, siehe unten).
<ol><li>Klonen des Gens des mutmaßlichen Substrats in einen Expressionsvektor, der entweder einen T7-, T3- oder SP6-Promotor enthält, unter Verwendung von Standardverfahren23. HINWEIS: In diesem Protokoll wird DriceC211A als Modellsubstrat verwendet und in den Vektor pT7CFE1-N-Myc kloniert, der einen T7-Promotor für die Genexpression trägt und das mutmaßliche Proteinsubstrat mit einem N-terminalen Myc-Tag zum Nachweis durch Immunoblotting markiert.</li>
	<li>In RRL können Kandidatensubstrate entweder radioaktiv oder nicht-radioaktiv synthetisiert werden.<ol><li>Nicht-radioaktive Synthese: In einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 25 μL RRL, 2 μL Reaktionspuffer, 0,5 μL Aminosäuregemisch - minus Leucin (1 mM), 0,5 μL Aminosäuregemisch - minus Methionin (1 mM), 1 μL Ribonuklease-Inhibitor (40 U / μL), 2 μL DNA-Template (0,5 μg / μL) und 1 μL T7-RNA-Polymerase hinzugefügt. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Endvolumen der Reaktion auf 50 μL einzustellen. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren oder Rühren mit der Pipettenspitze und drehen Sie kurz herunter. HINWEIS: Das RRL-Lysat enthält 100-200 mg/ml der endogenen Proteine. Für in vitro translationale Reaktionen wird die RRL in einer Konzentration von 50% zugegeben (hier 25 μL/50 μL Reaktion).</li>
		<li>Radioaktive Synthese: In einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 25 μL RRL-Lysat, 2 μL Reaktionspuffer, 0,5 μL Aminosäuregemisch minus Methionin (1 mM), 1 μL Ribonuklease-Inhibitor (40 U/μL), 2 μL DNA-Template (0,5 μg/μL), 2 μL S35-markiertes Methionin (1000 Ci/mmol bei 10 mCi/ml) und 1 μL T7-RNA-Polymerase. Fügen Sie nukleasefreies Wasser hinzu, um das Endvolumen der Reaktion auf 50 μL einzustellen. Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren oder Rühren mit der Pipettenspitze und drehen Sie kurz herunter. Entsorgen Sie Spitzen und Schläuche in einem Behälter für radioaktive Abfälle. HINWEIS: Fügen Sie die Aminosäuremischung nicht ohne Leucin hinzu. Der pT7CFE1-Vektor verwendet einen T7-Promotor für die Proteinexpression. Andere Vektoren verwenden T3- oder SP6-Promotoren. In diesem Fall sollten T3- oder SP6-RNA-Polymerasen anstelle der T7-RNA-Polymerase verwendet werden. Bitte stellen Sie sicher, dass die DNA-Vorlage von hoher Reinheit ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Die Reaktion bei 30 °C 90 min inkubieren.</li>
	<li>10 s kurz drehen und die Röhrchen auf Eis legen. Überprüfen Sie den Expressionsgrad des mutmaßlichen Substrats in RRL mittels SDS-PAGE und Immunoblotting/Autoradiographie. HINWEIS: Die Menge an RRL-Extrakt, die der Spaltreaktion zugesetzt wird, sollte auf der Proteinmenge basieren, die durch die Nachweismethode (entweder Immunoblotting oder S35-Autoradiographie ) nachgewiesen werden kann. Fahren Sie mit dem In-vitro-Spaltungstest (nächster Abschnitt) fort oder lagern Sie ihn bei -80 °C.</li>
</ol>5. In-vitro-Spaltungstest mit Substraten, die mit RRL erzeugt wurden
<ol><li>Nehmen Sie das/die erzeugte(n) mutmaßliche(n) Substrat(e), wie in Abschnitt 4 beschrieben. In diesem Protokoll wird N-Myc-DriceC211A als Modellsubstrat verwendet.</li>
	<li>Abhängig vom Expressionsgrad des mutmaßlichen Substrats (separat durch Immunoblot oder Autoradiographie-Analyse zu bestimmen, siehe Schritt 4.4), verwenden Sie 1-10 μL des RRL, programmiert mit dem Protein von Interesse im Spaltassay.</li>
	<li>Fügen Sie 10 μg gereinigtes Caspase-Protein hinzu, das in den Abschnitten 1, 2 und 3 erzeugt wird.</li>
	<li>Das Gesamtreaktionsvolumen wird mit Caspase-Assay-Puffer auf 50 μL gebracht.</li>
	<li>Die Reaktionen werden in einem Wasserbad bei 30 °C für 3 h inkubiert. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Kontrollen in den Spalttest aufgenommen werden. Hier kommt die katalytische Mutante DroncC318A als Kontrolle zum Einsatz.</li>
	<li>Nach 3 h stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie die Röhrchen auf Eis übertragen.</li>
	<li>Fügen Sie ein Volume LDS-Probenpuffer mit 50 mM DTT hinzu. Die Reaktion wird durch Zugabe von LDS-Probenpuffer vollständig gestoppt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben bei 75 °C in einem Hitzeblock für 10 min.</li>
	<li>Schnell drehen, durch Flicken mischen, 24 μL pro Probe einlegen und die SDS-PAGE ausführen (siehe Abschnitt 7) oder die Proben bei -20 °C lagern.</li>
</ol>6. In-vitro-Spaltungstest mit bakteriell exprimiertem rekombinantem Substratprotein
