Name: Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Erfahren Sie die optimierte Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Diese Methode bewahrt lipidreiche Zellen, die bei Dichtegradientenzentrifugation verloren gehen, und ermöglicht präzisere Leberregenerationsstudien.

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Diese Studie wurde vom Schweizerischen Nationalfonds unterstützt (Projektbeitrag 310030_189262).

<ol><li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li>
<li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizardo+Thiebaud%2C+MJ+%22Liver+Pathology%22">Liver Pathology</a>. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2%2B+on+enzymatic+dispersion+of+isolated%2C+perfused+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li>
<li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+down-regulation+promotes+%CE%B2-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+%28HABR%29+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).</li>
<li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li>
<li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li>
<li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li>
<li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li>
<li>Roche, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoche%2C++%22Liberase+TM+Research+Grade%22">Liberase TM Research Grade</a>. , (2020).</li>
<li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes%2C+which+inhibits+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li>
<li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li>
<li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+following+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22HPB%22%5BJournal%5D)">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li>
<li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li>
<li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-sweetened+beverage%2C+diet+soda%2C+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenteroly+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li>
<li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma%3A+a+problem+of+growing+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+body+weight+and+metabolic+%28dysfunction%29-associated+fatty+liver+disease+%28MAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Das veröffentlichte Protokoll bietet eine zuverlässige und unkomplizierte Methode zur Isolierung einer hohen Ausbeute an normalen und steatotischen murinen Hepatozyten für Einzelzell-Downstream-Analysen oder Massenanalysen von Zellen nach FACS-Sortierung. Der entscheidende Vorteil gegenüber der Dichtegradientenreinigung besteht darin, dass der zelluläre Lipidgehalt im Wesentlichen keinen Einfluss auf die effektive Ausbeute an Hepatozyten hat. So bleibt der Anteil der steatotischen Hepatozyten erhalten und wird in nachgel...

Die Leber kann sich auch nach einem größeren Gewebeverlust selbst regenerieren. Diese einzigartige Regenerationsfähigkeit wird explizit durch das experimentelle Modell der partiellen (70%) Hepatektomie veranschaulicht, das erstmals 1931 von Higgins und Anderson an Ratten beschrieben wurde1. In diesem Modell werden 70% der Leber operativ von Tieren entfernt, indem größere Leberlappen abgeschnitten werden. Die verbleibenden Lappen wachsen dann durch kompensatorische Hypertrophie, um die ursprüngliche Lebermasse innerhalb von etwa 1 Woche nach der Operation wiederherzustellen, wenn auch ohne Wiederherstellung der ursprünglichen Leberarchitektur 2,3. Es wurden zusätzliche Hepatektomien mit unterschiedlichen Mengen an Gewebeentfernung entwickelt, wie z. B. eine 86% erweiterte Hepatektomie, bei der der Leberrest zu klein ist, um sich zu erholen, was schließlich zu Leberversagen nach Hepatektomie (PHLF) und anschließendem Tod bei 30%-50% der Tiere führt 4,5,6. Diese Modelle ermöglichen die Untersuchung der normalen und fehlgeschlagenen Leberregeneration, abhängig von der Menge des resezierten Gewebes (Abbildung 1).
