Eine flexible Kammer für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Die flexible Klimakammertechnik ermöglicht Zeitraffer als SRS-Bildgebung mit Sendesigntektion auf einem Operationsmikroskop-Gestell. Die SRS-Mikroskopie verwendete ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur und einen High-End-Kondensor, so dass nur wenige Millimeter Lücke blieben, in die eine herkömmliche Kammer nicht passt. Eine flexible Kammer löst dieses Problem.

Forscher, die die SRS-Mikroskopie verwenden, können diese Technik leicht übernehmen. Die flexible Kammer kann auch auf einem Präparier- oder Sterilmikroskop verwendet werden, um die Probe unter optimalen physiologischen Bedingungen zu halten. Markieren Sie zunächst die Positionen der Füße des SRS-Mikroskoprahmens und des motorisierten Tisches mit einem Markierungsstift auf dem optischen Tisch.

Nachdem Sie das Mikroskopgestell und den Tisch vom optischen Tisch entfernt haben, legen Sie die Silikonkautschukfolie auf den Tisch. Schneiden Sie den Silikonkautschuk mit einem Messer entlang der Markierungen ab. Entfernen Sie kleine Gummistücke und legen Sie die quadratischen Glimmerkeramikplatten an die gleichen Stellen.

Bewegen Sie dann das Mikroskopgestell und den Tisch zurück zum optischen Tisch und richten Sie die Füße vorsichtig entlang der Markierungslinien auf den Glimmerkeramikplatten aus. Nachdem Sie den optischen Pfad des SRS neu ausgerichtet haben, montieren Sie das Umgebungsgehäuse auf dem Fundament der Wärmedämmung, um den gesamten Mikroskoprahmen abzudecken, und verwenden Sie fünf große Polycarbonatplatten. Versiegeln Sie die Kanten und Schnittstellen der Box mit Alufolienklebeband.

Schließen Sie den flexiblen Kanalschlauch an die Einlass- und Auslassöffnungen des Gehäusekastens an, um einen zirkulierten, warmen Luftstrom zu ermöglichen, der vom Heizmodul gepumpt und gesteuert wird. Montieren Sie das bearbeitete hohlzylindrische Aluminiumstück 1 mit drei Stellschrauben am Nasenstück des Objektivs. Als nächstes montieren Sie das bearbeitete hohlzylindrische Aluminiumstück 2 mit vier Schrauben am Probenhalter.

Montieren Sie den Probenhalter mit Aluminiumstück 2 auf dem Motortisch und befestigen Sie ihn mit Schrauben. Legen Sie die Naturkautschuk-Folienhülse zwischen die beiden bearbeiteten Aluminiumteile und montieren Sie sie mit Gummibändern an jedem Ende. Verbinden Sie die komprimierte CO2-Flasche mit den richtigen Schläuchen und Anschlüssen mit dem Gasmischermodul.

Stellen Sie den CO2-Eingangsdruck auf 20 bis 25 psi ein. Verwenden Sie den eingebauten CO2-Sensor und einen Regler, um sicherzustellen, dass das Luftmischermodul 5 % CO2 regulieren und in den Luftstrom mischen kann. Verwenden Sie Inline-Filter, um den Luftstrom zu reinigen.

Leiten Sie die Mischluft mit geeigneten Schläuchen und Anschlüssen zu der vorsterilisierten Wasserflasche, die auf der Kochplatte platziert ist, und leiten Sie dann die befeuchtete Luft in die flexible Kammer. Stellen Sie die Kochstelle auf 37 Grad Celsius. Blasen Sie den Luftstrom im warmen Wasser, um die Luftfeuchtigkeit des Luftstroms zu erhöhen.

Trennen Sie das Aluminiumteil 2 der Maschine vom Probenhalter, indem Sie die Schrauben entfernen. Wischen Sie alle Teile der flexiblen Kammer mit 70%igem Ethanol ab, einschließlich des Nasenstücks, des Probenhalters und des Wassertauchobjektivs. Dekontaminieren Sie das gesamte Gehäusesystem mit einer UV-Lampe, die 20 bis 30 Minuten lang im Gehäuse platziert wird.

Füllen Sie dann die Zellkulturschale. Entfernen Sie den Deckel der Schüssel und fixieren Sie sie mit den Klemmen. Senken Sie das Objektiv in das Zellkulturmedium, um eine grobe Fokussierung zu erzielen.