<ol><li>10 μg gereinigtes Kandidatensubstrat (hier 6xHis-DriceC211A, erzeugt in den Abschnitten 1, 2 und 3) in ein 0,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben.</li>
	<li>Fügen Sie 10 μg der gereinigten Caspaseproteine hinzu, die in den Abschnitten 1 und 2 erzeugt werden. Das Gesamtvolumen wird mit einem Caspase-Assay-Puffer auf 50 μL erhöht.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 5.5 bis 5.9 aus.</li>
</ol>7. SDS-PAGE und Immunoblotting
<ol><li>Laden Sie die Spaltreaktionen (24 μL) auf 4%-12% Tris-Glycin- oder Bis-Tris-Gradientengele (Table of Materials) und führen Sie Proteinelektrophorese und Immunoblotting (oder Autoradiographie bei Verwendung von S35-markierten Substraten) durch, um die Ergebnisse mit Standardverfahren27,28 zu visualisieren. HINWEIS: Hier wurden in diesem Protokoll Bis-Tris-Gradientengele mit Mops-Laufpuffer und LDS-Ladepuffer verwendet. Im Allgemeinen laufen die häufig verwendeten PAGE-Protokolle von Tris-Glycine-Gelen mit dem Tris-Glycine-SDS-Laufpuffer und der SDS-Ladepuffer funktionieren gut.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Der Großteil unseres Wissens über Caspasen und Caspase-Funktion stammt aus intensiver Arbeit in der Apoptose in den letzten drei Jahrzehnten. Es ist sehr gut bekannt, dass Initiator-Caspasen Effektor-Caspasen proteolytisch verarbeiten, und Hunderte von Proteinen wurden während der Apoptose 5,29 als Effektor-Caspase-Substrate identifiziert. Viel weniger ist dagegen über die Funktion von Caspasen für nicht-apoptotische Prozesse bekannt und welche nicht-apoptotischen Substrate sie verarbeiten. Es ist denkbar, dass Initiatoren-Caspasen hier wichtige Entscheidungsträger sind. Während der Apoptose aktivieren sie Effektor-Caspasen, die den Zelltod verursachen. Um jedoch nicht-apoptotische Prozesse auszulösen, können sie verschiedene Proteine (außer Effektor-Caspasen) aktivieren, die den nicht-apoptotischen Prozess steuern. Dieses Protokoll testet Kandidatenproteine als Substrate des Initiators Caspase Dronc in Drosophila 17,30.
Die im Spalttest zu testenden Substrate können entweder in einem in vitro zellfreien Expressionssystem für Säugetiere wie RRL oder durch rekombinante Expression in E. coli hergestellt werden. Es gibt mehrere Vorteile für die In-vitro-Expression mit RRL gegenüber der bakteriellen Expression. Das RRL-Expressionsprotokoll ist einfach und schnell, so dass viele verschiedene Substrate parallel vorbereitet werden können. In vielen Fällen kann der RRL-Extrakt, der das interessierende Protein enthält, vor der Verwendung im Spalttest bei -80 °C gelagert werden (obwohl dies für jedes Substrat separat bestimmt werden muss). Das mutmaßliche Substrat kann mit S35-Met markiert werden, was eine einfache Analyse durch Autoradiographie nach SDS-PAGE ermöglicht. Das ist vor allem dann sinnvoll, wenn kein substratspezifischer Antikörper zur Verfügung steht. Alternativ, wenn eine S35-Met-Kennzeichnung nicht gewünscht ist, kann das mutmaßliche Substrat mit gängigen Tags wie Flag-, HA- oder Myc-Tags markiert werden, was die Erkennung von Caspase-Spaltung durch Immunoblotting ermöglicht.
Es muss nachdrücklich betont werden, dass der Erfolg dieses Protokolls von der sorgfältigen und konsequenten Reinigung der rekombinanten Dronc- und Drice-Proteine abhängt. Leider können diese Proteine nicht – auch nicht kurzfristig – weder im Kühlschrank noch gefroren gelagert werden. Sie verlieren die enzymatische Aktivität über Nacht in jeder gespeicherten Form. Daher müssen sie am Tag des Spalttests frisch zubereitet werden. Unabhängig von dem/den getesteten Kandidatenprotein(en) sollte DriceC211A immer als Positivkontrolle verwendet werden, um die enzymatische Aktivität des Droncwt-Präparats zu validieren (siehe Abbildung 2B,C). Alternativ kann die Aktivität der Dronc- und Drice-Präparate auch durch in vitro-Spaltung von fluorogenen synthetischen Tetrapeptidsubstraten 2,9,31 getestet werden.
Wenn Antikörper zum Nachweis der Kandidatensubstrate verwendet werden, müssen sie vom Anwender32,33 validiert werden. Das gilt auch für kommerziell erhältliche Antikörper, die Epitop-Tags wie Flag, HA, Myc oder andere detektieren. Eine schlechte Antikörperqualität kann wichtige Ergebnisse verschleiern. Eine doppelte Epitopmarkierung der Kandidatensubstrate sowohl auf dem N- als auch auf dem C-Terminus mit unterschiedlichen Tags wird ebenfalls empfohlen34. Wenn eine Spaltung auftritt, hilft die doppelte Markierung, beide Spaltprodukte zu verfolgen, und kann helfen, aufzuklären, ob eine Spaltung an einer oder mehreren Stellen auftritt.
