Name: Entwicklung und Evaluierung eines Rattenmodells von Knorpeldefekten in voller Dicke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung eines Rattenmodells für Knorpeldefekte in voller Dicke mit Bohrtechnik und histopathologischer Analyse. Diese Methode ermöglicht die Evaluierung therapeutischer Behandlungen und die Untersuchung von Schmerzmechanismen.

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Diese Studie wurde von der Zhejiang Natural Science Foundation (Fördernummer LQ20H270009), der Natural Science Foundation of China (Fördernummern 82074464 und 82104890), der Zhejiang Traditional Chinese Medical Science Foundation (Fördernummern 2020ZA039, 2020ZA096 und 2022ZB137) und dem Medical Health Science and Technology Project der Gesundheitskommission der Provinz Zhejiang (Fördernummer 2016KYA196) unterstützt.

Die Tierversuche wurden von der Kommission für medizinische Standards und Ethik der Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine genehmigt, die der chinesischen Gesetzgebung zur Verwendung und Pflege von Labortieren entspricht. In der vorliegenden Studie wurden 6 Wochen alte männliche Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 150-180 g verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle).
1. Etablierung eines Knorpeldefektmodells in voller Dicke bei Ratten
<ol><li>Nach 1 Woche der Eingewöhnung an die neue Umgebung werden die Ratten zufällig und gleichmäßig in zwei Gruppen eingeteilt (n = 8 Ratten/Gruppe). Bei den Ratten in der Scheingruppe wird die Scheinoperation durchgeführt, während bei den Ratten in der Modellgruppe eine experimentelle Operation durchgeführt wird, bei der Löcher in die Rille der Trochlea des Oberschenkelknochens gebohrt werden. HINWEIS: Jeder Käfig muss mit sterilen Maiskolbenpolstern abgedeckt werden (siehe Materialtabelle), um die Zehen der Ratten zu schützen.</li>
	<li>Betäubung der Ratten durch eine intraperitoneale Injektion (i.p.) von Pentobarbital-Natrium (40 mg/kg). Drücken Sie dann sanft auf die Zehen der Ratten, um eine ausreichende Anästhesie zu bestätigen. Verwenden Sie eine Tierarztsalbe auf den Augen der Ratten, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. HINWEIS: Die Tierchirurgie muss in einem speziellen Operationssaal mit autoklavierten chirurgischen Instrumenten durchgeführt werden. Die Bediener müssen während der Operation saubere Laborkittel, Gesichtsmasken, Kopfbedeckungen und sterile Handschuhe tragen. Legen Sie sterile Pads über den Operationsbereich und sterilisieren Sie alle Geräte vor dem Gebrauch. Bieten Sie während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch, rasieren Sie die linke und rechte Hintergliedmaße und reinigen Sie den Kniegelenksbereich mit chirurgischer Seife, gefolgt von abwechselnd antiseptischer Povidon-Jod-Lösung und Alkohol dreimal unter sterilen Bedingungen. Legen Sie ein steriles Tuch über die Ratte und legen Sie nur das desinfizierte Kniegelenk frei.</li>
	<li>Machen Sie mit einer Skalpellklinge (Nummer 11) einen 1 cm langen Schnitt in der Mitte des Rattenkniegelenks von oben nach unten und durchtrennen Sie nach der oberflächlichen Dissektion die Gelenkkapsel und die Quadrizeps-femoris-Sehne entlang des medialen Randes der Kniescheibe. HINWEIS: Die Quadrizeps-femoris-Sehne ist während der Beugung des Kniegelenks13 an der Kniescheibe und am Femurkondylus befestigt. Die Furche in der Gelenkkapsel ist die trochleäre Furche femoralis, und der distale Femurkondylus bildet die medialen und lateralen Kondylen.</li>
	<li>Drehen Sie die Kniescheibe nach außen und beugen Sie das Schien- und Wadenbein in einem 90°-Winkel, um die Trochlea des Femurkondylus vollständig freizulegen. Verwenden Sie einen kreisförmigen Bohrer mit einem Durchmesser von 1,6 mm (siehe Materialtabelle) senkrecht zur Knorpeloberfläche bei 4.000 U/min für 10 s, um einen Knorpeldefekt in voller Dicke in der Trochlea-Rille des Oberschenkelknochens mit einer Tiefe von 0,1 mm herzustellen. HINWEIS: Verwenden Sie Kochsalzlösung intermittierend, um das thermische Trauma des umgebenden Knochengewebes während des Bohrvorgangs zu minimieren.</li>
	<li>Wischen Sie die Operationsstelle mit Wattebäuschen ab, die in einer 0,9%igen Kochsalzlösung getränkt sind, ersetzen Sie die Kniescheibe, halten Sie das Knie in einer Streckposition und vernähen Sie den Schnitt Schicht für Schicht mit nicht resorbierbaren 4-0-Nähten (siehe Materialtabelle).<ol><li>Legen Sie die Tiere auf Heizkissen mit Brustbeinlage, überwachen Sie sie, bis sie aufwachen, und bringen Sie sie dann in ihre Käfige zurück. Injizieren Sie Buprenorphin (0,05 mg/kg) alle 8 Stunden dreimal nach der Operation subkutan zur Schmerzlinderung.</li>
	</ol></li>
	<li>Testen Sie das schmerzbezogene Verhalten aller Ratten 3 Tage, 10 Tage und 17 Tage nach der Operation, wie in Abschnitt 2 beschrieben.</li>
</ol>2. Mechanische Entnahmeschwelle (MWT)
ANMERKUNG: Die MWT des bilateralen posterioren Plantars von Ratten wurde mit der klassischen von-Frey-Filament-Schmerzmessmethode14 gemessen.
<ol><li>Setzen Sie die Ratte in eine einzelne Kunststoffkammer (17 cm x 11 cm x 13 cm) auf eine Drahtgeflechtplattform (siehe Materialtabelle) und platzieren Sie die Drahtgitterbasis 50 cm über einem Tisch. Messen Sie die MWT nach 30 Minuten Anpassung.</li>
	<li>Drücken Sie das von-Frey-Filament (siehe Materialtabelle) senkrecht auf die Plantarfläche der Hinterpfote jeder Ratte und biegen Sie die Bürste etwa 2 s lang, wobei Sie den dicksten Teil der Mitte der Hinterpfote vermeiden.</li>