Obwohl Mausmodelle der Hepatektomie seit vielen Jahren erfolgreich eingesetzt werden, ermöglichen erst in jüngster Zeit fortschrittlichere Analysemethoden einen tieferen Einblick auf Einzelzellebene. Für die meisten dieser Methoden ist jedoch das Vorhandensein einzelner Hepatozyten eine Grundvoraussetzung. Die meisten Protokolle für die Isolierung von primären Hepatozyten basieren auf einer zweistufigen Kollagenase-Perfusionstechnik und einer anschließenden Dichtegradientenreinigung, um lebensfähige Hepatozyten von Trümmern und nicht-parenchymalen sowie toten Zellen zu trennen 7,8,9. Diese Methode wurde erstmals 1969 von Berry und Friend beschrieben10 und 1972 von Seglen und Kollegen angepasst11,12. Da die Gradientenzentrifugation jedoch von der Dichte und Größe der Zellen abhängt, gehen lipidbeladene Hepatozyten während der Standardreinigung häufig verloren. Während ein solcher Verlust für viele Forschungsfragen vernachlässigbar sein kann, ist er ein entscheidender Aspekt für die frühe Leberregeneration. Während der ersten 2 Tage akkumulieren Hepatozyten in der sich regenerierenden Mausleber Lipide, wodurch sie an Größe zunehmen und an Dichte verlieren. Diese transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) dient der Bereitstellung von regenerativem Brennstoff und ist vorübergehend, überlappt jedoch teilweise die Hauptproliferationsphase und ist ungleichmäßig in den Leberläppchen - den Funktionseinheiten der Leber- verteilt 13,14. Nach längerer 86%-Hepatektomie tritt jedoch auch eine TRAS auf, die jedoch bestehen bleibt, da die Regeneration ins Stocken geraten ist und die Lipide nicht oxidiert werden14. Daher führt die Gradientenreinigung von Hepatozyten nach 70%- oder 86%-Hepatektomien zu nicht repräsentativen Fraktionen, da die meisten lipidbeladenen Hepatozyten aufgrund ihrer geringen Dichte verloren gehen15.
In diesem modifizierten Isolationsprotokoll werden Hepatozyten von C57BL/6-Mäusen 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. In der Regel erfolgt die Kanülierung und Perfusion des Restes zur Zellisolierung über die Pfortader. Der portovaskuläre Widerstand in kleinen Überresten, die nach einer größeren Resektion zurückbleiben, ist jedoch hoch16, und daher ist die Perfusion empfindlich. Da die Hohlvene von Hepatektomien unberührt bleibt, kann die Perfusion durch Kanülierung der Hohlvene leicht in retrograder Richtung durchgeführt werden. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Leberrest, wobei eine retrograde Perfusion mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird (Ergänzende Abbildung S1). Hepatozyten werden durch Kollagenasen dissoziiert und aus der Glisson-Kapsel freigesetzt. Nach dem Waschen und der sorgfältigen Verarbeitung lebensfähiger Hepatozyten durch schrittweise Isolierung mit einem langsamen Zentrifugationsansatz können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Zombie grün</td><td>BioLegend</td><td>423111</td><td>Amin-reaktiver Viabilitätsfarbstoff</td></tr><tr><td>Attan Isofluran ad us. vet. 99.9%</td><td>Provet AG</td><td>QN01AB06</td><td>ACHTUNG: Beatmung</td></tr><tr><td>benötigt EDTA-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML-Ethanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229</td> Mit <td>Wasser auf 70%</td></tr>iges <tr><td>fötales Rinderserum (FCS)</td> verdünnenGibco <td></td><td></td><td>A5256701-Hanks</td></tr><tr><td>' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269-6x600ML</td><td>Für den Aufschluss/die Konservierung</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), ohne Ca2+, ohne Mg2+, kein Phenolrot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6x500ML</td><td>Für Perfusionspuffer</td></tr><tr><td>HEPES-Lösung, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML-F-Histoacryl-Gewebekleber</td><td></td></tr> <tr><td>(Butyl-2-cyanacrylat)</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td>Zur Stabilisierung der Kanülierungsstelle</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 Färbefarbstofflösung</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>-</td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>lyophilisierte Kollagenasen I/II</td></tr><tr><td>NaCl 0,9 % 500 mL Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>123-Paralube</td><td></td></tr> <tr><td>Vet Salbe</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38-Phosphatgepufferte</td><td></td></tr> <tr><td>Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td></td> <td>A1286301-Sudan</td></tr> <tr><td>IV &ndash; Lipidfärbung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>V001423-Temgesic (Buprenorphinhydrochlorid), Injektionslösung 0,3 mg/ml</td><td>Indivior Europe Ltd.