Während dieses Protokoll das bekannte biologische Substrat von Dronc, Drice, leicht validiert, gibt es auch Einschränkungen. Eine Einschränkung besteht darin, dass es sich um ein In-vitro-Protokoll mit rekombinanten Proteinen handelt. In diesen Assays liegen die Caspasen in einer unphysiologisch hohen Konzentration vor, was aus der Beobachtung hervorgeht, dass sie in E. coli spontan autoprozessieren können . Die spontane Autoverarbeitung findet unter den physiologischen Bedingungen in der Regel nicht statt. Diese hohe Caspase-Konzentration kann zu Fehlaktivitäten führen, die zu falsch positiven Ergebnissen führen. Falsch positive Ergebnisse können durch Senkung der Caspase-Konzentration in der In-vitro-Spaltungsreaktion eliminiert werden. Darüber hinaus sind, wie im Folgenden ausführlicher beschrieben, zusätzliche Assays erforderlich, um echte Substrate zu bestätigen und Fehlalarme zu eliminieren.
Die rekombinanten Caspasen haben möglicherweise nicht die gleiche Spezifität wie in ihrer normalen zellulären Umgebung in vivo. Zum Beispiel kann die Aktivität von Caspasen durch posttranslationale Modifikationen modifiziert werden. Diese sind auf den rekombinanten Proteinen nicht vorhanden. Darüber hinaus werden in vivo Initiator-Caspasen, einschließlich Dronc, in große Proteinkomplexe wie das Apoptosom eingebaut. Unter den Bedingungen dieses Protokolls wird die Bildung des Apoptosoms nicht erreicht. Dies würde eine rekombinante Expression von Drosophila Apaf-1 (alias Dark oder Hac-1)35-37 erfordern, die ihre eigenen Herausforderungen hat. Daher hat Dronc in vitro möglicherweise nicht die gleiche Spezifität wie in vivo.
Denkbar ist auch, dass Dronc für nicht-apoptotische Prozesse in einen anderen Proteinkomplex eingebaut wird. Dies könnte eine andere Spaltspezifität als Dronc verleihen, was auch erklären könnte, warum Dronc unter nicht-apoptotischen Bedingungen keine Apoptose induziert. In diesem Zusammenhang verwendet CasCleave die bekannten Spaltungskonsensstellen, um neue Caspase-Substrate vorherzusagen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die gleichen Spaltkonsensstellen auch für nicht-apoptotische Prozesse verwendet werden. Tatsächlich wurde kürzlich gezeigt, dass Caspase-3 seine bevorzugte Konsensusstelle während eines nicht-apoptotischen Prozesses im sich entwickelnden auditorischen Hirnstamm im Hühnerembryo38 ändert. Wenn Initiator-Caspasen in verschiedene Proteinkomplexe eingebaut werden, können sie eine unterschiedliche Spezifität aufweisen und daher bei verschiedenen Konsensussequenzen spalten.
Diese Einschränkungen zeigen, dass es nicht ausreicht, sich ausschließlich auf die in diesem Protokoll beschriebenen In-vitro-Spaltungstests zu verlassen. Es sollten alternative Ansätze verwendet werden, um die mit diesem Protokoll erzielten Ergebnisse weiter zu validieren. Idealerweise sollten In-vivo-Assays verwendet werden, um die folgenden Fragen zu beantworten: Wird das Kandidatenprotein proteolytisch während des nicht-apoptotischen Prozesses in vivo verarbeitet? Wenn ja, wird die gleiche Spaltstelle in vivo und in vitro verwendet? Was ist die Konsequenz, wenn die Spaltung durch Mutagenese der Spaltstelle blockiert wird? Ist die Verarbeitung des Kandidatensubstrats von Caspasen abhängig und wenn ja, welche? Welche Rolle spielen die Spaltfragmente für den nicht-apoptotischen Prozess? Diese Fragen können in genetischen Modellorganismen wie C. elegans und Drosophila mit genetischen und transgenen Standardmethoden leicht beantwortet werden.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine zuverlässige und konsistente Methode zur Herstellung enzymatisch aktiver Caspasen, insbesondere der Drosophila-Caspasen Dronc und Drice . Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist es, zu untersuchen, ob Dronc Kandidatensubstrate in vitro spalten kann, die durch genetische, biochemische oder bioinformatische Ansätze identifiziert wurden. Wie im vorherigen Absatz erläutert, sind zusätzliche Assays erforderlich, um diese Proteine als Caspase-Substrate in vivo zu validieren. Angesichts des Erhaltungsgrades von Caspase-Genen in Metazoen sollte es möglich sein, dieses Protokoll auch an Caspasen anderer Organismen anzupassen.

Der programmierte Zelltod oder die Apoptose wird durch eine Klasse hochspezialisierter Zelltodproteasen ausgeführt, die als Caspasen bezeichnet werden (überprüft in Referenz1). Caspasen sind Cys-Proteasen, die einen Cys-Rest in der katalytischen Stelle enthalten. Sie haben Konsensspaltstellen definiert und Substrate proteolytisch nach Asp-Resten gespalten (obwohl auch berichtet wurde, dass die Drosophila caspase Dronc nach Glu-Resten spaltet2). Sie werden in Initiator- (auch apikale oder stromaufwärts genannte) und Effektor-Caspasen (Henker oder nachgeschaltet) unterteilt. Initiator-Caspasen aktivieren Effektor-Caspasen. Bei Säugetieren spaltet und aktiviert der Initiator Caspase-9 beispielsweise den Effektor Caspase-33. Ebenso spaltet und aktiviert in Drosophila melanogaster die Caspase-9-ortholog Dronc die Caspase-3-ortholog Drice 2,4. Während der Apoptose spalten Effektor-Caspasen Hunderte von Substraten, was zum Tod der Zelle führt5.
