Name: Niedrigdosis-Gammastrahlen-Sterilisation für dezellularisierte Trachealtransplantate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Niedrigdosis-Gammastrahlen-Sterilisation für dezellularisierte Trachealtransplantate aus Kaninchen. Diese Methode ermöglicht effektive Sterilisation bei Erhalt der Organcharakteristiken.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [Nummer 180101 vergeben an Néstor J. Martínez-Hernández] und PI16-01315 [verliehen an Manuel Mata-Roig] vom Instituto de Salud Carlos III. CIBERER wird durch den VI. Nationalen F&E&I-Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, das Consolider-Programm, CIBER Actions und das Instituto de Salud Carlos III mit Unterstützung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung finanziert.

Die europäische Richtlinie 20170/63/EU für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren wurde eingehalten und das Prüfprotokoll wurde von der Ethikkommission der Universität Valencia genehmigt (Gesetz 86/609/EWG und 214/1997 und Code 2018/VSC/PEA/0122 Typ 2 der Regierung von Valencia, Spanien).
1. Dezellularisierung der Trachea
ANMERKUNG: Über die Dezellularisierungsmethode wurde an anderer Stelleberichtet 20.
<ol><li>Männliche erwachsene neuseeländische weiße Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) mit einem Gewicht von 3,5 bis 4,1 kg mit 133 mg/kg Pentobarbital-Natrium mit einer Injektion von 200 mg/ml durch die marginale Ohrvene einschläfern.</li>
	<li>Führen Sie unter aseptischen Bedingungen eine zentrale Längszervikotomie durch, präparieren Sie die Halsmuskulatur und nähern Sie sich der Luftröhre. Präparieren Sie das Organ in Umfangs- und Längsrichtung. Zum Schluss transekten Sie unter dem ersten Ring und knapp über der Carina.</li>
	<li>Schneiden Sie die Luftröhren mit einem Skalpell in 2 cm große Stücke. Entfernen Sie mit einer Schere das umliegende Bindegewebe und die innere Schleimhautschicht6.</li>
	<li>Tauchen Sie die Proben in 12 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die 2 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 5 % Penicillin-Streptomycin und 5 % Amphotericin B enthält.</li>
	<li>Setzen Sie die Luftröhren 5 Wochen lang bei Raumtemperatur einem ständigen Rühren mit einem Magnetrührer bei 400 U/min aus. Ersetzen Sie die Dezellularisierungslösung wöchentlich nach einem 2-stündigen osmotischen Schock durch Eintauchen der Luftröhre in destilliertes Wasser.</li>
	<li>Kryogene Sie die Proben mit einer 12-ml-Mischung aus 80 % fötalem Kälberserum (FBS) und 20 % Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Gefrierbehälter bei -80 °C.</li>
	<li>Wenn die Luftröhren verwendet werden sollen (nach 13-15 Tagen), tauen Sie sie in einem Wasserbad bei 37 °C auf und waschen Sie sie, indem Sie sie nach dem Auftauen in PBS tauchen.</li>
</ol>2. Sterilisation
<ol><li>Bestrahlung<ol><li>Chargen von vier Trachealstücken mit einer Größe von jeweils 2 cm in einen 20 ml Methacrylat in einen mit PBS gefüllten T25-Kulturkolben geben, bis ein Gesamtvolumen von 30 ml erreicht ist. Achten Sie darauf, dass sich keine Blasen bilden, die zu einer Energiediffusion in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche führen könnten.</li>
		<li>Führen Sie die Bestrahlung mit einem Linearbeschleuniger mit Photonen mit einer Nennenergie von 10 MV durch, die filterfreie Strahlen abflachen. Wenden Sie eine Dosisleistung von 2.400 Monitoreinheiten pro Minute am Isozentrum an, wobei die Luftröhren in einem Abstand von 100 cm zwischen Quelle und Oberfläche platziert werden, mit einer Schärfentiefe von 2,5 cm für ein Strahlungsfeld von 10 cm x 10 cm, um den gesamten Behälter abzudecken, was einer Dosis von 24 Gy/min entspricht.</li>
		<li>Eskalieren Sie die Dosen mit jeder vierteiligen Charge; vier Stücke werden 0,5 kGy, vier bis 1 kGy, vier bis 2 kG usw. ausgesetzt, bis die Sterilisation erreicht ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Kultur<ol><li>Geben Sie die Stücke in 30 ml Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM) mit inaktivierten 10% FBS ohne Antibiotika oder Antimykotika.</li>
		<li>In einem handelsüblichen Gewebeinkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultivieren und alle 24 h inspizieren. HINWEIS: Die Kontaminationsparameter sind Änderungen des pH-Werts des Nährmediums und dementsprechend Änderungen der Farbe und Trübung des Mediums. Die Luftröhren wurden von keimfreien Hasenartigen geerntet, die nicht krank waren und daher frei von anaeroben Bakterien in ihren Luftröhren waren.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Histologische Analyse
Anmerkungen: Färben Sie die Stücke mit Hämatoxylin und Eosin21, Massons Trichrom und Orcein22.