	<li>Steigern Sie das Reizgewicht schrittweise von den niedrigsten 4 g, bis eine positive Reaktion (Pfotenrückzug oder Pfotenlecken) auftritt. HINWEIS: Das Intervall zwischen den einzelnen Stimulationen sollte mehr als 1 Minute betragen. Die MWT ist definiert als drei positive Reaktionen in fünf Stimulationen; Notieren Sie das Stimulusgewicht in Gramm.</li>
	<li>Berechnen Sie die Mittelwerte für die Schein- und Modellgruppen entsprechend dem aufgezeichneten minimalen Stimulusgewicht in Gramm.</li>
</ol>3. Histopathologische und immunhistochemische Analyse
<ol><li>17 und 56 Tage nach der Operation werden die Ratten mit 40 mg/kg Pentobarbital-Natrium (i.p.) betäubt und alle Ratten durch Blutentnahme aus dem Herzen getötet. Isolieren Sie die Knie, indem Sie den Knochen in der Mitte des Oberschenkelknochens und der Mitte des Schienbeins durchtrennen und das umliegende Muskelgewebe sezieren. Entfernen Sie die Kniegelenke für die histologische Analyse.</li>
	<li>Fixieren Sie die Kniegelenke in 20 ml 10%iger Paraformaldehydlösung für 48 h bei Raumtemperatur und entkalken Sie sie dann mit 20 ml 10%iger EDTA-Lösung in einem Orbitalschüttler für 8 Wochen bei 4 °C. Wechseln Sie die EDTA-Lösung jeden Tag.</li>
	<li>Trimmen Sie das Kniegelenk auf die Größe der Einbettbox. Betten Sie die dehydrierten Kniegelenke in 100% Paraffin15 ein.</li>
	<li>Legen Sie die in Paraffin eingebetteten Kniegelenke auf die Halterung eines Mikrotoms, stellen Sie den Winkel ein und schneiden Sie die Paraffinprobe mit einer Klinge ab, bis die Oberfläche flach ist.</li>
	<li>Die Dicke der Paraffinscheiben auf 3 μm einstellen und die Scheiben im Wasserbad bei 40 °C flach drücken.</li>
	<li>Die Scheiben auf Objektträger kleben, in eine 45 °C heiße Backmaschine geben (siehe Materialtabelle), bis sie trocken sind, und bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Entwachsung und Rehydrierung: Entwachsen Sie die Scheiben 4 h lang in einem Ofen bei 60 °C und legen Sie die Scheiben dann nacheinander für jeweils 5 Minuten in 100 % Xylol, 100 % Ethanol (zweimal), 95 % Ethanol, 80 % Ethanol und 75 % Ethanol.</li>
	<li>Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E)<ol><li>Entwachsen, rehydrieren und die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Färben Sie die Scheiben 3 Minuten lang mit 0,5 % Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser, bis keine Hämatoxylin-Rückstände mehr auf den Scheibenoberflächen vorhanden sind.</li>
		<li>Die Scheiben 3 s lang in 1%igen Salzsäurealkohol tauchen und die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Die Scheiben 10 s lang in 1%igem Ammoniakwasser einweichen und 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Die Scheiben 1 Minute lang mit Eosin färben (siehe Materialtabelle) und die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser waschen, bis sich keine Eosinrückstände mehr auf den Scheibenoberflächen befinden.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben jeweils 1 Minute lang nacheinander in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und 100 % Xylol.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen Neutralharz (siehe Materialtabelle) in jede Scheibe und verschließen Sie sie mit einem Deckglas.</li>
	</ol></li>
	<li>Safranin O/Fast Freen (SO) Färbung<ol><li>Entwachsen, rehydrieren und die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Färben Sie die Scheiben 3 Minuten lang mit 0,05 % Fast Green (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser, bis sich keine Fast Green-Rückstände mehr auf der Oberfläche der Scheiben befinden.</li>
		<li>Die Scheiben 10 s lang in 1%ige Essigsäurelösung tauchen und 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Färben Sie die Scheiben 2 Minuten lang mit 2,5 % SO (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Scheiben dann mit doppelt destilliertem Wasser, bis sich keine SO-Rückstände mehr auf den Scheibenoberflächen befinden.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben jeweils 1 Minute lang nacheinander in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und 100 % Xylol.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen neutrales Harz in jede Scheibe und versiegeln Sie sie mit einem Deckglas.</li>
	</ol></li>
	<li>Färbung von Toluidinblau (TB)<ol><li>Entwachsen, rehydrieren und die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben 2 Minuten lang in eine 1%ige TB-Lösung (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser, bis sich keine Toluidinblau-Rückstände mehr auf der Oberfläche der Scheiben befinden.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben jeweils 1 Minute lang nacheinander in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und 100 % Xylol.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen neutrales Harz in jede Scheibe und versiegeln Sie sie mit einem Deckglas.</li>
	</ol></li>
	<li>Masson-Färbung<ol><li>Entwachsen, rehydrieren und die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Bouin-Lösung (siehe Materialtabelle) tropfenweise zu den Scheiben geben, bei 37 °C 2 h färben und mit doppelt destilliertem Wasser waschen, bis die gelbe Farbe auf der Oberfläche der Scheiben verschwindet.</li>
		<li>Die Scheiben 3 Minuten lang mit Celestitblau färben (siehe Materialtabelle) und die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser waschen, bis keine celestitblauen Rückstände mehr auf den Scheibenoberflächen vorhanden sind.</li>