</td><td>345928</td><td>Betäubungsmittel. Sicher aufbewahren.</td></tr><tr><td>Trypanblau, 0,4%, sterilfiltriert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>Williams' Medium E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4128-500ML-</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL serologische Pipette, Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>P7865-50</td><td></td></tr> <tr><td>mL Falcon Tubes</td><td>TPP</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>BD Neoflon, Pro IV Katheter 26 G</td><td>BD Falcon</td> <td>391349-Cell</td><td></td></tr> <tr><td>Schaber, rotierende Klingenbreite 25 mm</td><td>TPP</td><td>99004-Falcon</td><td></td></tr> <tr><td>Zellsieb 100 & Mikro; m Nylon</td><td>BD Falcon</td><td>352360-Fenestiertes</td><td></td></tr> <tr><td>steriles</td> <td>OP-Tuch</td> <td>-</td> <td>Wiederverwendbares Stoffmaterial</td></tr><tr><td>Fülldüse für Schläuche der Größe 16# (ID 3,1 mm)</td><td>Drifton</td><td>FÜLLDÜSE#16</td><td>Zum Einsetzen in die Röhrchen</td></tr><tr><td>Durchflusszytometrie-Röhrchen, 5 mL</td><td>BD Falcon</td> <td>352008-männlicher</td><td></td></tr> <tr><td>Luer zum Widerhaken, Schlauch ID 3,2 mm</td><td>Drifton</td><td>LM41</td><td>Verbindungsschlauch zur Spritze</td></tr><tr><td>Petrischale, 96 x 21 mm</td><td>TPP</td><td>93100-Prolene</td><td></td></tr> <tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>8614H</td><td>Zum Zurückziehen des Brustbeins</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td>Für Hautnaht</td></tr><tr><td>Prolene 8-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7470E</td><td>Ligatur Gallenblase</td></tr><tr><td>Sonde 16#, WT 1,6 mm, ID 3,2 mm, OD 6,4 mm</td><td>Drifton</td><td>SC0374T</td><td>Perfusionskanüle</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa Zellanalysator Durchflusszytometer</td><td>BD</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Isis Nagetierrasierer</td><td>Aesculap</td><td>GT421-Isofluran</td><td></td></tr> <tr><td>Station</td><td>Provet</td><td></td> <td>-</td></tr> <tr><td>Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit &ndash; Scanspeed 416</td><td>Labogene</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Neubauer-verbesserte Zählkammer</td><td>Marienfeld</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Sauerstoffkonzentrator &ndash; EverFlo</td><td>Philips&nbsp;</td><td>1020007</td><td>0 &ndash; 5 L/min</td></tr><tr><td>Pipetboy &ndash; Pipettierer Turbo-Fix</td><td>TPP</td><td>94700-Shenchen</td><td></td></tr> <tr><td>Perfusionspumpe &ndash; YZ1515x</td><td>Shenchen</td><td>YZ1515x-Operationsmikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>&ndash; SZX9</td><td>Olympus</td><td></td> <td>-</td></tr> <tr><td>ThermoLux Wärmematte</td><td>Thermo Lux</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td><td>NeoLab</td><td>7-0092</td> <td>-</td></tr> <tr><td>Wasserbad &ndash; Precision GP 02</td><td>Thermo scientific-Adjust</td><td></td> <td>auf 42 &deg; C</td></tr></tbody></table>

isolierung regenerierender hepatozyten nach partieller hepatektomie bei mäusen

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Die partielle Hepatektomie ist weit verbreitet, um die Leberregeneration bei Mäusen zu untersuchen, aber die Isolierung hoher Ausbeuten lebensfähiger Hepatozyten für nachgeschaltete Einzelzellanwendungen ist eine Herausforderung. Eine deutliche Akkumulation von Lipiden in regenerierenden Hepatozyten wird während der ersten 2 Tage der normalen Leberregeneration bei Mäusen beobachtet. Diese sogenannte transiente regenerationsassoziierte Steatose (TRAS) ist temporär, überschneidet sich aber teilweise mit der Hauptproliferationsphase. Die Dichtegradientenreinigung ist das Rückgrat der meisten existierenden Protokolle zur Isolierung von primären Hepatozyten. Da die Gradientenreinigung auf der Dichte und Größe der Zellen beruht, trennt sie nicht-steatotische von steatotischen Hepatozytenpopulationen. Daher gehen Fetthepatozyten häufig verloren, was zu nicht repräsentativen Hepatozytenfraktionen führt. 