Caspasen werden als inaktive Proenzyme (Zymogene) in der Zelle synthetisiert. In dieser Form enthalten sie eine N-terminale Prodomäne, eine große Untereinheit mit den katalytischen Cys im zentralen Teil des Proenzyms und eine kleine Untereinheit am C-Terminus 1 (Abbildung 1). Der Aktivierungsmechanismus unterscheidet sich zwischen Initiator- und Effektor-Caspasen. Initiator-Caspasen (Caspase-9, Dronc) benötigen eine Dimerisierung für die Aktivierung, die durch Einbau in einen großen Proteinkomplex erfolgt, der als Apoptosom6 bezeichnet wird. Für den Einbau in das Apoptosom tragen Caspase-9 und Dronc eine Caspase-Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne (CARD) in der N-terminalen Prodomäne (Abbildung 1). Die Apoptosomenkomponente Apaf-1 enthält ebenfalls eine CARD und rekrutiert Caspase-9 oder Dronc über CARD/CARD-Interaktion in das Apoptosom 3,6,7. Während Caspase-9 und Dronc proteolytisch im Apoptosom verarbeitet werden können, ist diese Verarbeitung für die enzymatischeAktivität 8,9 nicht vollständig erforderlich.
Im Gegensatz dazu tragen Effektor-Caspasen (Caspase-3, Drice) keine CARD in ihren Prodomänen und werden nicht in große Proteinkomplexe zur Aktivierung1 eingebaut. Sie sind abhängig von proteolytischer Spaltung durch aktives Caspase-9 bzw. Dronc1. Der aktive Effektor Caspase bildet ein Tetramer, das aus zwei großen und zwei kleinen Untereinheiten besteht und somit zwei katalytische Stellen enthält (Abbildung 1). Wichtig für dieses Protokoll ist, dass die rekombinante Expression von Caspasen in E. coli die Autoverarbeitung und Aktivierung von Caspasen, einschließlich Drice 10 und Dronc 2,8,9,11,12, auch in Abwesenheit von Apaf-1 verursacht. Diese Autoprozessierung ermöglicht die Durchführung von In-vitro-Spaltungsassays von Kandidatensubstraten mit rekombinantem Caspaseprotein.
Caspasen sind nicht nur an der Apoptose beteiligt, sondern können auch viele nicht-apoptotische Funktionen haben, einschließlich Proliferation, Differenzierung, Zellmigration, neuronales Beschneiden, angeborene Immunität und andere13,14,15. Derzeit ist nicht bekannt, wie Zellen trotz aktiver Caspasen bei nicht-apoptotischen Prozessen überleben können. Es ist möglich, dass diese Zellen Caspasen nur auf subletalen Ebenen16 aktivieren oder aktive Caspasen in nicht-apoptotischen Kompartimenten der Zelle wie der Plasmamembran17,18 sequestrieren. Daher wird die Identifizierung und Verifizierung von nicht-apoptotischen Substraten nicht nur zeigen, wie Caspasen nicht-apoptotische Prozesse vermitteln, sondern kann auch helfen zu verstehen, wie Zellen in Gegenwart aktiver Caspasen überleben können.
Kandidatenproteine als Caspase-Substrate können mit genetischen und biochemischen Methoden identifiziert werden. Identifizierte Proteine können auf das Vorhandensein der Konsensus-Dronc-Spaltstellen überprüft werden. Dies kann durch visuelle Inspektion der Proteinsequenz oder durch die Verwendung ausgefeilterer bioinformatischer Online-Tools wie CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20 erfolgen. Diese Werkzeuge verwenden die bekannten Konsensspaltstellen von Caspasen und strukturelle Überlegungen, um neue Ziele von Caspasen vorherzusagen. Während CasCleave die Informationen von verifizierten Substraten aus menschlichen Caspases-1, -3, -6, -7 und -8 enthält, kann es dennoch auch für die hier beschriebenen Zwecke nützlich sein, da diese Caspasen und ihre Konsensspaltstellen gut erhalten sind. Da die Dronc-Spaltstelle jedoch nicht gut definiert ist (zwei Studien identifizierten zwei verschiedene optimale Spaltstellen, TATD/E2 und LALD9), werden die Kandidatensubstrate auch auf das Vorhandensein anderer Caspase-Spaltstellen, einschließlich Drice, untersucht.
Um die vorhergesagten Substrate von Caspasen zu validieren, sind zusätzliche Assays notwendig. Einer dieser Assays ist der Nachweis, dass eine gegebene Caspase das Kandidatenprotein tatsächlich in vitro spalten kann. Hier bieten wir ein praktisches Protokoll für In-vitro-Caspase-Spaltungstests . Mit diesem Protokoll werden Kandidatensubstrate mit Dronc als Caspase getestet. Sie können auch als Substrate von Drice getestet werden. Obwohl dieses Protokoll für die Drosophila caspases Dronc und Drice geschrieben ist, kann es auch für Caspasen anderer Organismen angepasst werden.