		<li>Färben Sie die Scheiben 3 Minuten lang mit Hämatoxylin und waschen Sie die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser, bis keine Hämatoxylin-Rückstände mehr auf den Scheibenoberflächen vorhanden sind.</li>
		<li>Die Scheiben 5 s lang in saures Ethanol tauchen und 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Die Scheiben 10 Minuten lang mit Ponceau Fuchsin (siehe Materialtabelle) färben und die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser waschen, bis sich keine Ponceau-Fuchsin-Rückstände mehr auf den Scheibenoberflächen befinden.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben 10 Minuten lang in Phosphomolybdänsäure (siehe Materialtabelle), tauchen Sie sie dann 5 Minuten lang in Tuberkuloselösung und waschen Sie die Scheiben mit doppelt destilliertem Wasser, bis sich keine Tuberkuloserückstände mehr auf der Oberfläche der Scheiben befinden.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben 2 Minuten lang in eine schwach saure Lösung und waschen Sie die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben jeweils 1 Minute lang nacheinander in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und 100 % Xylol.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen neutrales Harz in jede Scheibe und versiegeln Sie sie mit einem Deckglas.</li>
	</ol></li>
	<li>Beobachten Sie alle Schichten unter einem Mikroskop in einer doppelblinden Umgebung, um den Grad der Gelenkknorpeldegeneration nach dem Mankin-Scoring-Systemzu bestimmen 16.</li>
	<li>Immunhistochemie<ol><li>Entwachsen und rehydrieren Sie die Scheiben routinemäßig und waschen Sie die Scheiben 2 Minuten lang mit PBS.</li>
		<li>Die Scheiben werden in Natriumcitratlösung getaucht und 4 h lang bei 60 °C in den Ofen gegeben, um das Antigen zu reparieren. Die Scheiben mit PBS dreimal für jeweils 3 min waschen.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben 10 Minuten lang in eine 0,3%ige Triton X-100-Lösung und waschen Sie die Scheiben zweimal mit PBS für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Blockieren Sie die endogene Peroxidaseaktivität, indem Sie eine 3%igeH2O2-Lösung in Methanol bei Raumtemperatur für 30 Minuten zugeben. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit PBS für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Abschnitte mit 5%igem Ziegenserum in PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu blockieren. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit PBS für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Zu jeder Scheibe werden 100 μl PBS-verdünnte Primärantikörper (Anti-Col1, 1:50; Anti-Col3, 1:50; Anti-Col2, 1:100; und Anti-MMP13, 1:100; siehe Materialtabelle) gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit PBS für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Jede Scheibe wird mit 100 μl PBS-verdünntem (1:100) Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen oder Ziegen-Anti-Maus, siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubiert. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit PBS für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Zu jeder Scheibe werden 100 μl 3,3'-Diaminobenzidin (DAB, siehe Materialtabelle) gegeben.</li>
		<li>Beobachten und notieren Sie die Erscheinungszeit einer braunen Farbe unter einem Mikroskop; Die chromogene Reaktion färbt die Epitopstellen braun17. Behandeln Sie die restlichen Proben mit der gleichen aufgezeichneten Reaktionszeit.</li>
		<li>Nachdem die Scheiben braun geworden sind, waschen Sie die Scheiben zweimal mit doppelt destilliertem Wasser für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Die Scheiben 1 Minute lang erneut mit Hämatoxylin färben und die Scheiben 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Die Scheiben 3 s lang in Salzsäure tauchen und 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Die Scheiben 10 s lang in 1%igem Ammoniakwasser einweichen und 2 Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser waschen.</li>
		<li>Tauchen Sie die Scheiben jeweils 1 Minute lang nacheinander in 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und 100 % Xylol.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen neutrales Harz in jede Scheibe und versiegeln Sie sie mit einem Deckglas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Chu, C. R., Szczodry, M., Bruno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+cartilage+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Animal models for cartilage regeneration and repair.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (1), 105-115 (2010).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+regeneration+by+activated+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Medicines%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells.</a> Natural Medicines. 26 (10), 1583-1592 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Diese Studie beschreibt ein Tiermodell zur Nachahmung klinischer Knorpeldefekte durch Bohren von Löchern in die femorale Trochlea-Rille von Ratten (Ergänzende Abbildung 1). Nach einer Knorpelverletzung ist die Erregbarkeit oder Reaktionsfähigkeit peripherer Nozizeptoren erhöht, was zu einer Senkung der Schmerzschwelle und einer Verbesserung der Reaktionsfähigkeit auf Stimulation führen kann18. In präklinischen Studien hat die Modellierung von Knorpeldefekten bei v...