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode zur in vivo Isolierung von regenerierenden Hepatozyten unabhängig von ihrem Lipidgehalt. Hepatozyten von männlichen C57BL/6-Mäusen werden 24-48 h nach der Hepatektomie durch einen klassischen zweistufigen Kollagenase-Perfusionsansatz isoliert. Eine Standard-Peristaltikpumpe treibt die erwärmten Lösungen über die katheterisierte untere Hohlvene in den Rest, wobei eine retrograde Perfusionstechnik mit Abfluss durch die Pfortader verwendet wird. Hepatozyten werden durch Kollagenase dissoziiert, um sie aus der Glisson-Kapsel freizusetzen. Nach dem Waschen und sorgfältigen Zentrifugieren können die Hepatozyten für beliebige nachgeschaltete Analysen verwendet werden. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit eine einfache und reproduzierbare Technik zur Isolierung einer repräsentativen Population regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Die Methode kann auch bei der Untersuchung von Fettlebererkrankungen helfen.

TRAS erreicht 16 Stunden nach der Hepatektomie seinen Höhepunkt und verschwindet allmählich 32-48 Stunden nach der Standardhepatektomie, bleibt aber nach der verlängerten Hepatektomie über 48 Stunden hinaus bestehen. Makroskopisch ist TRAS als blasser Teint des Leberrestes gut sichtbar (Abbildung 1F) und kann bei hepatektomierten Mäusen zwischen 16 h und 48 h nach der Operation beobachtet werden.
Die geschätzte Endausbeute beträgt 10-15 × 10 6 Hepatozyt...

Lipidbeladene Hepatozyten sind der Leberregeneration inhärent, gehen aber normalerweise bei der Zentrifugation mit Dichtegradienten verloren. Hier stellen wir ein optimiertes Zellisolationsprotokoll vor, das steatotische Hepatozyten beibehält, was repräsentative Populationen von regenerierenden Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen ergibt.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine optimierte Methode für die Hepatozytenisolierung bei Mäusen nach partieller Hepatektomie ohne die Notwendigkeit einer Dichtegradientenzentrifugation zu präsentieren. Wir sehen normalerweise einen großen Prozentsatz von lipidbeladenen Hepatozyten während der frühen Regeneration. Die steatotischen Hepatozyten, die normalerweise bei der Zentrifugation des Dichtegradienten aufgrund der geringen Dichte verloren gehen, bleiben bei diesem Protokoll erhalten.Um die Perfusionsausrüstung vorzubereiten, schließen Sie eine 26-Gauge-IUI-Kanüle mit einem Luer-Lock-Anschluss an das Auslassende des Schlauchs an. Spülen Sie dann den Schlauch und führen Sie das Einlassende des Schlauches in das vorgewärmte Perfusionspufferrohr im Wasserbad ein. Grundieren Sie es mit warmem Perfusionspuffer bei einer Pumpengeschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute.Bevor Sie mit der Operation fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Maus ausreichend betäubt ist. Reinigen Sie dann den Bauch mit einer chirurgischen Peelinglösung und 70% Ethanol. Schneiden Sie dann die Nähte ab, um den Mittellinienschnitt wieder zu öffnen, der zuvor für die partielle Hepatektomie gemacht wurde, und ziehen Sie die Wundränder vorsichtig auseinander.Wenn die Hepatektomie älter als 24 bis 48 Stunden ist, entfernen Sie die Naht und schneiden Sie die Haut mit einer Schere oder einem Skalpell ab. Verwenden Sie einen Retraktor oder einfache Clips, um den Bauch offen zu halten. Die Bauchhöhle sollte so weit wie möglich freigelegt werden, um den Zugang und die Visualisierung zu optimieren.Befestigen Sie eine 5-0-Polypropylennaht am Brustbein. Ziehen Sie es kranial und fixieren Sie es in dieser Position. Bewegen Sie