Die Extraktion und Reinigung von Dronc und Drice zusammen mit dem In-vitro-Spaltungstest muss aufgrund des Verlusts der katalytischen Aktivität durch diese Caspasen am selben Tag durchgeführt werden. Dieses Protokoll wurde gegenüber früheren Veröffentlichungen 8,9,11,12,21,22 modifiziert und optimiert. In diesem Protokoll werden vier verschiedene Caspase-Proteine rekombinant im E. coli-Stamm BL21 (DE3) pLysS exprimiert. Diese Proteine sind: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt und 6xHis-DriceC211A. Jedes dieser Proteine wird am N-Terminus zur Reinigung mit 6 Histidinresten (6xHis) markiert. Dronc wt und Dricewt sind die Wildtyp-Proteine und können bei rekombinanter Expression automatisch in die aktive Caspase umgewandelt werden. DroncC318A und DriceC211A kodieren mutierte Formen von Dronc und Drice, die den katalytischen Cys-Rest in einen Ala-Rest umwandeln. Diese Konstrukte sind katalytisch inaktiv und können nicht automatisch verarbeitet werden (siehe Abbildung 2A). Sie werden als Kontrollen im Spalttest verwendet. Da DriceC211A nicht autoprozessieren kann, wird es auch als Modellsubstrat für Droncwt in dem hier beschriebenen In-vitro-Spaltungsassay verwendet.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7076P2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc-Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7074P2</td><td></td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer</td><td>Eppendorf</td><td>#6131</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) pLysS Competent Cells</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA-25.50</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc mit Bildsoftware</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II</td><td>Für die Chemiluminiszenz-Bildgebung</td></tr><tr><td>Chemiluminiszenz-Substrat</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>34095</td><td>Für die Chemiluminiszenz-Bildgebung</td></tr><tr><td>Gespaltene Drosophila ICE (drICE) (Asp230)</td><td>Antikörper-Zellsignaltechnologie</td><td>9478S</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Küvetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955128</td><td>Zur Messung des Bakterienwachstums und der Proteinkonzentration</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610610</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben, 1000 mL</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS49801L</td><td>Für die Vorbereitung von LB-Agar-Medien und das Autoklavieren</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben, 250 mL</td><td>Millipore sigma</td><td>CLS4980250</td><td>Für das Wachstum und die Induktion von Bakterienkulturen.</td></tr><tr><td>Ethylen-Diamin-Tetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Geltank SDS-PAGE System</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>STM1001</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>His-Drice-pET28a&nbsp;</td><td>Diese Studie</td><td>N/A</td><td>Verfügbar von den Autoren</td></tr><tr><td>His-DriceC211A-pET28a&nbsp;</td><td>Diese Studie</td><td>N/A</td><td>Verfügbar von den Autoren</td></tr><tr><td>His-Dronc-pET28a&nbsp;</td><td>Diese Studie</td><td>N/A</td><td>Verfügbar von den Autoren</td></tr><tr><td>His-DroncC318A-pET28a&nbsp;</td><td>Diese Studie</td><td>N/A</td><td>Verfügbar von den Autoren</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>FERR0392</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Pulver)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>LB Brühe, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Mikrobiologischer Platteninkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-650D</td><td>Für das Koloniewachstum nach der Transformation</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Röhrchenrotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>zum Mischen von bakteriellen Lysaten und Ni-NTA</td></tr><tr><td>Agarose Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierte Pipettiersteuerung</td><td>Gilson</td><td>F110120</td><td>Zur Verwendung von serologischen Pipetten</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP330-1</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 bis 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Midi-Protein-Gel, 20 Well</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>WG1402BOX</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer (20x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Puffer (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>Orbital-Schüttel-Inkubator mit Temperaturregelung</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>C25 Inkubator-Schüttler</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Beschichtungsperlen</td><td>Zymo research</td><td>S1001</td><td>Zum Verteilen von Kulturen auf AmpR/KanR-Platten</td></tr><tr><td>Polypropylen-Säulen (1 mL)</td><td>Qiagen</td><td>34924</td><td>Für die Aufreinigung von His-markierten Proteinen</td></tr><tr><td>Precision Plus Proteinstandards</td><td>Bio-Rad</td><td>#161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Protein Assay Farbstoffreagenzkonzentrat</td><td>Bio-Rad</td><td>#5000006</td><td></td></tr><tr><td>pT7CFE1-NMyc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>88863</td><td>Für die Klonierung von Substraten für die RRL-Expression</td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>Invitrogen</td><td>LC2007</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polypropylen Röhrchen mit rundem Boden</td><td>Fisher Scientific</td><td>352029</td><td>Für die Züchtung von Plasmidkulturen</td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19095</td><td>Zum Halten von Polypropylensäulen während der Reinigung</td></tr><tr><td>Gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td></td></tr><tr><td>rRNasin Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N251A</td><td>Für die RRL-Expression</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher </td><td>Scientific BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Falcon-Röhrchen, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Falcon-Röhrchen, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70903-250G</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Serologische Pipetten, steril</td><td>celltreat</td><td>229001B</td><td>Für die Lyse von Bakterienzellen in 50-ml-Röhrchen</td></tr><tr><td>TnT Gekoppeltes Retikulozyten-Lysat -T7</td><td>Promega</td><td>L4611</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>2340</td><td></td></tr><tr><td>Western Nasstransferkassette</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>STM2001</tr></tbody></table>

in vitro spaltungstests mit gereinigten rekombinanten drosophila-caspasen für das substrat-screening

In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening

Caspasen sind sehr spezifische Zelltodproteasen, die an apoptotischen und nicht-apoptotischen Prozessen beteiligt sind. Während die Rolle von Caspasen während der Apoptose sehr gut definiert ist und viele apoptotische proteolytische Substrate von Caspasen identifiziert und charakterisiert wurden, ist die Rolle von Caspasen für nicht-apoptotische Prozesse nicht gut verstanden. Insbesondere wurden bisher nur wenige nicht-apoptotische Substrate von Caspasen identifiziert. Um die Identifizierung und Charakterisierung potenzieller Caspase-Substrate zu erleichtern, wird hier ein Protokoll beschrieben, das die Prüfung von Kandidatensubstraten in Caspase-Spaltungsassays in vitro ermöglicht. Dieses Protokoll umfasst die Herstellung und Reinigung von rekombinanten Caspase-Proteinen, die Herstellung der Kandidatensubstrate entweder rekombinant oder in einem zellfreien Expressionssystem und die eigentliche In-vitro-Spaltungsreaktion gefolgt von SDS-PAGE und Immunoblotting. Dieses Protokoll ist auf die Drosophila caspases Dronc und Drice zugeschnitten, kann aber leicht an Caspasen anderer Organismen, einschließlich Säugetiere, angepasst werden.