Gelenkknorpel ist ein hochdifferenziertes und dichtes Gewebe, das aus Chondrozyten und extrazellulärer Matrix besteht1. Die Oberflächenschicht des Gelenkknorpels ist eine Form des hyalinen Knorpels, der eine glatte Oberfläche, geringe Reibung, gute Festigkeit und Elastizität sowie eine ausgezeichnete mechanische Belastungstoleranzaufweist 2. Die extrazelluläre Matrix besteht aus Kollagenproteoglykan und Wasser, und Typ-II-Kollagen ist der Hauptstrukturbestandteil des Kollagens, da es etwa 90 % des gesamten Kollagensausmacht 3. Da im Knorpelgewebe keine Blutgefäße oder Nerven vorhanden sind, fehlt ihm die Fähigkeit, sich nach einer Verletzung selbst zu reparieren4. Daher sind Knorpeldefekte, die durch Traumata verursacht werden, seit jeher eine hartnäckige Gelenkerkrankung in Kliniken; Darüber hinaus betrifft diese Gelenkerkrankung tendenziell junge Menschen, und die weltweite Inzidenz nimmt zu 5,6. Das Kniegelenk ist der häufigste Ort von Knorpeldefekten, und Defekte gehen hier mit Gelenkschmerzen, Gelenkfunktionsstörungen und Gelenkknorpeldegeneration einher, was schließlich zu einer Kniearthrose (kOA) führt7. Knorpeldefekte des Kniegelenks stellen wirtschaftliche und physiologische Belastungen für die Patienten dar und beeinträchtigen die Lebensqualität der Patienten erheblich8. Diese Krankheit stellt eine große und dringende klinische Herausforderung dar, für die es keine unmittelbaren Lösungen gibt. Derzeit ist die Operation die Hauptstütze der Behandlung von Knorpeldefekten, aber ihr langfristiges Ergebnis ist nach wie vor unbefriedigend9.
Klinische Knorpeldefekte führen schließlich zu kOA, und daher werden kOA-Tiermodelle häufig für die pathologische Untersuchung von Knorpeldefekten und die Entwicklung von Medikamenten verwendet. Für das Verständnis des pathophysiologischen Prozesses der Knorpeldefektreparatur ist die Etablierung von Tiermodellen wichtig, mit denen die Knorpelregeneration und der Wechsel zwischen Faserknorpel und hyalinem Knorpel beobachtet werden können10. Häufig verwendete kOA-Tiermodelle, wie z. B. chirurgische Modelle der vorderen Kreuzbanddurchtrennung (ACLT), der Destabilisierung des Innenmeniskus (DMM), der Ovariektomie (OVX) und Hulth, benötigen jedoch in der Regel eine Langzeitmodellierung und ermöglichen nur pathologische und schmerzliche Beurteilungen, was die Effizienz der Arzneimittelentwicklung einschränkt11. Neben den chirurgischen Modellen führen auch chemische Modelle wie Monojodacetat (MIA) und Papain-Injektion zu Knorpeldefekten, aber der Grad des Defekts kann nicht gut behandelt werden, und die Bedingungen sind weit von der klinischen Realität entfernt11. Die Kollision ist ein weiterer Ansatz, um Knorpeldefekte bei größeren Tieren zu modellieren, aber diese Methode hängt vom Einsatz spezifischer Instrumente ab und wird selten angewendet12.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die bestehenden kOA-Modelle nicht ideal sind, um die Pathogenese von Knorpeldefekten zu untersuchen oder neue Medikamente zu entwickeln, und ein spezifisches und standardisiertes Modell für Knorpeldefekte benötigt wird. In dieser Studie wurde ein Modell für Knorpeldefekte in voller Dicke (FTCD) erstellt, indem bei Ratten Löcher in die fetale Trochlea-Rille gebohrt wurden. Für die Modellbewertung wurden grobe Beobachtungen, Schmerzverhaltenstests und histopathologische Analysen durchgeführt. Im Gegensatz zu anderen Tiermodellen für kOA hat dieses Modell nur einen geringen Einfluss auf den Allgemeinzustand der Ratten. Dieser Modellierungsansatz ist zugänglich, kann gut verwaltet werden und unterstützt das Verständnis des Fortschreitens von Knorpeldefekten zu kOA und die Entwicklung wirksamer Therapeutika. Dieses Modell kann auch für die Erprobung von Therapien verwendet werden, die kOA verhindern, indem sie Defekte in präosteoarthritischen Gelenken heilen.

