Präklinische Arzneimitteltests in skalierbaren 3D-Muskelgeweben

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe bereit und beschreibt deren Verwendung in präklinischen Arzneimittel-Screening-Modalitäten. Die beschriebenen Methoden verwenden ein magnetisches Sensorsystem, um die gleichzeitige Beurteilung von 24 Geweben parallel zu ermöglichen.

Unsere Plattform verwendet 3D-konstruiertes Muskelgewebe und magnetische Sensorhardware, um die Kontraktilität über 24 Vertiefungen gleichzeitig zu messen. Dies bietet eine Methode mit höherem Durchsatz für die Bewertung neuer Therapeutika in vitro unter Verwendung von menschlichem Muskelgewebe. Unsere Gießmethode verbessert die Konsistenz und Reproduzierbarkeit bei der Herstellung von 3D-Muskelgewebe.

Wir haben eine verschleißbare 24-Well-Gießplatte entwickelt, die mit magnetischer Sensorhardware für Kontraktilitätsmessungen und -analysen auf unserer Plattform ausgestattet ist. Diese Methode kann wertvolle Einblicke in die In-vitro-Krankheitsmodellierung, die Wirkstoffforschung und die Gentherapie für jede Muskelerkrankung liefern, die die Kontraktilität beeinflusst. Wir integrieren derzeit Motoneuronen in unsere 3D-Konstrukte, um auch ein neuromuskuläres Verbindungsmodell zu erstellen.

Legen Sie zunächst ein vorgekühltes Gewebegussset auf einen kalten Block oder Eis in der Zellkulturhaube. Legen Sie die Gussplatte flach auf Eis. Fügen Sie Thrombin zum Basismedium hinzu, um die Thrombinlösung herzustellen, und bewegen Sie das Pfostengitter von der Gießplatte auf eine neue sterile 24-Well-Platte.

Pipettieren Sie 50 Mikroliter Thrombinlösung in jede vorgekühlte Vertiefung der Gießplatte und setzen Sie das Gitter wieder auf das Kit. Legen Sie das Casting-Kit auf Eis beiseite. Als nächstes fügen Sie 500 Milliliter RPMI-Medium, 10 Milliliter B27 und 2,5 Gramm Aminocapronsäure oder ACA hinzu, um das Herz-EMT-Medium herzustellen.

Nehmen Sie das EMT-Medium heraus, das zum Gießen des Gewebes verwendet wird, und fügen Sie 10 mikromolare ROCK-Inhibitoren hinzu. Bereiten Sie das Skelett-EMT-Medium vor, indem Sie 50 Milliliter F10-Medium und 0,25 Gramm Aminocapronsäure (ACA) für primäre Myoblasten hinzufügen. Verwenden Sie 0,1 Gramm ACA für IPSC-abgeleitete Myoblasten.

Filtern Sie dann das ACA-haltige Gießmedium steril. Erwärmen Sie das Dissoziationsreagenz in Zellkulturqualität und ein gleiches Volumen EMT-Medium auf 37 Grad Celsius. Dieses erwärmte EMT-Medium wird verwendet, um das Dissoziationsreagenz zu verdünnen.

Waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie das erwärmte Dissoziationsreagenz hinzu, um die Zellen anzuheben. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang oder bis sich die Zellen angehoben haben, und überprüfen Sie die Kulturen alle zwei bis drei Minuten, indem Sie auf die Seite der Platte klopfen. Sobald sich die Zellen angehoben haben, übertragen Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Trituieren Sie mit einer P-1000-Pipette, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Waschen Sie die Platte und den Kolben mit einem zusätzlichen EMT-Medium, um die restlichen Zellen aufzufangen und in das konische Röhrchen zu geben. Trituieren Sie die Zellen erneut, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.

Fügen Sie EMT-Medium hinzu, um den Dissoziationsprozess zu beenden, und entnehmen Sie dann Proben der Zellsuspensionen für die Zellzählung. Führen Sie Zellzählungen mit einem automatischen Zellzähler oder einem Hämozytometer in Trypanblau durch. Schleudern Sie die Zellen vier Minuten lang bei 200 G, saugen Sie den Überstand ab und suspendieren Sie die Zellen erneut in fünf Millilitern des EMT-Basismediums, um das restliche Dissoziationsreagenz zu entfernen.

Nach erneutem Zentrifugieren für vier Minuten wird der Überstand abgesaugt und die Zellsuspensionen in den entsprechenden Dichten hergestellt. Berechnen Sie das Volumen jeder Zelllösung, das erforderlich ist, um die gewünschte Anzahl von Geweben zu bilden, und pipettieren Sie das berechnete Zellvolumen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 10 Mikroliter Fibrinogen pro EMT in die Zellsuspension und legen Sie sie auf Eis.