<ol><li>DAPI-Färbung<ol><li>Bestimmung der Gewebeviabilität mittels DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol). Diese blau fluoreszierende Färbung bindet stark an Adenin- und Thymin-reiche Regionen in DNA-Sequenzen und ermöglicht daher die Betrachtung der DNA mittels Fluoreszenzmikroskopie.</li>
		<li>Betten Sie die Gewebeproben in eine Mischung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) ein.</li>
		<li>Schneiden Sie die Proben mit einem Kryostaten.</li>
		<li>Waschen Sie die zu färbende Probe dreimal in destilliertem Wasser, um die OG zu entfernen. Legen Sie sie in ein Eindeckmedium, das eine 30-nM-DAPI-Lösung enthält.</li>
		<li>Visualisierung der Fluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskopie.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des DNA-Gehalts<ol><li>Schneiden Sie mit einem Skalpell etwa 3 mm lange Luftröhrensegmente ab.</li>
		<li>2 h in Proteinase K (Materialtabelle) inkubieren.</li>
		<li>Extrahieren Sie die DNA mit einem DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Mittels Spektralphotometrie wird die DNA-Konzentration bestimmt, indem die Absorption bei 260/280 mit einem Spektralphotometer gemessen wird.</li>
		<li>Messen Sie die Größe der extrahierten DNA-Proben mittels Kapillarchromatographie mit einem Bioanalysator.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Biomechanische Studie
ANMERKUNG: Der Trachealwiderstand gegen Längs- und Querkräfte wird durch axiale Zug- und Radialdruckversuche23 gemessen.
<ol><li>Trachealmessung<ol><li>Messen Sie die Tracheallänge, die Wandstärke und den Außendurchmesser mit einem Messschieber.</li>
		<li>Berechnen Sie die Durchschnittswerte aus drei zufälligen Messungen jeder der Variablen.</li>
		<li>Berechnen Sie bei den radialen Druckversuchen den anteroposterioren Durchmesser, indem Sie den Punkt ermitteln, an dem die Platte mit der Probe in Kontakt kommt.</li>
		<li>Führen Sie alle Tests bei Raumtemperatur durch.</li>
	</ol></li>
	<li>Zugversuche<ol><li>Führen Sie Zugversuche an einer Traktions-Desktop-Universalprüfmaschine (UTM) durch, die mit einer Last von 100 N (0,1 N Kraftauflösung, 0,001 mm Position und 0,1 s) ausgestattet ist. Die Prüfmaschine ist mit Kraft- und Positionssensoren ausgestattet und mit einer speziell vom Hersteller entwickelten Software an einen Computer angeschlossen23.</li>
		<li>Zeichnen Sie Daten alle 0,4 s auf und exportieren Sie sie in eine Tabelle.</li>
		<li>Aus reinen einlagigen, ungiftigen Kristall-Polyvinylchlorid (PVC)-Hohlrohren mit einem Außendurchmesser von 1 cm und einer Wandstärke von 1,5 mm werden an das mittlere Kaliber der Kaninchentracheen angepasste Zugbacken konstruiert.</li>
		<li>Schneiden Sie die Leitungen in 3 cm lange Segmente.</li>
		<li>Bohren Sie 12 vorgeformte Löcher für die Termino-Terminal-Naht, 2 mm von der Kante der Backen entfernt und mit einem Abstand von 2,5 mm, um eine Verzerrung durch die Nähte zu vermeiden.</li>
		<li>Befestigen Sie die PVC-Glasröhrchen durch terminoterminale Anastomose mit einer durchgehenden Naht durch abwechselnde vorgeformte Löcher (alle 5 mm), 2 mm vom Rand der Luftröhre entfernt und mit einer monofilen 6-0-Nylonnaht an der Kaninchenluftröhre.</li>
		<li>Dehnen Sie alle Teile mit einer Verdrängungsrate von 5,0 mm/min.</li>
		<li>Erfassen Sie die Variablen maximale Spannung (σ max, in N/mm2) und Dehnung (εmax, ohne Einheiten) zusammen mit der gespeicherten Energie pro Einheit des Luftröhrenvolumens (W/Vol, in mJ/mm) und dem Elastizitätsmodul (E, in MPa).</li>