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Caspase-Proteininduktion in E. coli, die Reinigung der rekombinanten Drosophila caspasen Dronc und Drice, die Synthese von Kandidatensubstraten und die in vitro Spaltungsreaktion mit Kandidatensubstraten (hier DriceC211A) und der Caspase Dronc. Die katalytische Mutante DriceC211A wurde in diesem Assay als Modellsubstrat verwendet, da sie keine Autoverarbeitungsaktivität aufweist (Abbildung 2A) und in voller Länge bleibt, bis sie von Droncwt. DriceC211A sollte immer als Positivkontrolle verwendet werden, um zu validieren, dass das Droncwt-Präparat enzymatische Aktivität aufweist.
Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Beispiel für die Expression und Reinigung rekombinanter Caspasen. Vier verschiedene rekombinante Caspasen wurden induziert und gereinigt: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt und 6xHis-DriceC211A. Die gereinigten Caspasen wurden von SDS-PAGE durchgeführt, immunoblottiert, und der Blot wurde mit einem Anti-His-Antikörper (verdünnt 1:5.000; gefolgt von Anti-Maus-IgG, HRP-verknüpftem Antikörper (1:10.000)) untersucht. Der unverarbeitete 6xHis-Dronc (proDronc) läuft mit einem relativen Molekulargewicht (MW r) von 55 kDa (Bahn 2) und der unverarbeitete 6xHis-Drice (proDrice) hat einen MWr von 35 kDa (Bahn 4). Die Autoverarbeitung der Caspasen ist durch das Auftreten von Bändern kleinerer MWr sichtbar, die aufgrund des Vorhandenseins des His-Tags am N-Terminus die großen Untereinheiten der Caspasen darstellen (Abbildung 1). Im Fall von 6x-Dronc hat die große Untereinheit eine MWr von 40 kDa (Bahn 1). Die große Untereinheit von 6x-Drice läuft mit 23 kDa (Bahn 3). Die katalytischen Mutanten 6xHis-DroncC318A und 6xHis-DriceC211A können nicht automatisch verarbeitet werden und sind nur als Proteine in voller Länge nachweisbar (Lanes 2 und 4).
Abbildung 2B Um nachzuweisen, dass das bakteriell hergestellte und gereinigte 6xHis-Droncwt-Präparat enzymatische Aktivität aufweist, wurde ein in vitro Spaltungsassay wie in diesem Protokoll beschrieben durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde die katalytische Mutante 6xHis-Dronc318A verwendet. Das Substrat war RRL-generiertes N-Myc-DriceC211A, das am N-Terminus mit einem Myc-Tag markiert ist. Nach der In-vitro-Spaltungsreaktion wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt, immunoblottiert und die Blots wurden mit einem Anti-Myc-Antikörper (verdünnt 1:1.000) inkubiert, gefolgt von Anti-Maus-IgG, HRP-verknüpftem Antikörper (1:10.000)), um N-Myc-DriceC211A nachzuweisen. Eine erfolgreiche Spaltung und damit enzymatische Aktivität der Caspase kann durch das Auftreten mindestens einer Bande kleinerer MWr im Vergleich zur volllangen, unverarbeiteten Form des Substrats nachgewiesen werden. Unverarbeitete N-Myc-Drice C211A in voller Länge hat eine MWr von 40 kDa (Bahnen 2 und 4), während die große Untereinheit von verarbeitetem N-Myc-DriceC211A mit 30 kDa (Bahn 3) läuft. Bahn 1 stellt das unprogrammierte RRL-Lysat dar (kein Plasmid/Transkript hinzugefügt). Lane 2 demonstriert die In-vitro-Produktion von DriceC211A durch RRL-Expression. Bahn 3 enthält die in vitro Spaltungsreaktion mit 6xHis-Droncwt. Bahn 4 enthält die in vitro Spaltungsreaktion mit 6xHis-DroncC318A.
