Niedrigdosis-Gammastrahlen-Sterilisation für dezellularisierte Trachealtransplantate

Dieses Protokoll bietet einen vollständigen Sterilisationsprozess für jedes nicht sterile Organ, ohne seine Eigenschaften zu beeinträchtigen. Das Hauptziel dieser Technik ist die Möglichkeit, ein Organ zu sterilisieren, ohne seine Eigenschaften zu beeinträchtigen. Obwohl sich diese Technik auf Luftröhren konzentriert hat, hat sie gezeigt, dass niedrigere Gammastrahlendosen biologisches Material effektiv sterilisieren können.

Ein Individuum kann sich dem Problem stellen, indem es die niedrigste effektive Dosis für die verschiedenen Arten von Organen definiert. Dann wird empfohlen, mit einer niedrigeren Dosierung zu beginnen und diese zu erhöhen, bis die Sterilisation erreicht ist. Beginnen Sie damit, die Luftröhre von eingeschläferten neuseeländischen weißen Kaninchen oder Oryctolagus cuniculus in zwei Zentimeter lange Stücke zu schneiden.

Entfernen Sie mit einer Schere das umliegende Bindegewebe und die innere Schleimhautschicht. Tauchen Sie die Proben in 12 Milliliter PBS-Lösung, die SDS, 5 % Penicillin-Streptomycin und 5 % Amphotericin enthält. Setzen Sie die Luftröhren fünf Wochen lang bei Raumtemperatur einem ständigen Rühren mit einem Magnetrührer bei 400 U/min aus.

Geben Sie wöchentlich zwei Stunden osmotischen Schock, indem Sie die Luftröhren in destilliertes Wasser tauchen, bevor Sie das Medium wechseln. Nach fünf Wochen werden die Luftröhrenproben mit einer 12-Milliliter-Mischung aus 80 % FBS und 20 % DMSO in einem Gefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius kryogenisiert. Nach 13 bis 15 Tagen werden die Luftröhren in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius aufgetaut.

Waschen Sie sie dann mit PBS. Um die Probe zu bestrahlen, legen Sie vier Trachealstücke in 20 Milliliter PBS in Methacrylat-T25-Kulturkolben und verhindern Sie dabei die Blasenbildung. Führen Sie die Bestrahlung mit einem Linearbeschleuniger mit Photonen mit einer Nennenergie von 10 Megavolt durch, um filterfreie Strahlen abzuflachen.

Wenden Sie eine Dosisleistung von 2.400 Monitoreinheiten pro Minute an und stellen Sie andere Parameter wie im Manuskript beschrieben ein. Wenn Sie fertig sind, kultivieren Sie die Probe in 30 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10% inaktiviertem FBS ohne Antibiotika oder Antimykotika. Inkubieren Sie die Kultur zwei Wochen lang in einem Standard-Gewebeinkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid und überprüfen Sie sie alle 24 Stunden auf Kontaminationsparameter wie pH-Wert, Farbe und Trübungsänderungen.

Führen Sie Zugversuche auf einer Traktions-Desktop-Universalprüfmaschine oder UTM-Wegsteuerung durch, die mit Kraft- und Positionssensoren und einem Computer mit speziell entwickelter Software ausgestattet ist. Zeichnen Sie Daten alle 0,4 Sekunden auf und exportieren Sie sie in eine Tabelle. Konstruieren Sie Zugbacken, die an das mittlere Kaliber der Kaninchenluftröhren angepasst sind, aus reinem, einschichtigem, ungiftigem Kristallpolyvinylchlorid oder PVC-Hohlrohren.

Schneiden Sie die Leitungen in drei Zentimeter lange Segmente. Um die termino-terminale Naht ohne Vorspannung durchzuführen, bohren Sie 12 vorgeformte Löcher zwei Millimeter von der Kante der Backen entfernt, im Abstand von 2,5 Millimetern. Als nächstes werden die PVC-Glasröhrchen durch terminoterminale Anastomose mit einer durchgehenden monofilen 6-0-Nylonnaht durch abwechselnd durchgeführte Fünf-Millimeter-Löcher zwei Millimeter vom Rand der Luftröhre entfernt an der Kaninchenluftröhre befestigt.