<table><tbody><tr><td>3, 3'-Diaminobenzidin &nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.</td><td>ZLI-9019</td><td>Der Farbstoff für die IHC-Färbung</td></tr><tr><td>Anti-Kollagen III-Antikörper</td><td>Novus</td><td>NB600-594</td><td>Primärer Antikörper für IHC</td></tr><tr><td>Anti-Kollagen II Antikörper</td><td>Abcam (UK)</td><td>34712</td><td>Primärer Antikörper für IHC</td></tr><tr><td>Anti-Kollagen I Antikörper</td><td>Novus</td><td>NB600-408</td><td>Primärer Antikörper für IHC</td></tr><tr><td>Bouin Lösung</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Der Farbstoff für die Masson-Färbung</td></tr> von <tr><td>Celestitblau</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Der Farbstoff für die Masson-Färbung</td></tr><tr><td>von Corncob-Polstern &nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Xiaohe Technology Co., Ltd&nbsp;</td><td></td><td>Einstreu für Tiere&nbsp;</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861006</td><td>Der Farbstoff für die HE-Färbung</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>Der Farbstoff für die SO-Färbung</td></tr> von <tr><td>Ziegen-Anti-Maus-Antikörper</td><td>ZSGQ-BIO (Peking, China)</td><td>PV-9002</td><td>Sekundärer Antikörper für IHC-Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper</td></tr><tr><td>ZSGQ-BIO (Peking, China)</td><td>PV-9001</td><td>Sekundärer Antikörper für IHC-Hämatoxylin</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3163</td><td>Der Farbstoff für die HE-Färbung</td></tr><tr><td>Masson</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Der Farbstoff für die Masson-Färbung</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>Rwd Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>Ausrüstung für die Chirurgie</td></tr><tr><td>MMP13</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA)</td><td>69926</td><td>Primärer Antikörper für IHC</td></tr><tr><td>Modulares Gewebeeinbettungszentrum</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>EC 350</td><td>Herstellung von Paraffinblöcken</td></tr><tr><td>Neutrales Harz</td><td>Hangzhou Zhengbo Verifizierter Lieferant - Biotechnologie Co., Ltd.</td><td>ZLI-9555</td><td>Dichtung für IHC</td></tr><tr><td>nicht resorbierbares Nahtmaterial</td><td>Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.</td><td>4-0</td><td>Geräte für die</td></tr><tr><td>Chirurgie Pentobarbital-Natrium&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co., Ltd.</td><td>WBBTN5G</td><td>Betäubte tierische</td></tr><tr><td>Phosphomolybdsäure&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Der Farbstoff für die Masson-Färbung</td></tr><tr><td>von Ponceau fuchsin</td><td>Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.</td><td>R20381</td><td>Der Farbstoff für die Masson-Färbung</td></tr><tr><td>von Rotations- und Gleitmikrotomen</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>HM325</td><td>Präzise Paraffinschnitte</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255</td><td>Der Farbstoff für die SO-Färbung</td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Shanghai Lianhui Medical Supplies Co., Ltd.</td><td>11</td><td>Ausrüstung für die</td></tr><tr><td>Chirurgie Natriumcitratlösung (20x)</td><td>Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.</td><td>HK1222</td><td>Antigen-Gewinnung für IHC</td></tr><tr><td>Sprague Dawley (SD) Ratten</td><td>&nbsp; Verifizierter Lieferant - Shanghai Slake Experimental Animal Co., Ltd.</td><td>SD</td><td>Experimental</td></tr><tr><td>animal Tissue-Tek VIP 5 Jr</td><td>Sakura (Japan)</td><td></td><td>Vakuuminfiltrationsprozessor</td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Der Farbstoff für die TB-Färbung</td></tr><tr><td>Von Frey Filament</td><td>UGO Basile (Italien)&nbsp;</td><td>37450-275</td><td>Ausrüstung für MWT-Assay</td></tr><tr><td>Drahtgeflecht-Plattform&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.</td><td></td><td>Ausrüstung für MWT-Assays</td></tr></tbody></table>