	</ol></li>
	<li>Radiale Druckversuche<ol><li>Führen Sie radiale Drucktests auf einem Kompressions-Desktop-UTM durch, das mit einer 15-N-Wägezelle (Kraftauflösung 0,001 N, Position 0,001 mm und Zeit 0,1 s) ausgestattet ist, um Kraftdaten (N), Position (mm) und Zeit (s) zu erhalten. Zeichnen Sie Daten auf und exportieren Sie sie in Intervallen von 0,5 Sekunden in eine Tabelle.</li>
		<li>Platzieren Sie die Luftröhren so, dass der membranöse Bereich auf der unteren Platte aufliegt. Die Platte steigt mit einer konstanten Geschwindigkeit von 5 mm/min allmählich in Richtung der oberen Platte an.</li>
		<li>Berechnen Sie jede Einheit pro Einheit der Länge der Probe (f in N/mm), der Steifigkeit (R in Mpa·mm) und der Energie pro Oberflächeneinheit (W / S in mJ/mm2), die erforderlich ist, um die Luftröhre vollständig zu verschließen.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Operationstechnik
ANMERKUNG: Über die Operationstechnik wurde an anderer Stelle ausführlich berichtet20.
<ol><li>Setzen Sie einen sterilen intraluminalen PVC-Stent der Größe 14 Fr ein (der es ermöglicht, frei zu gleiten, ohne die Wände zu komprimieren), mit einem Rand von 3-4 mm an jedem Ende.</li>
	<li>Fixieren Sie den Stent mit einem einzigen 6-0 Nylon-Monofilamentstich durch den Knorpelfall des ersten Knorpels.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Betäubung der Kaninchen fort.<ol><li>Die Probanden (3,65-4,05 kg männliche weiße neuseeländische Kaninchen) werden mit intramuskulären Analgetika (35 mg/kg Ketamin) mit einem Beruhigungsmittel, einem Muskelrelaxans und einem Analgetikum (2,5 mg/kg Xylazin) vorbehandelt.</li>
		<li>Rasieren Sie die Schnittzone aus der Operationszone heraus und reinigen Sie den Operationsbereich, um die Haare zu entfernen.</li>
		<li>Verabreichung von Analgetika plus Antibiotikaprophylaxe: 0,05 mg/kg intramuskuläres Buprenorphin und 10 mg/kg Enrofloxacin.</li>
		<li>Legen Sie bei jedem Kaninchen einen Venenkatheter in die marginale Ohrvene.</li>
		<li>Induktion der Anästhesie mit einem intravenösen Bolus von 10 mg/kg Propofol.</li>
		<li>Überwachen Sie die Vitalfunktionen des Tieres mit einem Dreikanal-Elektrokardiogramm, Pulsoximetrie und nicht-invasiver Druckmessung. Tragen Sie alle 30 Minuten ein physiologisches Serum auf die Augen auf, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Anästhesieebene mit der Zehenklemmmethode.</li>
		<li>Halten Sie die Anästhesie mit inhalativem Isofluran bei 1,5 % bis 2 % der minimalen Alveolarkonzentration aufrecht, ohne die spontane Belüftung zu verlieren, und unterstützen Sie das Kaninchen mit einem Heizkissen thermisch.</li>
	</ol></li>
	<li>Desinfizieren Sie die Einschnittzone mehrmals in kreisenden Bewegungen mit einem jodhaltigen Peeling. Machen Sie unter aseptischen Bedingungen und mit sterilem Material einen 3 cm langen zentralen Thoraxschnitt und ernten Sie bilaterale gestielte Lappen, die aus Brustfaszie und einer Muskelkomponente bestehen.</li>
	<li>Wickeln Sie die Luftröhren mit dem Lappen in vier Kaninchen ein, eines auf jedem Hemithorax (also insgesamt acht Luftröhren).</li>
	<li>Wenn die Operation abgeschlossen ist, machen Sie die Anästhesie rückgängig, indem Sie die Verabreichung von Isofluran unterbrechen.</li>