Abbildung 2C Eine in vitro Spaltungsreaktion, die sowohl rekombinante als auch gereinigte Caspase (6xHis-Droncwt und 6x-His-DroncC318A) und Substrat (6xHis-DriceC211A) nach diesem Protokoll verwendet, wurde mittels SDS-PAGE und immunoblot analysiert. Zur Analyse der Spaltungsreaktion wurde in diesem Immunoblot der anti-gespaltene Drice-Antikörper (verdünnt 1:5.000; gefolgt von Anti-Kaninchen-IgG, HRP-verknüpfter Antikörper (1:10.000)) verwendet. Der anti-gespaltene Drice-Antikörper detektiert sein Neo-Epitop in der großen Untereinheit (23 kDa) von 6xHis-DriceC211A erst nach Verarbeitung durch 6xHis-Droncwt (Bahn 1). Die katalytische Mutante 6xHis-DroncC318A ist in diesem Assay nicht in der Lage, 6xHis-Drice C211A zu verarbeiten, und 6xHis-DriceC211A in voller Länge erscheint als schwaches unverarbeitetes Band von 35 kDa (Bahn 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig01.jpg"> Abbildung 1: Domänenstruktur der Initiator-Caspasen Caspase-9 und Dronc und der Effektor-Caspasen Caspase-3 und Drice. CARD - caspase Aktivierungs- und Rekrutierungsdomäne; Cys - relative Lage des katalytischen Cysteinrestes; L - große Untereinheit; S - kleine Untereinheit. Der Standort der N-terminalen Prodomänen wird angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64392/64392fig02.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse. (A) Immunoblot-Analyse von gereinigten rekombinanten 6xHis-Dronc- und 6xHis-Drice-Präparaten, untersucht mit einem Anti-His-Antikörper. Unbearbeitet (proDronc und proDrice) und gespalten 6xHis-Dronc und 6xHis-Drice sind durch Pfeile gekennzeichnet. MW-Marker sind auf der linken Seite angezeigt. (B) Immunoblot-Analyse der In-vitro-Spaltungsreaktion von RRL-generiertem N-Myc-Drice mit Caspasen 6xHis-Droncwt (Spur 3) oder 6x-His-DroncC318A (Spur 4), die mit einem Anti-Myc-Antikörper untersucht wurden. Unprogrammierte und programmierte (N-Myc-DriceC211A) RRL-Reaktionen werden geladen und in den Bahnen 1 und 2 getrennt. Unverarbeitet (proDrice) und gespaltenes N-Myc-Drice sind durch Pfeile gekennzeichnet. MW-Marker sind auf der linken Seite angezeigt. (C) Immunoblot-Analyse der In-vitro-Spaltungsreaktion von bakteriell exprimierten und gereinigten rekombinanten 6xHis-Drice C211A mit Caspasen 6xHis-Droncwt (Spur 1) oder 6x-His-DroncC318A (Spur 2), untersucht mit einem anti-gespaltenen Drice-Antikörper. Durchgehende Länge (proDrice) und gespaltene 6xHis-DriceC211A sind durch Pfeile gekennzeichnet. MW-Marker sind auf der linken Seite angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/64392fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Diese Tabelle enthält Primer, die für das Klonen in pET28a-Vektor verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Diese Tabelle enthält die Zusammensetzung der Puffer und Medien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64392/Supplementary%20Table2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Drosophila caspases Dronc und Drice und deren Verwendung in In-vitro-Spaltungsassays .

In vitro Spaltungstests mit gereinigten rekombinanten Drosophila-Caspasen für das Substrat-Screening

Caspases are very specific cell death proteases that are involved in apoptotic and non-apoptotic processes. While the role of caspases during apoptosis ...

Caspasen sind Cysteinproteasen, die Substrate während der Apoptose und nicht-apoptotischer Prozesse spalten. Dieses Protokoll beschreibt einen in vitro Spaltungsassay zur Identifizierung mutmaßlicher Substrate des Initiators Caspase Dronc aus Drosophila. Bei sorgfältiger Befolgung bietet dieses Protokoll ein zuverlässiges Verfahren für das Hochdurchsatz-Screening von mutmaßlichen Substraten der Caspase Dronc oder einer anderen Caspase.Obwohl dieses Protokoll für In-vitro-Spaltungstests mit Drosophila caspase Dronc entwickelt wurde, kann es leicht für Caspasen anderer Organismen, einschließlich Säugetiere, angepasst werden. Es ist wichtig, dass die Reinigung der rekombinanten Caspasen und die In-vitro-Spaltungstests noch am selben Tag durchgeführt werden, da diese Caspase-Präparate schnell an enzymatischer Aktivität verlieren. Das Verfahren wird Dr. Prathibha Yarikipati, eine Postdoktorandin aus meinem Labor, demonstrieren.Um zu beginnen, entfernen Sie die gefrorenen Röhrchen mit den pelletierten Kulturen aus der Lagerung von minus 80 Grad Celsius und halten Sie sie 10 Minuten auf Eis, um das Pellet weich zu machen. Nach 10 Minuten 0,6 Milliliter bakterieller Zelllysepuffer, ergänzt mit frisch hinzugefügten Proteaseinhibitoren, 10 Milligramm pro Milliliter Lysozym und 50 Einheiten pro Milliliter Benzonase, in die pellethaltigen Röhrchen mit einem Pipettencontroller mit einer einmilliliter serologischen Pipette geben. Lösen