entwicklung und evaluierung eines rattenmodells von knorpeldefekten in voller dicke

Development and Evaluation of a Rat Model of Full-Thickness Cartilage Defects

Knorpeldefekte des Kniegelenks, die durch ein Trauma verursacht werden, sind eine häufige Sportgelenkverletzung in der Klinik und führen zu Gelenkschmerzen, Bewegungseinschränkungen und schließlich zu Kniearthrose (kOA). Eine wirksame Behandlung von Knorpeldefekten oder gar KOA gibt es jedoch kaum. Tiermodelle sind wichtig für die Entwicklung von therapeutischen Medikamenten, aber die bestehenden Modelle für Knorpeldefekte sind unbefriedigend. In dieser Arbeit wurde ein Full-Thickness-Knorpeldefekte-Modell (FTCD) erstellt, indem Löcher in die femorale Trochlea-Rinne von Ratten gebohrt wurden, und das anschließende Schmerzverhalten und die histopathologischen Veränderungen wurden als Ausleseexperimente verwendet. Nach der Operation war die mechanische Entzugsschwelle gesenkt, Chondrozyten an der verletzten Stelle gingen verloren, die Matrix-Metalloproteinase-MMP13-Expression war erhöht und die Typ-II-Kollagenexpression nahm ab, was mit den pathologischen Veränderungen übereinstimmt, die bei menschlichen Knorpeldefekten beobachtet wurden. Diese Methodik ist einfach und unkompliziert durchzuführen und ermöglicht eine grobe Beobachtung unmittelbar nach der Verletzung. Darüber hinaus kann dieses Modell klinische Knorpeldefekte erfolgreich nachahmen und bietet so eine Plattform, um den pathologischen Prozess von Knorpeldefekten zu untersuchen und entsprechende Therapeutika zu entwickeln.

In dieser Arbeit wurde ein Rattenmodell der FTCD erstellt, indem Löcher in die fetale Trochlea-Rinne gebohrt und das spätere Schmerzverhalten und die histopathologischen Veränderungen detektiert wurden. Wie in Abbildung 1 gezeigt, war 3 Tage nach der Modellierung die MWT der Ratten in der Modellgruppe im Vergleich zur Scheingruppe signifikant reduziert, was auf eine durch die FTCD verursachte Hyperalgesie hindeutet. 17 Tage nach der Modellierung blieb die mechanische Entzugsschwelle der Ratt...

Dieses Protokoll erstellt ein Modell der Knorpeldefekte in voller Dicke (FTCD), indem Löcher in die fetale Trochlea-Rinne von Ratten gebohrt und das anschließende Schmerzverhalten und die histopathologischen Veränderungen gemessen werden.

