Name: Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Erfahren Sie die dreidimensionale Kultur muriner Kolonkrypten zur Untersuchung intestinaler Stammzellen ex vivo. Diese Methode ermöglicht die Analyse genetischer Modifikationen wie Claudin-7-Knockout.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Studie wurde vom NIH DK103166 finanziert.

Alle Tierversuche und -verfahren wurden vom Animal Care and Use Committee (IACUC) der East Carolina University (ECU) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health und der ECU zur Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Induzierbare, Darm-spezifische Claudin-7-Knockout-Mäuse wurden durch Kreuzung von C57BL6-Claudin-7-flox-transgenen Mäusen mit Villin-CreERT2-Mäusenerzeugt 19. Männliche und weibliche Mäuse im Alter von 3 Monaten wurden in dieser Studie verwendet.
1. Vorbereitung des Reagenzes/der Ausrüstung
<ol><li>Kühlen Sie die folgenden Reagenzien/Geräte ab, bevor Sie mit den zugehörigen Experimenten beginnen: phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen von Darmgewebe während der Kryptenisolierung; eine Wippe/Rotatorin (in einem 4 °C Kühlschrank) zur Inkubation mit epithelialen Dissoziationsmedien.<ol><li>Die Gelmatrix (siehe Materialtabelle) von -20 °C entfernen und vor dem Plattieren auf Eis auftauen.</li>
		<li>Kühlen Sie die Zentrifuge auf 4 °C vor, bevor Sie die Krypten zur Beschichtung abdrehen.</li>
		<li>Kühlen Sie 0,1% Natriumcitratpuffer (siehe Tabelle der Materialien) und halten Sie es auf Eis, bevor der Zelltod in situ nachgewiesen wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Erwärmen Sie die folgenden Reagenzien, bevor Sie mit den zugehörigen Experimenten beginnen: eine 96-Well-Kulturplatte für 24 Stunden vor dem Plattieren; L-WRN-Medien (siehe Materialtabelle) vor dem Hinzufügen zu plattierten Krypten und vor jedem Medienwechsel.<ol><li>Das Wasserbad vor dem Färben auf 94 °C erhitzen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Isolierung der Kolonkrypta von Murine
<ol><li>Bereiten Sie die erforderlichen Medien vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen. HINWEIS: Die Medienvolumina werden hier für das Dickdarmgewebe zweier Mäuse berechnet.<ol><li>epitheliale Dissoziationsmedien vorbereiten: 30 mL 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632-Dihydrochlorid (siehe Materialtabelle). Bis zum Gebrauch auf Eis halten.</li>
		<li>Krypta-Dissoziationsmedien vorbereiten: 10 mL 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632-Dihydrochlorid. Bis zum Gebrauch auf Eis halten.</li>
		<li>Ergänzung L-WRN-Medien: 50 ml L-WRN-Medien + 47,5 ml DMEM-Hochglukose mit L-Glutamin + 500 μL L-Glutamin + 500 μL Pennicilin/Streptomycin + 1.000 μL B-27-Ergänzung (50x) + 500 μL N2-Ergänzung (100x) + 50 μL HEPES-Pufferlösung (1 M) (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Filtern Sie das komplette (ergänzte) L-WRN-Medium und Aliquot für die Lagerung bei -20 °C für bis zu 3 Monate. HINWEIS: Aufgetaute Medien sind bis zu 2 Wochen bei 4 °C stabil.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Crypt-Isolierung durch.<ol><li>Für die Vollnarkose fügen Sie 1 ml Isofluran zu Baumwolle hinzu und legen Sie es in eine Plastikkassette in einer 0,09 Kubikfuß Anästhesiekammer (siehe Materialtabelle). Legen Sie die Maus in die Anästhesiekammer, bis die Atmung anhält (ca. 3-5 min) und führen Sie dann eine zervikale Dislokationdurch 20.</li>
		<li>Machen Sie einen etwa 2-Zoll-Schnitt entlang der Mittellinie der Maus und stecken Sie die Rückenhaut fest, um den Bauch freizulegen. Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie von der proximalen Seite direkt unter dem Blinddarm und von der distalen Seite über dem Rektum schneiden21.</li>