	<li>Postoperative Phase<ol><li>Behalten Sie die Tiere im Operationssaal, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt haben. Wenn sie sich vollständig erholt haben, bringen Sie sie mit anderen Kaninchen in ihre Umgebung zurück.</li>
		<li>Behandeln Sie die Kaninchen 5 Tage lang alle 24 h mit Antibiotika (0,5 ml/kg 2,5 % Enrofloxacin) und Analgetika (5 mg/ml Meloxicam; 0,05 ml/kg Metacam).</li>
		<li>Lassen Sie die Implantate für die gewünschte Zeit an Ort und Stelle .</li>
		<li>Vor der Euthanasie werden die Kaninchen mit intramuskulären Analgetika (35 mg/kg Ketamin) und einem Beruhigungsmittel, Muskelrelaxans und Analgetikum (2,5 mg/kg Xylazin) behandelt. Dann werden die Kaninchen mit 133 mg/kg Pentobarbitalnatrium mit einer 200 mg/ml-Injektion durch die marginale Ohrvene eingeschläfert und die Luftröhren entnommen.</li>
		<li>Führen Sie biomechanische und histologische Tests an den Luftröhren durch.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Statistische Analyse
<ol><li>Passen Sie alle Modelle mit der Bayes'schen Methode in der R-Software, Version 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019) an.</li>
	<li>Analysieren Sie die Studienvariablen mit Ausnahme von f und R mithilfe mehrerer linearer Regressionsmodelle.</li>
	<li>Wenden Sie für die f - und R-Variablen gemischte lineare Regressionsmodelle an. In diesen Modellen wird zusätzlich zu den interessierenden Variablen, die sich auf die Behandlung und den Zustand jeder Luftröhre beziehen, der Prozentsatz der Okklusion als monotoner Effekt und ein unabhängiger Term pro Luftröhre als Zufallsfaktor eingeführt.</li>
</ol>

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</ol>

Keiner der Autoren hat einen Interessenkonflikt.

Es gibt verschiedene Sterilisationsstrategien. Überkritisches CO2dringt vollständig in das Gewebe ein, säuert das Medium an und dekonstruiert die zelluläre Phospholipiddoppelschicht mit einfacher Eliminierung durch Druckentlastung des Implantats 8,14,25. Ultraviolette Strahlung wurde ebenfalls verwendet, und ihre Wirksamkeit in der Luftröhre von Nagetieren wurde veröffentlicht, obwohl es nur wenige Berichte in der Lit...

Die Sterilisation eines Implantats ist eine Grundvoraussetzung für seine Lebensfähigkeit. Tatsächlich haben sich Prothesen bewährt, die in sterilen Bereichen (Blutgefäße, Herz, Knochen usw.) implantiert wurden. 1. Die Luftröhre hat zwei Oberflächen: eine Oberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung, die daher nicht steril ist, und eine Oberfläche zum Mediastinum hin, die steril ist. Daher ist die Luftröhre ab dem Moment, in dem sie entnommen wird, kein steriles Organ. Obwohl der anschließende Dezellularisierungsprozess unter maximal sterilen Bedingungen durchgeführt wird, handelt es sich nicht um einen Sterilisationsschritt2. Die Implantation von Fremdmaterial an sich birgt aufgrund der probakteriellen Mikroumgebung, diees erzeugt,ein Infektionsrisiko 3 und ein Risiko von bis zu 0,014 % der Krankheitsübertragung vom Spender auf den Empfänger, selbst wenn das Material sterilisiert wurde4. Um eine korrekte Vaskularisierung der Luftröhre zu gewährleisten, wird sie in fast allen experimentellen Transplantationsprotokollen zunächst einer heterotopen Implantation 5,6,7 in einen sterilen Bereich (Muskel, Faszien, Omentum, subkutan usw.) unterzogen. Dies liegt daran, dass die Implantation eines nicht sterilen Elements in dieses Medium zu einer Infektion des Bereichs3 führen würde.