Entwicklung und Evaluierung eines Rattenmodells von Knorpeldefekten in voller Dicke

Cartilage defects of the knee joint caused by trauma are a common sports joint injury in the clinic, and these defects result in joint pain, impaired ...

Dieses Protokoll ahmt nicht nur das Auftreten und die Entwicklung der klinischen FTCD nach, sondern bietet auch ein zuverlässiges Tiermodell für die Bewertung therapeutischer Behandlungen gegen FTCD. Diese Technik ist jedoch einfach durchzuführen und ermöglicht eine Wachstumsbeobachtung unmittelbar nach der Verletzung. Diese Technik kann klinische Knorpeldefekte erfolgreich nachahmen und bietet eine Plattform, um den pathologischen Prozess von Knorpeldefekten zu untersuchen und entsprechende therapeutische Medikamente zu entwickeln.Diese Methode könnte zur Untersuchung traumatischer Knorpeldefekte, namentlich der posttraumatischen Arthrose, eingesetzt werden. Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, ist es wichtig, das Schienbein und das Wadenbein in einem 90-Grad-Winkel zu beugen, um die Cochlea des Femurkondylus vollständig freizulegen und den Bohrer senkrecht zur Knorpeloberfläche zu halten. Beginnen Sie damit, eine betäubte Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch zu legen.Legen Sie ein steriles Tuch über die Ratte und legen Sie das rasierte und desinfizierte Kniegelenk frei. Machen Sie mit einer Skalpellklinge der Nummer 11 einen Zentimeter langen vertikalen Schnitt in der Mitte des Kniegelenks. Und durchtrennen Sie die Gelenkkapsel und die Sehne des Quadrizeps femoris entlang des medialen Patellarandes.Drehen Sie dann die Kniescheibe nach außen und beugen Sie das Schien- und Wadenbein in einem 90-Grad-Winkel, um den Oberschenkelkondylus Cochlea freizulegen. Mit einem 1,6-Millimeter-Kreisbohrer einen 0,1 Millimeter tiefen Knorpeldefekt in voller Dicke im Oberschenkelkondylus cochlea herstellen. Wischen Sie die Operationsstelle mit Wattebäuschen ab, die in 0,9%iger Kochsalzlösung getränkt sind, und setzen Sie die Kniescheibe wieder ein.Halten Sie dann das Knie in einer gestreckten Position und vernähen Sie den Schnitt Schicht für Schicht mit nicht resorbierbaren 4-0-Nähten. Um die mechanische Entzugsschwelle oder MWT" der Ratten zu messen, wird das Tier in eine einzige Kunststoffkammer auf einer Drahtgitterplattform gesetzt. Platzieren Sie die Drahtgitterbasis 50 Zentimeter über einem Tisch.Beginnen Sie die MWT-Messung nach 30 Minuten Eingewöhnungszeit. Als nächstes drückst du das Von-Frey-Filament senkrecht auf die Pflanzfläche der Hinterpfote der Ratte. Biegen Sie dann die Bürste zwei Sekunden lang und vermeiden Sie den dicksten Teil des mittleren Teils der Pfote.Erhöhen Sie das Reizgewicht schrittweise von 4 Gramm, bis eine positive Reaktion wie Pfotenrückzug oder Lecken auftritt. 3 Tage nach der Modellierung zeigten die Ratten in der Modellgruppe im Vergleich zur Scheingruppe eine reduzierte MWT. Dies deutet auf Hyperalgesie in der Modellgruppe hin.Die MWT der Modellgruppe blieb auch nach 17 Tagen niedrig. Indikator für die Dauer der Schmerzempfindlichkeit. Die histopathologische Färbung der Scheingruppe zeigte eine klare artikuläre und intakte Knorpeloberfläche, eine gleichmäßige Verteilung der Chondrozyten und eine hohe Expression von Typ-II-Kollagen.Im Gegensatz dazu zeigt die Modellgruppe eingedrückte Knorpeloberflächen, verlorene Chondrozyten, eine erhöhte Expression der Matrix-Metalloproteinase MMP13 und eine verminderte Expression von Typ-II-Kollagen. Das Wichtigste, woran Sie denken sollten, ist, dass die Patella vor dem Nähen verkleinert werden muss.

development-evaluation-rat-model-full-thickness-cartilage

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von Knorpeldefekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von autologen Chondrozyten auf einer Matrix ausgesät ist eine gut akzeptierte Methode für den Umbau und die Reparatur von Gelenkknorpelläsionen Bereitstellung befriedigend langfristige Ergebnisse. Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation (MACT) bietet eine standardisierte und klinisch etablierte Methode der Implantation.

Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation für Umbau und Reparatur von Knorpeldefekten in einem Kaninchen-Modell

Tiermodelle sind wichtige Werkzeuge für die Bewertung von Tissue-Engineering-Transplantaten. In diesem Artikel wird das Protokoll für die Herstellung eines elektrogesponnenen, biologisch abbaubaren Polymertransplantats für die Verwendung im Tissue Engineering des vorderen Kreuzbandes sowie ein chirurgisches Protokoll für die Implantation in ein Rattenmodell vorgestellt.

Athymischen Rattenmodell für die Bewertung von Engineered vorderen Kreuzbandes Grafts

Die Wachstumsplatte ist eine knorpelige Region in den langen Knochen der Kinder, wo Längswachstum auftritt. Bei Verletzung kann das Knochengewebe das Wachstum formen und beeinträchtigen. Wir beschreiben ein Rattenmodell der Wachstumsplattenverletzung, die zu knöchernem Reparaturgewebe führt und das Studium von Reparaturmechanismen und Wachstumsplattenregenerationsstrategien ermöglicht.

Ein Ratten-Tibia-Wachstumsplatten-Verletzungsmodell, um Reparaturmechanismen zu charakterisieren und Wachstumsplatten-Regenerationsstrategien zu bewerten

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

In Vivo Säugetier-Modelle der kritischen Größe Knochendefekte sind essentiell für Forscher heilenden Mechanismen und orthopädische Therapien. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erstellung von reproduzierbaren, segmentale, femoralen Mängel bei Ratten mit Fixateur externe stabilisiert.

Eine zuverlässige und reproduzierbare kritische Größe segmentale femoralen defekt-Modell bei Ratten mit einer benutzerdefinierten Fixateur externe stabilisiert

Hier präsentieren wir das zyklisch belastungsinduzierte intraartikuläre Knorpelläsionsmodell des Rattenknies, das durch 60 zyklische Kompressionen über 20 N erzeugt wird, was bei Ratten zu einer Schädigung des femoralen Kondylenknorpels führt.

Eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung des zyklischen Belastungsinduzierten intraartikulären Knorpelläsionsmodells des Rattenknies

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Ein reproduzierbares Knorpelimpaktmodell zur Erzeugung einer posttraumatischen Arthrose beim Kaninchen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung eines Box-Cavity-Defekts in Femurdiaphysegewebe von Ratten vor. Dieses Modell kann die Leistung von Biomaterialien unter biomechanischer Belastung bewerten und Mechanismen der Knochenregeneration im Zusammenhang mit der intramembranösen Osteogenese untersuchen.

Erstellung eines Modells eines Box-Cavity-Defekts im kortikalen Knochen von Femora der Ratte

Wir beschreiben die detaillierten chirurgischen Abläufe von Schädeldach-Naht-Knochen-Kompositdefekten bei Ratten und untersuchen die kurz- und langfristigen Prognosen des Modells. Unser Ziel ist es, ein standardisiertes Modell für die Entwicklung nahtregenerativer Therapien zu entwickeln.

Die Etablierung von kalvarialen, naht-knöchernen Kompositdefekten bei Ratten: Ein standardisiertes Modell für die Untersuchung der nahtregenerativen Therapie

Hier stellen wir ein integriertes Protokoll zur Erzeugung kontrollierter osteochondraler Läsionen in Schafsknien vor, um ein experimentelles Modell zu etablieren, das für Knochen- und Knorpelgeweberegenerationsstudien geeignet ist. Das Protokoll beschreibt eine Methode, um einen vollwertigen osteochondralen Defekt im Oberschenkelkondylus zu induzieren, wobei Techniken verwendet werden, die Auswirkungen auf das Tierwohl und die Variabilität der Ergebnisse minimieren.

Etablierung und Bewertung eines Schafmodells für volldicken osteochondralen Defekt

Diese Studie etablierte ein Modell des Ratten-Femoral-Halbsegmentdefekts, um die mechanische und osteogene Leistungsfähigkeit von Knochenersatzmaterialien unter lasttragenden Bedingungen ohne interne oder externe Fixation zu bewerten.

Modell des halbsegmentalen diaphysären Knochendefekts bei Ratten zur Bewertung der Knochensubstitutionsleistung in belastenden Bereichen

Erfahren Sie die Entwicklung eines Rattenmodells für Knorpeldefekte in voller Dicke mit Bohrtechnik und histopathologischer Analyse. Diese Methode ermöglicht die Evaluierung therapeutischer Behandlungen und die Untersuchung von Schmerzmechanismen.

Entwicklung und Evaluierung eines Rattenmodells von Knorpeldefekten in voller Dicke

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