		<li>Entfernen Sie mit einer Pinzette das am Dickdarm befestigte Fettgewebe. Drücken Sie den Kot vorsichtig mit dem flachen Ende der Pinzette heraus und schneiden Sie das Gewebe längs auf.</li>
		<li>Waschen Sie das Gewebe 10-15 Mal mit kaltem 1x PBS mit einer Pinzette, um das Gewebe zwischen den Wäschen in PBS herumzuwirbeln.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gewebe mit einer sauberen, scharfen Schere in kleine Stücke, die etwa 3-5 mm groß sind.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Maus und kombinieren Sie die Gewebestücke in einem 50-ml-Röhrchen mit kalten epithelialen Dissoziationsmedien (Schritt 2.1.1).</li>
		<li>Die Dickdarmgewebestücke in epithelialen Dissoziationsmedien 90 min bei 4 °C unter leichtem Schaukeln inkubieren.</li>
		<li>Lassen Sie die Gewebefragmente auf den Boden des Röhrchens sinken und entsorgen Sie dann vorsichtig das epitheliale Dissoziationsmedium, ohne das Gewebe zu stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn Sie das Gewebe 10-15 Mal mit kaltem 1x PBS waschen. Entsorgen Sie so viel PBS wie möglich während der letzten Wäsche.</li>
		<li>Fügen Sie das Krypta-Dissoziationsmedium (Schritt 2.1.2) in das 50-ml-Röhrchen mit den Dickdarmgewebestücken hinzu und schütteln Sie es kontinuierlich für 5-10 Minuten von Hand. HINWEIS: Die Medien müssen von den dissoziierten Krypten trüb werden.</li>
		<li>Unter der Zellkulturhaube filtrieren Sie das Gewebe und die Medien mit einem 70-μm-Nylonzellsieb (siehe Materialtabelle) in ein frisches 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Bei 200 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entsorgen, ohne das kryptahaltige Pellet zu stören. HINWEIS: Je nach Gerät kann man das gespannte Medium zum Zentrifugieren in ein 15-ml-Rohr überführen.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet in ~3-4 mL kaltem 1x PBS.</li>
		<li>Pipette 10 μL der isolierten Krypten in einer Linie auf einem Objektträger. Zählen Sie unter dem Mikroskop die Anzahl der vollen, langen Krypten, um die Kryptenkonzentration pro 10 μL zu schätzen.</li>
		<li>Berechnen Sie das geeignete Volumen der zu drehenden Krypten, um 10 Krypten / μL in eine 96-Well-Platte zu legen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Verschlüsselung
<ol><li>Zentrifugieren Sie ein geeignetes Volumen isolierter Krypten in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer 1.000 μL Pipette, ohne die pelletierten Krypten zu stören.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL Gelmatrix (genug für neun Vertiefungen) zu den pelletierten Krypten hinzu und pipetten Sie vorsichtig, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden. HINWEIS: Im Abschnitt Diskussion finden Sie eine detaillierte Beschreibung, wie die Gelmatrix und die Krypten gemischt werden. Typischerweise sind 100 μL für neun Vertiefungen ausreichend.</li>
	<li>Lassen Sie die Gelmatrix teilweise erstarren (~1-2 min).</li>
	<li>Platte 10 μL der Gelmatrix gemischt mit den Krypten in jeder Vertiefung einer vorgewärmten 96-Well-Kulturplatte, um eine Kuppelform zu bilden. HINWEIS: Platzieren Sie die Kuppel in der Mitte des Brunnens. Achten Sie darauf, dass sich die Gelmatrix nicht an den Seiten des Brunnens ausbreitet. Eine detaillierte Beschreibung der Erstarrung und Beschichtung finden Sie im Abschnitt Diskussion.</li>
	<li>Lassen Sie die Gelmatrix für 10-20 min in einem Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 vollständig aushärten.</li>
	<li>Bereiten Sie die endgültige Arbeitslösung von L-WRN-Medien vor.<ol><li>100 μL Pennicilin/Streptomycin zu einem 10 ml Aliquot von L-WRN-Medien (siehe Schritt 2.1.3) (stabil für 2 Wochen bei 4 °C).</li>