Es gibt eine Reihe möglicher Strategien, um ein steriles Implantat zu erhalten. Durch die Verwendung von überkritischemCO2wurde eine terminale Sterilisation 8,9 erreicht. Andere Methoden, wie z. B. ultraviolette Strahlung oder die Behandlung mit Substanzen wie Peressigsäure, Ethanol, Sauerstoffperoxid und elektrolysiertem Wasser, haben unterschiedliche Erfolgsraten bei der Sterilisation erzielt, die fast immer von ihrer Dosierung abhängen, aber es hat sich gezeigt, dass sie die biomechanischen Eigenschaften von Implantaten beeinflussen. In der Tat können einige Substanzen, wie z. B. Ethylenoxid, die Struktur der implantierten Matrix erheblich verändern und sogar unerwünschte immunogene Wirkungen hervorrufen. Aus diesem Grund können viele dieser Strategien nicht auf biologische Modelle 2,10,11,12,13 angewendet werden.
Die am weitesten untersuchte und akzeptierte Sterilisationsstrategie ist die in der Norm ISO 11737-1:2006 festgelegte Sterilisationsstrategie für die Sterilisation von Medizinprodukten, die in Menschen implantiert wurden, mit einer Gammastrahlendosis von 25 kGy. Diese Vorschrift konzentriert sich jedoch nur auf die Sterilisation von inerten, nicht-biologischen Elementen14,15. Darüber hinaus sind die Strahlentherapiedosen bei der radikalen Behandlung von Karzinomen um drei Größenordnungen niedriger als bei der Sterilisation von Medizinprodukten1. Vor diesem Hintergrund können wir schlussfolgern, dass diese Dosis nicht nur die Mikrobiota abtöten, sondern auch die biologische Struktur des Implantats zerstören und radikal verändern würde. Es besteht auch die Möglichkeit, dass es beim Abbau Restlipide erzeugt, die potenziell zytotoxisch sein und den enzymatischen Abbau des Gerüstsbeschleunigen können 13,14,15,16,17, selbst wenn Dosen von nur 1,9 kGy verwendet werden und die Schädigung direkt proportional zur erhaltenen Strahlendosis ist 17.
Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, zu versuchen, die Strahlendosis zu identifizieren, die es ermöglicht, ein steriles Implantat mit minimalen schädlichen Auswirkungen durch Bestrahlung zu erhalten 2,18,19. Die Strategie, die wir verfolgten, beinhaltete die Bestrahlung von dezellularisierten und bestrahlten Luftröhren mit unterschiedlich eskalierten Dosen innerhalb eines Bereichs von Kilogray (0,5, 1, 2, 3 kGy usw.), bis eine negative Kultur erreicht wurde. Für die Dosen, die negative Kulturen erreichten, wurden zusätzliche Tests durchgeführt, um die Sterilisation zu bestätigen. Nach der Bestimmung der Mindestdosis für die Sterilisation wurden die strukturellen und biomechanischen Auswirkungen der Bestrahlung auf die Luftröhre überprüft. Alle Metriken wurden mit den kontrollierten einheimischen Kaninchentracheen verglichen. Die Sterilisation des Konstrukts wurde dann in vivo getestet, indem die Luftröhren in neuseeländische weiße Kaninchen implantiert wurden.

<table><tbody><tr><td>6-0 Nylon monofile Naht&nbsp;</td><td>Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA</td><td>SN-5698G</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Wissenschaftlich; Waltham, MA USA</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Buprex. Reckitt Benckiser Gesundheitswesen; Hull, Reino Unido</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>Kompression Desktop UTM</td><td>Microtest, Madrid, Spanien</td><td>EM1/10/FR</td><td></td></tr><tr><td>Kryostate</td><td>Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Deutschland</td><td>CM3059</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Wissenschaftlich; Waltham, MA, USA</td><td>11965084 DNA-Extraktionskit</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DNeasy Extraktionskit Quiagen, Hilden, Deutschland</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin, 2,5%</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Deutschland</td><td>0035-0002</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spanien</td><td>SH20898.03IR</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Deutschland)</td><td>DM2500??