Dehnen Sie alle Teile mit einer Verdrängungsrate von 5,0 Millimetern pro Minute. Notieren Sie dann die Variablen, wie z. B. die maximale Spannung und Dehnung, die pro Einheit des Luftröhrenvolumens gespeicherte Energie und den Elastizitätsmodul. Führen Sie radiale Drucktests auf einem Komprimierungs-Desktop-UTM durch, das mit einer 15-Newton-Wägezelle ausgestattet ist, um Kraftdaten, Position und Zeit zu erhalten.

Zeichnen Sie Daten auf und exportieren Sie sie in Intervallen von 0,5 Sekunden in Tabellenkalkulationen. Platzieren Sie die Luftröhren so, dass der membranöse Bereich auf der unteren Platte aufliegt, bevor die Platte mit einer konstanten Geschwindigkeit von fünf Millimetern pro Minute allmählich zur oberen Platte ansteigt. Berechnen Sie jede Variable pro Längeneinheit der Probe, der Steifigkeit und der Energie pro Einheit der Oberfläche, die erforderlich ist, um die Luftröhre vollständig zu verschließen.

Platzieren Sie einen sterilen intraluminalen PVC-Stent der Größe 14 und achten Sie dabei auf einen Rand von drei bis vier Millimetern an jedem Ende. Fixieren Sie den Stent mit einem einzigen 6-0 Nylon-Monofilamentstich durch den Knorpelfall des ersten Knorpels. Machen Sie unter aseptischen Bedingungen und mit sterilem Material einen drei Zentimeter langen zentralen Thoraxschnitt und ernten Sie bilaterale gestielte Lappen, die aus Brustfaszie und einer Muskelkomponente bestehen.

Wickeln Sie die Luftröhren mit dem Lappen in vier Kaninchen, eine Luftröhre auf jedem Hämathorax. Sobald die Operation abgeschlossen ist, können Sie die Anästhesie rückgängig machen, indem Sie die Verabreichung von Isofluran unterbrechen. Von den acht Stücken, die einer Strahlung von 0,5 Kilogray ausgesetzt waren, zeigten zwei Stücke innerhalb einer Woche eine Veränderung der Medienfarbe.

Keines der Stücke, die mit einem oder zwei Kilogray bestrahlt wurden, zeigte jedoch eine Veränderung der Medienfarbe. Im Vergleich zur Kontrolle wurden bei den analysierten Proben, die mit unterschiedlichen Strahlendosen bestrahlt wurden, keine Veränderungen des Kollagen- oder elastischen Faserverteilungsmusters festgestellt. Die im Zugversuch an bestrahlten Luftröhren gewonnenen Daten sind hier dargestellt.

Die Spannungsdehnungskurven für dezellularisierte und bestrahlte Tracheen zeigten keine Veränderungen im Vergleich zu nicht sterilisierten Tracheen. Die Kompressionstests, die an den nativen Luftröhren oder Kontrollen und den dezellularisierten, kryokonservierten und bestrahlten Luftröhren durchgeführt wurden, werden gezeigt. Die entsprechenden Grafiken zeigten, dass die Bestrahlung den Prozentsatz der Okklusion im Vergleich zur nativen Luftröhre nicht veränderte.

Die Gammabestrahlung verursachte eine klinisch minimale, aber statistisch signifikante Abnahme der radiobiomechanischen Eigenschaften und der variablen Kraft pro Längeneinheit. Die histologische Untersuchung zeigte das hochorganisierte Bindegewebe in Form des Perichondriums der nativen Luftröhre. Der Knorpel war intakt und zeigte keine Anzeichen von Nekrose.

Bei der Implantation eines radiologischen Elements in ein Lebewesen sind die Sterilität des Implantats und der sterile Prozess von größter Bedeutung, um Infektionen und Gewebeabstoßung zu vermeiden. Es gibt eine breite Palette von Organen, die nach der Gewebebildung implantiert werden müssen, und sie sollten steril sein. Nach diesem Verfahren kann eine vollständige Sterilisation erreicht werden, ohne die Hauptmerkmale des Organs zu beeinträchtigen.