		<li>Fügen Sie Ergänzungen zu 900 μL L-WRN-Medien mit Pennicilin / Streptomycin hinzu: 0,9 μL 1 mg / ml EGF + 0,9 μL 10 mM Y-27632-Dihydrochlorid. HINWEIS: Die Volumina basieren auf neun Bohrungen. Y-27632-Dihydrochlorid wird erst am Tag 0 (zum Zeitpunkt der Beschichtung) hinzugefügt.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie 100 μL Medien in jede Vertiefung hinzu. Achten Sie darauf, die Kuppel nicht zu stören.</li>
	<li>Bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h inkubieren.</li>
</ol>4. Claudin-7-Knockout in der Kultur schaffen
<ol><li>Lassen Sie die Krypten nach dem Plattieren 24 h lang normal in Kultur wachsen.</li>
	<li>In einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 2,7 μL 1 mmol/L 4-Hydroxytamoxifen (4OH-Tamoxifen) zu 900 μL L-WRN-Medien (Endkonzentration von 3 μmol/L) + 0,9 μL 1 mg/ml EGF gegeben. HINWEIS: Die Stammlösung von 4OH-Tamoxifen wird hergestellt, indem pulverisiertes 4OH-Tamoxifen (siehe Materialtabelle) mit 1x PBS auf eine Konzentration von 1 mmol/L gemischt wird.</li>
	<li>Entfernen Sie alte Medien aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL 4OH-Tamoxifen-haltige Medien in jede Vertiefung und kennzeichnen Sie sie als Claudin-7 cKO / 4OH-TAM. HINWEIS: DMSO muss den Kontrollmulden hinzugefügt werden. Frische 4OH-Tamoxifen-haltige Medien müssen alle 2 Tage hinzugefügt werden.</li>
	<li>Bei 37 °C bis zum nächsten Medienwechsel (~2-3 Tage) inkubieren.</li>
</ol>5. Dickdarm-Organoid-Erhaltung
HINWEIS: Medien müssen alle 2-3 Tage gewechselt werden. Kultur bis zu 12 Tage.
<ol><li>Bereiten Sie eine frische endgültige Arbeitslösung von L-WRN-Medien vor: 900 μL L-L-WRN-Medien + 0,9 μL 1 mg/ml EGF.</li>
	<li>Entfernen Sie alte Medien aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung. Fügen Sie den Brunnen frische Medien hinzu. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Kuppel nicht zu stören.</li>
	<li>Bei 37 °C bis zum nächsten Medienwechsel inkubieren. HINWEIS: Kulturen können für die für das Experiment gewünschte Dauer gepflegt und durchlaufen werden. Die Kulturen für die vorliegende Studie wurden typischerweise zwischen 9-12 Tagen aufbewahrt, aber man möchte vielleicht 15 oder 20 Tage weitermachen.</li>
</ol>6. Ernte und Einbettung von Kolonorganoiden
<ol><li>Entfernen Sie alte Medien aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung.</li>
	<li>Fixieren Sie die Organoide mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: PFA ist ein giftiges Material. Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, wenn Sie dieses Reagenz verwenden.</li>
	<li>Entfernen Sie 4% PFA aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung und fügen Sie 30% Saccharose für 24 h bei 4 °C hinzu.</li>
	<li>Beschriften Sie eine Kunststoffform und füllen Sie sie zu 90% mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Entfernen Sie 30% Saccharose aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung. Fügen Sie 10 μL 1x PBS in jede Vertiefung hinzu.</li>
	<li>Kratzen Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig am Boden des Brunnens, um die Kuppel mit Organoiden zu dissoziieren.</li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Pipette das PBS, das die dissoziierten Organoide enthält, und laden Sie die Flüssigkeit in die Form, die OCT enthält. HINWEIS: Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen in die OCT-Verbindung.</li>
	<li>Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis alle Organoide aus allen Vertiefungen entfernt wurden.</li>
	<li>In einem Dewarkolben aus Edelstahl Trockeneispellets und 2-Methylbutan (genug, um die Trockeneispellets zu bedecken) hinzufügen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Halten Sie den organoidhaltigen OCT-Block stetig über 2-Methylbutan, um ihn einzufrieren.</li>
	<li>Lagern Sie den organoidhaltigen OCT-Block bei -80 °C, bis er zerlegefertig ist (bis zu 1 Jahr lagerfähig).</li>
</ol>7. Immunfluoreszenz