</td><td></td></tr><tr><td>Behälter einfrieren&nbsp;</td><td>Herr Frosty. Thermo-Fischer; Madrid, Spanien</td><td>&nbsp; 5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spanien&nbsp;</td><td>8.43603E+12</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Imalgen. Merial; Toulouse, Frankreich</td><td>BOE127823</td><td></td></tr><tr><td>Linearbeschleuniger&nbsp;</td><td>"Wahrer Strahl". Varian, Palo Alto, Kalifornien, USA</td><td>H191001</td><td></td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>Orbitalschüttler PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia</td><td>BS-010144-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam 5 mg/ml</td><td>Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Deutschland</td><td>6283-MV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 5%</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital-Natrium-Dolethal</td><td>. Vetoquinol; Madrid, Españntilde; eine</td><td>3,60587E+12</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>P2272</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania</td><td>G 151030</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA</td><td>S3020</td><td></td></tr><tr><td>PVC-Hohlrohre</td><td>Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italien</td><td>hhdddyyZ</td><td></td></tr><tr><td>PVC-Stent</td><td>ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Türkei</td><td>019 5305 1</td><td></td></tr><tr><td>R Software, Version 3.5.3 R Core</td><td>R Foundation for Statistical Computing</td><td>R 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich; MO, USA</td><td>8,17,034</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Nanodrop, Life Technologies; Isogen Lebenswissenschaften. Utrech, Niederlande</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet</td><td>Microsoft Excel für Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA</td><td>2864993241</td><td></td></tr><tr><td>Traction Universal Testing Machine&nbsp;</td><td>Prüfmaschinen, Veenendaal, Niederlande</td><td>84-01</td><td></td></tr><tr><td>UTM Software</td><td>TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA&nbsp;</td><td>100-093-627 F</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Eindeckmedium&nbsp;</td><td>Vector Labs, Burlingame; CA; USA</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Xylacin</td><td>Xilagesic. Calier; Barcelona, Spanien&ntilde; A</td><td>20102-003</td><td></td></tr></tbody></table>

niedrigdosis-gammastrahlen-sterilisation für dezellularisierte trachealtransplantate

Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts

Einer der wichtigsten Schlüsselaspekte, um sicherzustellen, dass sich ein Transplantat korrekt entwickelt, ist die Sterilität des Mediums. Bei der dezellularisierten Trachealtransplantation wird ein Organ implantiert, das ursprünglich mit der Umwelt in Kontakt stand und somit nicht von vornherein steril war. Während das Dezellularisierungsprotokoll (durch Detergenzienexposition [2% Natriumdodecylsulfat], kontinuierliches Rühren und osmotische Schocks) im Einklang mit aseptischen Maßnahmen durchgeführt wird, sieht es keine Sterilisation vor. Eine der größten Herausforderungen besteht daher darin, die Sterilität vor der In-vivo-Implantation sicherzustellen. Obwohl es etablierte Gammastrahlungs-Sterilisationsprotokolle für anorganische Materialien gibt, gibt es keine solchen Maßnahmen für organische Materialien. Darüber hinaus können die für anorganische Materialien geltenden Protokolle nicht auf organische Materialien angewendet werden, da die festgelegte Strahlendosis (25 kGy) das Implantat vollständig zerstören würde. In dieser Arbeit wird die Wirkung einer erhöhten Strahlendosis in einer dezellularisierten Kaninchenluftröhre untersucht. Wir behielten den Dosisbereich (kGy) bei und testeten eskalierte Dosen, bis wir die minimale Dosis gefunden hatten, bei der die Sterilisation erreicht wird. Nachdem wir die Dosis bestimmt hatten, untersuchten wir die Auswirkungen auf das Organ, sowohl histologisch als auch biomechanisch. Wir stellten fest, dass 0,5 kGy zwar keine Sterilität erreichten, Dosen von 1 kGy und 2 kGy jedoch schon, wobei 1 kGy daher die minimale Dosis war, die für die Sterilisation erforderlich war. Mikroskopische Untersuchungen zeigten keine relevanten Veränderungen im Vergleich zu nicht sterilisierten Organen. Die axialen biomechanischen Eigenschaften wurden überhaupt nicht verändert, und es wurde nur eine geringe Verringerung der Kraft pro Längeneinheit beobachtet, die das Organ radial tolerieren kann. Wir können daher schlussfolgern, dass 1 kGy eine vollständige Sterilisation der dezellularisierten Kaninchenluftröhre mit minimalen, wenn überhaupt, Auswirkungen auf das Organ erreicht.

Dezellularisierung Die DAPI-Färbung zeigt das Fehlen von DNA, und durch Elektrophorese wurden in keiner der Tracheen DNA-Werte über 50 ng nachgewiesen, wobei alle Fragmente kleiner als 200 bp20 waren.