Senken Sie das Aluminiumstück 2 ab, um die flexible Kammer zu umschließen, und befestigen Sie es mit Schrauben am Probenhalter. Setzen Sie dann den Sensor ein. Stellen Sie die Luftzufuhr mit 5 % CO2 und 19 % O2 für normale Zellkulturen mit einem Luftdurchsatz von 200 Kubikzentimetern pro Minute und einer Temperatur von 37 Grad Celsius ein.

Stellen Sie die Laserwellenlänge auf 805 Nanometer ein, um die inverse Raman-Verschiebung von 2.854 Zentimetern zu erreichen, die auf die Vibration chemischer CH2-Bindungen zurückzuführen ist. Verwenden Sie eine niedrige Laserleistung, um Lichtschäden an den Zellen zu reduzieren. Passen Sie das Objektiv an und fokussieren Sie es, um eine gute SRS-Abbildung der Zellen zu erzielen, indem Sie die Fokustaste auf dem Hauptbedienfeld der Software verwenden.

Um eine schnelle Fokussierung durchzuführen, stellen Sie die Pixelzahl auf 512 x 512 Pixel mit einer Pixelverweildauer von 4,8 Mikrosekunden im Konfigurationsfeld ein. Nachdem Sie eine gute Fokussierung erreicht haben, stellen Sie die Bildauflösung auf 2048 x 2048 Pixel für ein Sichtfeld von 175 Mikrometern im Quadrat ein, um qualitativ hochwertige Bilder aufzunehmen. Überprüfen Sie die Speicherfunktion auf dem Hauptbedienfeld und überprüfen Sie den SRS-Kanal auf dem Kanalbedienfeld.

Stellen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf 180 Sekunden auf dem Hauptsteuerungskanal ein. Stellen Sie die Erfassungszahl auf 480 ein, um Zeitrafferaufnahmen über einen Zeitraum von 24 Stunden zu erhalten. Starten Sie die automatische Bildaufnahme mit der Loop-Funktion auf dem Hauptbedienfeld.

Die Leistungsfähigkeit des flexiblen Kammersystems für Zeitraffer-SRS-Aufnahmen wurde evaluiert. Die Temperatur im Inneren des Mikroskopgehäuses erreichte die erwarteten 37 Grad Celsius und hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Raumtemperatur. Die Temperatur in der flexiblen Kammer erreichte in 1,5 Stunden 37 Grad Celsius und wurde mindestens 24 Stunden lang stabil gehalten.

Die relative Luftfeuchtigkeit in der flexiblen Kammer erreichte in einer Stunde 85% und konnte mindestens 24 Stunden lang aufrechterhalten werden. Die Zeitraffer-SRS-Bildgebung von lebenden SKOV3-Zellen zeigte die schnelle und aktive Bewegung intrazellulärer Lipidtröpfchen mit einer zeitlichen Auflösung von drei Minuten. Am Ende der 24-stündigen Bildgebungssitzung zeigten die Zellen immer noch eine normale Morphologie und Dichte, was darauf hindeutet, dass die Zellen gesund waren.

Als nächstes wurden SKOV3-Zellen, die mit Ölsäure behandelt wurden, abgebildet und die Lipidtröpfchenakkumulation über 10 Stunden verfolgt. Die Lipidtröpfchenmengen wurden anhand des Lipidtröpfchen-Zellkörper-Verhältnisses und der gesamten SRS-Intensität der Lipidtröpfchen quantifiziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Menge der Lipidtröpfchen über 10 Stunden immer weiter zunahm.

Die simultane Vorwärts-SRS-Bildgebung von Lipidtröpfchen und die Rückwärts-Zwei-Photonen-Fluoreszenzbildgebung von Lysosomen, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff DND-189 markiert waren, wurden ebenfalls demonstriert. Es wurde ein sehr geringer Grad an Kolokalisation von Lipidtröpfchen und Lysosomen beobachtet. Wenn Sie dieses Protokoll ausprobieren, denken Sie daran, dass fokale Drift ein häufiges Problem bei der Bildgebung lebender Zellen ist.

Eine Neufokussierung kann nach etwa zwei Stunden Zeitrafferaufnahme erforderlich sein. Nach seiner Entwicklung wurde die Zeitraffer-SRS-Bildgebung für verschiedene Studien verwendet, um markierungsfreie Moleküle oder markierte Moleküle mit Raman-Text in lebenden Zellen zu verfolgen.