<ol><li>Schneiden Sie den organoidhaltigen OCT-Block in einer Dicke von 5 μm mit einem Kryostaten (siehe Materialtabelle) bei -20 °C.</li>
	<li>Überprüfen Sie für jeden Abschnitt unter dem Mikroskop, ob ein Organoid erfasst wurde. Wenn das Schneiden abgeschlossen ist, lagern Sie die Dias bei -80 °C, bis sie fleckenbereit sind (kann bis zu 6 Monate gelagert werden).</li>
	<li>Die Objektträger in 10 mM Natriumcitratpuffer 10 min bei 94 °C erhitzen. HINWEIS: Der Puffer wird durch Auflösen von Natriumcitrat in entionisiertem Wasser hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert mit Salzsäure auf 6 ein.</li>
	<li>Lassen Sie die Dias 20 min auf dem Tischgerät abkühlen. Mit destilliertem Wasser 5 min abspülen.</li>
	<li>Die Objektträger in einem Färbegestell (siehe Materialtabelle) mit 0,2% Triton X-100 zusammensetzen und mit 100 mM Glycin 15 min inkubieren.</li>
	<li>Dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 min abspülen. Block mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) für 45 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit Claudin-7 Anti-murinem Kaninchen-Primärantikörper22 (verdünnt in 1% BSA) über Nacht bei 4 °C inkubieren. Spülen Sie dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit Cy3 Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper23 (verdünnt in 1% BSA) für 1 h bei Raumtemperatur. Spülen Sie dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min.</li>
	<li>Montieren Sie die Dias mit einem geeigneten Montagemedium (siehe Materialtabelle) mit DAPI und fügen Sie ein Deckglas hinzu.</li>
</ol>8. Zelltod-Erkennung
<ol><li>Fixieren Sie die Organoide in den Vertiefungen mit 4% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur. Mit 1x PBS 5 min abspülen.</li>
	<li>Die Kulturplatte auf Eis mit 0,1% Triton X-100 in kaltem 0,1% Natriumcitratpuffer für 2 min inkubieren. Zweimal mit 1x PBS für jeweils 5 min spülen.</li>
	<li>Vorbereitung der TUNEL-Reaktion24,25 unter Verwendung von TMR Red, einem In-situ-Kitzum Nachweis des Zelltods (siehe Materialtabelle). Geben Sie 50 μL TUNEL-Reaktionsreagenzien in jede Vertiefung.</li>
	<li>In befeuchteter Atmosphäre 1 h bei 37 °C im Dunkeln inkubieren. HINWEIS: Alle verbleibenden Schritte müssen im Dunkeln ausgeführt werden.</li>
	<li>Dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 min abspülen. Inkubieren mit 1:2.500 Hoechst (verdünnt in 1x PBS, siehe Materialtabelle) für 3 min.</li>
	<li>Dreimal mit 1x PBS für jeweils 5 min abspülen. Verwenden Sie den TRITC-Filter, um Bilder auf einem Fluoreszenzmikroskop zu visualisieren (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids%3A+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li>
<li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+development+and+application+of+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257(2021).</li>
<li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334(2020).</li>
<li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li>
<li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+3D+cell+culture+models%3A+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li>
<li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intesitnal+enteroids%2Forganoids%3A+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li>
<li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li>
<li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li>
<li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudins+in+intestines%3A+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978(2013).</li>
<li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy%3A+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li>
<li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+%28MET%29+to+inhibit+colon+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120(2015).</li>