Mikrobielle Kultur Zwei der acht Stücke, die 0,5 kGy ausgesetzt wurden, zeigten eine Farbveränderung in weniger als 1 Woche. Keines der mit 1 kGy und 2 kGy bestrahlten Stücke zeigte eine Farbveränderung (Abbildun...

Die Sterilisation ist für die Transplantation von Trachealgewebe unerlässlich. Hier stellen wir ein Sterilisationsprotokoll mit niedrig dosierter Gammastrahlung vor, das von den Organen voll verträglich ist.

Niedrigdosis-Gammastrahlen-Sterilisation für dezellularisierte Trachealtransplantate

One of the main key aspects in ensuring that a transplant evolves correctly is the sterility of the medium. Decellularized tracheal transplantation ...

Dieses Protokoll bietet einen vollständigen Sterilisationsprozess für jedes nicht sterile Organ, ohne seine Eigenschaften zu beeinträchtigen. Das Hauptziel dieser Technik ist die Möglichkeit, ein Organ zu sterilisieren, ohne seine Eigenschaften zu beeinträchtigen. Obwohl sich diese Technik auf Luftröhren konzentriert hat, hat sie gezeigt, dass niedrigere Gammastrahlendosen biologisches Material effektiv sterilisieren können.Ein Individuum kann sich dem Problem stellen, indem es die niedrigste effektive Dosis für die verschiedenen Arten von Organen definiert. Dann wird empfohlen, mit einer niedrigeren Dosierung zu beginnen und diese zu erhöhen, bis die Sterilisation erreicht ist. Beginnen Sie damit, die Luftröhre von eingeschläferten neuseeländischen weißen Kaninchen oder Oryctolagus cuniculus in zwei Zentimeter lange Stücke zu schneiden.Entfernen Sie mit einer Schere das umliegende Bindegewebe und die innere Schleimhautschicht. Tauchen Sie die Proben in 12 Milliliter PBS-Lösung, die SDS, 5 % Penicillin-Streptomycin und 5 % Amphotericin enthält. Setzen Sie die Luftröhren fünf Wochen lang bei Raumtemperatur einem ständigen Rühren mit einem Magnetrührer bei 400 U/min aus.Geben Sie wöchentlich zwei Stunden osmotischen Schock, indem Sie die Luftröhren in destilliertes Wasser tauchen, bevor Sie das Medium wechseln. Nach fünf Wochen werden die Luftröhrenproben mit einer 12-Milliliter-Mischung aus 80 % FBS und 20 % DMSO in einem Gefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius kryogenisiert. Nach 13 bis 15 Tagen werden die Luftröhren in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufgetaut.Waschen Sie sie dann mit PBS. Um die Probe zu bestrahlen, legen Sie vier Trachealstücke in 20 Milliliter PBS in Methacrylat-T25-Kulturkolben und verhindern Sie dabei die Blasenbildung. Führen Sie die Bestrahlung mit einem Linearbeschleuniger mit Photonen mit einer Nennenergie von 10 Megavolt durch, um filterfreie Strahlen abzuflachen.Wenden Sie eine Dosisleistung von 2.400 Monitoreinheiten pro Minute an und stellen Sie andere Parameter wie im Manuskript beschrieben ein. Wenn Sie fertig sind, kultivieren Sie die Probe in 30 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10% inaktiviertem FBS ohne Antibiotika oder Antimykotika. Inkubieren Sie die Kultur zwei Wochen lang in einem Standard-Gewebeinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und überprüfen Sie sie alle 24 Stunden auf Kontaminationsparameter wie pH-Wert, Farbe und Trübungsänderungen.Führen Sie Zugversuche auf einer Traktions-Desktop-Universalprüfmaschine oder UTM-Wegsteuerung durch, die mit Kraft- und Positionssensoren und einem Computer mit speziell entwickelter Software ausgestattet ist. Zeichnen Sie Daten alle 0,4 Sekunden auf und exportieren Sie sie in eine Tabelle. Konstruieren Sie Zugbacken, die an das mittlere Kaliber der Kaninchenluftröhren angepasst sind, aus reinem, einschichtigem, ungiftigem Kristallpolyvinylchlorid oder PVC-Hohlrohren.Schneiden Sie die Leitungen in drei Zentimeter lange Segmente. Um die termino-terminale Naht ohne Vorspannung durchzuführen, bohren Sie 12 vorgeformte Löcher zwei Millimeter von der Kante der Backen entfernt, im Abstand von 2,5 