Sie das Pellet mit derselben Pipettenspitze auf, indem Sie auf und ab pipettieren, bis eine klare, hellgelbe Lösung ohne Pelletpartikel sichtbar ist, und inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.Lysate in geeignete Zentrifugenröhrchen überführen und bei 17.000 G für 40 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Die Überstände werden in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das der Rohextrakt ist, der die Caspasen enthält, und halten Sie die Röhrchen auf Eis. Fügen Sie 0,2 Milliliter der 50% igen Aufschlämmung Ni-Ni-Nitrilessigsäure-Agarose zu jedem Röhrchen der Caspase-Extrakte hinzu und drehen Sie die Röhrchen auf einem End-on-End-Rotator für eine Stunde bei 4 Grad Celsius.Nach einer Stunde den Extrakt mit der Ni-Nitrilessigsäure-Agarose zu einer Milliliter-Polypropylen-Säule mit intakter Spitze in ein Gestell geben und fünf Minuten stehen lassen, damit sich Ni-Nitrilessigsäure-Agarose absetzen kann. Entfernen Sie nach fünf Minuten die Kappe der Säulen und lassen Sie den Überstand durch Schwerkraft ausströmen. Dann geben Sie vorsichtig einen Milliliter des Waschpuffers zu den Säulen, ohne das verpackte Harz der Ni-Nitrilessigsäure-Agarose zu stören, und waschen Sie es durch den Schwerkraftfluss.Zur Elution der Caspasen legen Sie 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen unter die Auffangdüse der Säulen, nachdem der Waschpuffer vollständig entleert wurde. Dann fügen Sie 0,5 Milliliter des Elutionspuffers zu jeder Säule hinzu und sammeln Sie das Elutionsmittel in den 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Elutionsmittel auf Eis und messen Sie die Konzentration der Proteine mit dem Bradford-Assay.Je nach Expressionsgrad des mutmaßlichen Substrats verwenden Sie 1 bis 10 Mikroliter des Kaninchen-Retikulozyten-Lysats, das mit dem interessierenden Protein im Spalttest programmiert ist, und halten Sie es auf Eis. Fügen Sie 10 Mikrogramm zuvor erzeugtes gereinigtes Caspase-Protein hinzu und bringen Sie das Gesamtreaktionsvolumen mit Caspase-Assay-Puffer auf 50 Mikroliter. Die Reaktionen werden drei Stunden lang in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius inkubiert, wobei die entsprechenden Kontrollen in den Spaltungstest einbezogen werden.Nach drei Stunden stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie die Röhrchen auf Eis übertragen und ein Volumen LDS-Probenpuffer mit 50 Millimolar DTT hinzufügen. Inkubieren Sie die Proben bei 75 Grad Celsius in einem Hitzeblock für 10 Minuten. Schnell drehen, durch Flicken mischen, 24 Mikroliter pro Probe laden und die SDS-Seite ausführen oder die Proben bei minus 20 Grad Celsius lagern.Vier verschiedene rekombinante Caspasen wurden induziert, gereinigt und mittels SDS-PAGE analysiert, immunoblottiert und der Blot mit einem Antihistidin-Antikörper untersucht. Der unverarbeitete 6x-Histidin Dronc läuft mit einem relativen Molekulargewicht von 55 Kilodalton und der unverarbeitete 6x-His DRICE hat ein Molekulargewicht von 35 Kilodalton. Die automatische Verarbeitung der Caspasen ist durch das Auftreten von Bändern mit kleinerem Molekulargewicht sichtbar.Für gespaltene Dronc ist es ein Band von 40 Kilodalton. Für gespaltenen Drice ist es ein Band von 23 Kilodalton. Nach der In-vitro-Spaltungsreaktion wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt, immunoblottiert und die Blots wurden mit einem Anti-Myc-Antikörper inkubiert, um Amino-terminale Myc-markierte Drice C211A nachzuweisen.Die Ergebnisse zeigten, dass das bakteriell hergestellte und gereinigte 6x-Histidin Dronc Wildtyppräparat enzymatische Aktivität aufweist. Dies ist durch das Vorhandensein des kleineren Bandes von gespaltenem Drossel im Vergleich zu ungespaltenem ProDrice sichtbar. Die in vitro Spaltungsreaktion, die sowohl rekombinante Caspase als auch Substrat verwendet, wurde mittels SDS-PAGE und Immunoblot analysiert.Zur Analyse der Spaltungsreaktion wurde in diesem Immunoblot der antigespaltene Drice-Antikörper verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass das bakteriell hergestellte und gereinigte 6x-His Dronc Präparat enzymatische Aktivität aufweist. Dies ist durch das Vorhandensein des kleineren Bandes von gespaltenem Drice im Vergleich zum ungespaltenen proDrice sichtbar.Bitte denken Sie daran, dass rekombinante Caspasen schnell an enzymatischer Aktivität verlieren. Sie können nicht gelagert werden, auch nicht bei minus 80 Grad Celsius. Die In-vitro-Spaltungstests müssen am selben Tag durchgeführt werden.Positive Treffer im In-vitro-Spaltungstest sollten in vivo validiert werden. Dies kann in Zellen oder in genetischen Modellorganismen wie Drosophila oder C.elegans erfolgen.

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