den Darm mit sterilen Wattestäbchen nach rechts, um die Pfortader und die Hohlvene freizulegen.Verwenden Sie ein feuchtes Tuch, um den Darm zu halten. Platzieren Sie einen schweren Gegenstand von etwa zwei Zentimeter Höhe, z. B. einen Metallgewichtsring, neben den Hinterbeinen der Maus. Legen Sie dann den Schlauch mit der angeschlossenen 26-Gauge-IUI-Kanüle auf das Objekt und positionieren Sie die Nadel vorsichtig auf der Hohlvene.Passen Sie die Länge des Schlauchs nach Bedarf an. Die Kollagenase-Stammlösung wird in das vorgewärmte Aufschlusspufferrohr überführt. Bereiten Sie 10 bis 20 Milliliter Verdauungspuffer pro Tier vor.Schalten Sie die Pumpe ein, nachdem Sie die Pumpendrehzahl auf drei Milliliter pro Minute eingestellt haben. Entsorgen Sie die ersten zwei bis drei Milliliter des vorgewärmten Perfusionspuffers, sobald der Puffer die Nadel erreicht. Um die Kanülierung der unteren Hohlvene durchzuführen, ziehen Sie die Hohlvene mit einem sterilen Wattestäbchen vorsichtig kaudal unter die Punktion, damit die bereitgestellte Spannung das Einführen der Kanüle in die Vene erleichtert.Führen Sie die 26-Gauge-IUI-Kanüle in einem flachen Winkel in die untere Hohlvene unterhalb der Niere ein, während der Puffer durch die Nadel verläuft. Stellen Sie sicher, dass die Nadelfase nach oben zeigt. Suchen Sie in der Blitzkammer des Katheters nach Blut, wenn die Nadel in das Lumen eindringt.Schieben Sie die Nadel weitere zwei bis drei Millimeter vor, um sicherzustellen, dass die Spitze des Katheters in die Vene eindringt. Schieben Sie den Kunststoffkatheter weitere fünf Millimeter über die Nadel und in die Hohlvene. Entfernen Sie die Nadel langsam und sehr vorsichtig.Suchen Sie nach zwei bis drei Sekunden nach weißen Flecken, die sich in der Leber bilden, oder nach Schwellungen der Pfortader, was darauf hindeutet, dass der Perfusionspuffer durch die Leber fließt und aus der Zentralvene in die Leberläppchen gelangt. Warten Sie, bis die Pfortader innerhalb von ein bis zwei Sekunden sichtbar anschwillt, nachdem sich weiße Flecken auf der Leberoberfläche gebildet haben. Schneiden Sie die Pfortader mit einer Schere so distal wie möglich vom Leberhilus ab.Erhöhen Sie die Flussrate auf vier bis sieben Milliliter pro Minute, abhängig vom Gewicht des Tieres, der Lebergröße und dem Ausmaß der anfänglichen Hepatektomie. Klemmen Sie die Pfortader sieben bis 10 Sekunden lang mit einer Pinzette oder einer Gefäßklemme fest. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit durchläuft.Führen Sie nach ca. 30 Sekunden eine zweite Klemme durch und sorgen Sie dafür, dass die Leber anschwillt und sich entspannt. Spülen Sie das Tier drei bis vier Minuten lang weiter und beobachten Sie, wie der klare Puffer aus der Pfortader fließt. Klemmen Sie die Pfortader für drei bis vier Sekunden fest, bevor der Verdauungspuffer die Leber erreicht.Stellen Sie sicher, dass sich die Leber beim Lösen der Klemme entspannt und die Perfusionsflüssigkeit klar bleibt. Sobald der Verdauungspuffer die Leber erreicht, klemmen Sie die Pfortader erneut fest. Die Leber sollte sich nach dem Lösen der Klemme nicht entspannen.Verdauen Sie etwa vier Minuten lang bei einer Flussrate von fünf Millilitern pro Minute. Achten Sie bei fortschreitender Verdauung auf Anzeichen dafür, dass die Leber anschwillt, und auf kleine transparente Abschnitte auf der Oberfläche der Leber. Beachten Sie, dass die Leber die Textur eines nassen Stoffes annimmt und fast matschig erscheint.Untersuchen Sie die Konsistenz, indem Sie sie vorsichtig mit einem feuchten, sterilen Wattestäbchen berühren. Fahren Sie mit der