Millimetern. Als nächstes werden die PVC-Glasröhrchen durch terminoterminale Anastomose mit einer durchgehenden monofilen 6-0-Nylonnaht durch abwechselnd durchgeführte Fünf-Millimeter-Löcher zwei Millimeter vom Rand der Luftröhre entfernt an der Kaninchenluftröhre befestigt.Dehnen Sie alle Teile mit einer Verdrängungsrate von 5,0 Millimetern pro Minute. Notieren Sie dann die Variablen, wie z. B. die maximale Spannung und Dehnung, die pro Einheit des Luftröhrenvolumens gespeicherte Energie und den Elastizitätsmodul. Führen Sie radiale Drucktests auf einem Komprimierungs-Desktop-UTM durch, das mit einer 15-Newton-Wägezelle ausgestattet ist, um Kraftdaten, Position und Zeit zu erhalten.Zeichnen Sie Daten auf und exportieren Sie sie in Intervallen von 0,5 Sekunden in Tabellenkalkulationen. Platzieren Sie die Luftröhren so, dass der membranöse Bereich auf der unteren Platte aufliegt, bevor die Platte mit einer konstanten Geschwindigkeit von fünf Millimetern pro Minute allmählich zur oberen Platte ansteigt. Berechnen Sie jede Variable pro Längeneinheit der Probe, der Steifigkeit und der Energie pro Einheit der Oberfläche, die erforderlich ist, um die Luftröhre vollständig zu verschließen.Platzieren Sie einen sterilen intraluminalen PVC-Stent der Größe 14 und achten Sie dabei auf einen Rand von drei bis vier Millimetern an jedem Ende. Fixieren Sie den Stent mit einem einzigen 6-0 Nylon-Monofilamentstich durch den Knorpelfall des ersten Knorpels. Machen Sie unter aseptischen Bedingungen und mit sterilem Material einen drei Zentimeter langen zentralen Thoraxschnitt und ernten Sie bilaterale gestielte Lappen, die aus Brustfaszie und einer Muskelkomponente bestehen.Wickeln Sie die Luftröhren mit dem Lappen in vier Kaninchen, eine Luftröhre auf jedem Hämathorax. Sobald die Operation abgeschlossen ist, können Sie die Anästhesie rückgängig machen, indem Sie die Verabreichung von Isofluran unterbrechen. Von den acht Stücken, die einer Strahlung von 0,5 Kilogray ausgesetzt waren, zeigten zwei Stücke innerhalb einer Woche eine Veränderung der Medienfarbe.Keines der Stücke, die mit einem oder zwei Kilogray bestrahlt wurden, zeigte jedoch eine Veränderung der Medienfarbe. Im Vergleich zur Kontrolle wurden bei den analysierten Proben, die mit unterschiedlichen Strahlendosen bestrahlt wurden, keine Veränderungen des Kollagen- oder elastischen Faserverteilungsmusters festgestellt. Die im Zugversuch an bestrahlten Luftröhren gewonnenen Daten sind hier dargestellt.Die Spannungsdehnungskurven für dezellularisierte und bestrahlte Tracheen zeigten keine Veränderungen im Vergleich zu nicht sterilisierten Tracheen. Die Kompressionstests, die an den nativen Luftröhren oder Kontrollen und den dezellularisierten, kryokonservierten und bestrahlten Luftröhren durchgeführt wurden, werden gezeigt. Die entsprechenden Grafiken zeigten, dass die Bestrahlung den Prozentsatz der Okklusion im Vergleich zur nativen Luftröhre nicht veränderte.Die Gammabestrahlung verursachte eine klinisch minimale, aber statistisch signifikante Abnahme der radiobiomechanischen Eigenschaften und der variablen Kraft pro Längeneinheit. Die histologische Untersuchung zeigte das hochorganisierte Bindegewebe in Form des Perichondriums der nativen Luftröhre. Der Knorpel war intakt und zeigte keine Anzeichen von Nekrose.Bei der Implantation eines radiologischen Elements in ein Lebewesen sind die Sterilität des Implantats und der sterile Prozess von größter Bedeutung, um Infektionen und Gewebeabstoßung zu vermeiden. Es gibt eine breite Palette von Organen, die nach der Gewebebildung implantiert werden müssen, und sie sollten steril sein. Nach diesem Verfahren kann eine vollständige Sterilisation erreicht werden, ohne die Hauptmerkmale des Organs zu beeinträchtigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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