<li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383(2013).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611(2013).</li>
<li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li>
<li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038(2013).</li>
<li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice%3A+relationship+with+thiol+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188(2017).</li>
<li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+organoids%3A+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Organoidkultur ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Stammzellfunktion, der Darmphysiologie, der Arzneimittelforschung, der menschlichen Darmerkrankungen sowie der Regeneration und Reparatur von Geweben 7,8,9,10,11,26. Obwohl es viele Vorteile hat, kann es schwierig sein, es zu etablieren. Vorsicht ist bei al...

Die intestinale Organoidkultur ist ein dreidimensionales (3D) ex vivo System, in dem Stammzellen aus den Darmkrypten des Primärgewebes isoliert und zu einer Gelmatrix 1,2 plattiert werden. Diese Stammzellen sind zur Selbsterneuerung, Selbstorganisation und Organfunktionalität fähig2. Organoide ahmen die Mikroumgebung des Gewebes nach und sind In-vivo-Modellen ähnlicher als zweidimensionale (2D) In-vitro-Zellkulturmodelle, obwohl sie weniger manipulierbar sind als Zellen 3,4. Dieses Modell beseitigt Hindernisse, die in 2D-Modellen auftreten, wie z. B. das Fehlen geeigneter Zell-Zell-Adhäsionen, Zell-Matrix-Interaktionen und homogener Populationen, und reduziert auch die Einschränkungen von Tiermodellen, einschließlich hoher Kosten und langer Zeiträume5. Darmorganoide - auch als Kolonoide für diejenigen bezeichnet, die aus Stammzellen der Kolonkrypta gezüchtet werden - sind im Wesentlichen Miniorgane, die ein Epithel enthalten, das alle Zelltypen enthält, die in vivo vorhanden wären, sowie ein Lumen. Dieses Modell ermöglicht die Manipulation des Systems, um viele Aspekte des Darms zu untersuchen, wie die Stammzellnische, Darmphysiologie, Pathophysiologie und Darmmorphogenese 3,5,6. Es bietet auch ein großartiges Modell für die Arzneimittelforschung, die Untersuchung menschlicher Darmerkrankungen wie entzündliche Darmerkrankungen (IBD) und Darmkrebs, patientenspezifische personalisierte Behandlungsentwicklung und die Untersuchung der Geweberegeneration 4,7,8,9. Darüber hinaus kann das Organoidsystem auch verwendet werden, um zelluläre Kommunikation, Arzneimittelmetabolismus, Lebensfähigkeit, Proliferation und Reaktion auf Reizezu untersuchen 7,8. Während Tiermodelle verwendet werden können, um potenzielle Therapeutika für intestinale pathologische Erkrankungen zu testen, sind sie ziemlich begrenzt, da die Untersuchung mehrerer Medikamente gleichzeitig eine Herausforderung darstellt. Es gibt mehr Störvariablen in vivo, und die damit verbundenen Kosten und Zeit sind hoch bzw. lang. Auf der anderen Seite ermöglicht das Organoidkultursystem das Screening vieler Therapeutika auf einmal in kürzerer Zeit und ermöglicht auch eine personalisierte Behandlung durch die Verwendung von patientenabgeleitetenOrganoidkulturen 4,8. Die Fähigkeit von Kolonorganoiden, Gewebeorganisation, Mikroumgebung und Funktionalität nachzuahmen, macht sie auch zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung von Regeneration und Gewebereparatur9. Unser Labor hat ein Dünndarm-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Wirkung von Claudin-7 auf die Funktionen von Dünndarmstammzellen zu untersuchen10. In dieser Studie wird ein Dickdarm-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Fähigkeit oder mangelnde Fähigkeit von Stammzellen zu untersuchen, sich selbst zu erneuern, zu differenzieren und sich in einem bedingten Claudin-7-Knockout-Modell (cKO) zu vermehren.