Perfusion fort, bis ein deutlicher Unterschied in der Oberflächenstruktur der Leber beobachtet werden kann. Beachten Sie, dass die Leber eine sehr helle Farbe und ein sprudelndes Aussehen annimmt, was darauf hinweist, dass sich die Glisson-Kapsel vom Parenchym trennt.Stoppen Sie die Verdauung, sobald die Leber diese Eigenschaften erworben hat. Entfernen Sie die Nadel, bevor die Luft in die Leber gelangt. Fassen Sie das zentrale Bindegewebe zwischen den Lappen mit einer Pinzette und heben Sie es leicht nach oben, indem Sie es als Ankerpunkt verwenden.Schneiden Sie alle Verbindungen der Leber zu anderen Organen ab und entfernen Sie die Gallenblase. Entfernen Sie die Leber vorsichtig aus der Bauchhöhle. Seien Sie vorsichtig, da es in diesem Stadium dünn und zerbrechlich sein wird.Legen Sie die Leber in den eiskalten Konservierungspuffer. Übertragen Sie die Leber in eine 10-Zentimeter-Petrischale und fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes Williams'Medium E.Rupture the Glisson-Kapsel mit einer feinen Pinzette an einigen Stellen entlang der Leberoberfläche hinzu. Fassen Sie einen zentralen Teil mit zwei Pinzetten.Ziehen Sie sie langsam auseinander, damit die Kapsel reißen kann, ohne die Hepatozyten zu beschädigen, und geben Sie die Zellen frei, indem Sie die Kapsel leicht schütteln. Filtern Sie fünf Milliliter Leberpulpe durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 10 Millilitern frischem eiskaltem Medium aus und filtern Sie die restlichen fünf Milliliter Zellstoff durch das Zellsieb.Schleudern Sie den Extrakt bei 50 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den größten Teil des Überstands ab und lassen Sie einen Milliliter übrig, um die Zellen durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens zu resuspendieren. Fügen Sie 40 Milliliter kaltes Williams'E Medium hinzu und wiederholen Sie den Schritt dreimal.Fahren Sie mit der Isolierung von Hepatozyten fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Nach einer Hepatektomie von 70 % bei Mäusen betrug die endgültige Hepatozytenausbeute etwa 10 bis 15 x 10 bis 6 mit einer mittleren Lebensfähigkeit von 78 %. Nach einer verlängerten Hepatektomie von 86 % betrug die Hepatozytenausbeute vier bis neun x 10 bis 6 mit einer mittleren Lebensfähigkeit von 65 %.Nach partiellen Hepatektomien zeigen Hepatozyten eine erhöhte Zellgröße im Vergleich zu normalen Lebern, die einem erhöhten Lipidgehalt entspricht. Ein erhöhter Lipidgehalt wurde in murinen Hepatozyten 24 Stunden nach partieller Hepatektomie beobachtet, was als Zunahme der Granularität oder direkt durch das Vorhandensein von Lipidvesikeln in vergrößerten Hepatozyten beobachtet wurde. Bei der klassischen Dichtegradientenreinigungsmethode gingen große Fetthepatozyten im Überstand verloren und nur kleinere magere Hepatozyten wurden im Zellpellet gesammelt.Mit dem verbesserten Protokoll gingen die lipidgefüllten Hepatozyten nicht verloren und alle Hepatozyten wurden pelletiert. Die wiederholte Klemmung erleichtert den Spülvorgang. Damit wird die Leber optimal von verbliebenen Blutbestandteilen befreit, die die Verdauungsenzyme hemmen könnten.

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Medicine

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Erfahren Sie die optimierte Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen. Diese Methode bewahrt lipidreiche Zellen, die bei Dichtegradientenzentrifugation verloren gehen, und ermöglicht präzisere Leberregenerationsstudien.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

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