Stellen Sie sicher, dass jedes EMT 90 Mikroliter Zellsuspension, 10 Mikroliter Fibrinogen und 50 Mikroliter Thrombinlösung im endgültigen Gewebekonstrukt enthält. Entfernen Sie in einer Zellkulturhaube den Deckel des Gewebegusskits und legen Sie die Gießplatte mit dem Pfostengitter flach auf das Eis. Mischen Sie die Zellfibrinogenmischung und ziehen Sie 100 Mikroliter mit einer P-200-Pipette auf.

100 Mikroliter der Mischung in Vertiefungen geben, die mit 50 Mikrolitern Thrombinlösung vorbereitet sind, und fünfmal trituieren, um gut zu mischen. Schieben Sie die Pipette nicht über den ersten Anschlag hinaus und entfernen Sie die Spitze nach der Verreibung, um Blasen zu vermeiden. Mischen Sie die Zellsuspension im konischen Röhrchen, bevor Sie jedes Gewebe gießen.

Halten Sie sowohl das Gitter als auch die Gießlochplatte gleichzeitig mit dem Zeigefinger und dem Daumen einer Hand fest, um eine Bewegung des Gitters zu vermeiden, oder lassen Sie die Platte flach auf Eis liegen und schaukeln Sie den Eiskübel, um in die Gießplatte zu sehen. Wiederholen Sie dies mit einer frischen P-200-Spitze für jedes Gewebe, bis alle Gewebe gegossen sind. Übertragen Sie das ausgesäte Kit vorsichtig in den Inkubator und inkubieren Sie es 80 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Als nächstes bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit zwei Millilitern pro Well des EMT-Mediums für Herzgewebe vor und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius, um das Medium zu erwärmen. Nach der 80-minütigen Inkubation geben Sie vorsichtig einen Milliliter des EMT-Mediums an den Rand der Gießvertiefungen und inkubieren weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Heben Sie nach 10 Minuten Inkubation das Pfostengitter vorsichtig an und übertragen Sie das Gewebe von der Gießplatte auf eine vorbereitete 24-Well-Platte mit dem erwärmten Medium.

Zum Schluss bringen Sie die Platten mit den Geweben bei 37 Grad Celsius in den Zellkulturinkubator zurück. Eine erfolglose EMT-Produktion kann von katastrophalen Fehlern wie der Gewebeablösung von den Pfosten bis hin zu subtileren strukturellen Fehlern wie Luftblasen und ungleicher Gewebeablagerung um beide Pfosten reichen. EMT-Konstrukt einen Tag nach dem Gießen ist hier dargestellt.

Skelettmuskelgewebe wurde ab dem Tag Null der Zellfusion und Hydrogelverdichtung in ein Differenzierungsmedium überführt. Vom siebten bis zum 28. Tag zeigte derselbe EMT eine etwas kürzere Gesamtlänge zwischen den beiden Pfosten und eine geringere Breite, wenn er durch den mittleren Abschnitt des EMT gemessen wurde. Vier Gewebeplatten wurden über einen Zeitraum von 21 Tagen verfolgt, wobei der EMT-Durchmesser während der gesamten Verdichtung verglichen wurde.

Zeitpunkte zeigen eine konsistente EMT-Größe zwischen den Platten. Die maximale Verdichtung wird am 21. Tag erreicht, wenn der Matrixumbau stabilisiert wird. Die Immunhistochemie der EMTs ist hier dargestellt.

EMTs wurden am 10. Tag der Kultur fixiert und in Paraffin eingebettet. Dünne Querschnitte wurden vor der Bildgebung mit Antikörpern gegen Myosin, schwere Ketten und Dystrophin gefärbt. Diese grafischen Bilder stellen die durchschnittliche absolute Zuckenkraft dar, die von den Herz-EMTs und den Skelett-EMTs im Laufe der Zeit gemessen wurde.

Die akute und chronische Behandlung mit Doxorubicin in künstlich hergestelltem Herzgewebe wird hier gezeigt. Drei verschiedene Dosiskonzentrationen von Dox wurden entweder im Bolus verabreicht oder über einen Zeitraum von 27 Tagen kontinuierlich an künstlich hergestelltes Herzgewebe verabreicht. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung gegenüber BDM in künstlich hergestelltem Skelettmuskelgewebe ist in dieser Abbildung dargestellt.

Die Herzschlagfrequenz oder die Zuckenfrequenz hört dosisabhängig auf, zusammen mit einem Aufhören der kontraktilen Kraft, was auf eine Kardiotoxizität hinweist, wenn Rettungssanitäter dieser Verbindung ausgesetzt sind. Die wichtigsten Dinge, die Sie beim Gießen von Geweben beachten sollten, sind, dass Sie alles jederzeit kalt halten, einschließlich Ihrer Zellsuspension und Reagenzien, und das Pfostengitter nach Beginn des Gießens vollständig stationär zu halten.