Claudin-7 ist ein sehr wichtiges Tight Junction (TJ)-Protein, das im Darm stark exprimiert wird und für die Aufrechterhaltung der TJ-Funktion und -Integrität unerlässlich ist11. cKO-Mäuse leiden an einem IBD-ähnlichen Phänotyp, der schwere Entzündungen, Ulzerationen, Epithelzellablagerungen, Adenome und erhöhte Zytokinspiegel aufweist11,12. Während allgemein anerkannt ist, dass Claudine für die epitheliale Barrierefunktion von entscheidender Bedeutung sind, entstehen neue Rollen für Clavine. Sie sind an Proliferation, Migration, Krebsprogression und Stammzellfunktion beteiligt 10,12,13,14,15,16,17. Derzeit ist nicht bekannt, wie sich Claudin-7 auf die Stammzellnische und die Funktion von Kolonstammzellen auswirkt. Da sich der Darm etwa alle 5-7 Tage schnell selbst erneuert, ist die Aufrechterhaltung der Stammzellnische und das ordnungsgemäße Funktionieren der aktiven Stammzellen von entscheidender Bedeutung18. Hier wird ein System etabliert, um die möglichen regulatorischen Effekte von Claudin-7 auf die Dickdarmstammzellnische zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>0,09 Kubikfuß platzsparender Vakuum-Exsikkator&nbsp;</td><td>United States Plastic Corp</td><td>78564</td><td>Anästhesiekammer</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr>, <tr><td>2-Methylbutan</td><td>Sigma</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>ThermoFisher</td><td>J61899. </td><td></td>AK</tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td><td>Sigma</td><td>579002</td><td></td></tr><tr><td>konische Zentrifugenröhrchen 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro; m Nylon-Zellsieb</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Kulturplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Ergänzung (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-7 Anti-Maus-Kaninchen-Antikörper</td><td>Immuno-Biological Laboratories&nbsp;</td><td>18875</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas (24 x 50-1,5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Kryoformen</td><td>vwr</td><td>25608-916</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RCF BME, Typ 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>Gelmatrix</td></tr><tr><td>Cy3 Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dewarflasche</td><td>Thomas Scientific</td><td>1173F61</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose mit L-Glutamin</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FLoid Imaging System</td><td>ThermoFisher</td><td>4477136</td><td></td></tr><tr><td>Fluor-Gel II mit DAPI</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985-50</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>JT Baker</td><td>4059-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M) Pufferlösung</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>In-situ-Kit zur Erkennung des Zelltods, TMR Red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Pivetal</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Medien</td><td>Harvard Medical School Gastrointestinale Organoid-Ableitung und Kulturkern</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Chirurgie-Kit</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Maus EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Optimale Schnitttemperatur (OCT) Mischung&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sequenza Rack</td><td>vwr</td><td>10129-584</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-279</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfilter (0,22 &Mikro; m; </td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihydrochlorid</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

dreidimensionale kultur von murinen kolonkrypten zur untersuchung der funktion von intestinalen stammzellen ex vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

Das Darmepithel regeneriert sich alle 5-7 Tage und wird von der intestinalen Epithelstammzellpopulation (IESC) am Boden der Kryptenregion gesteuert. IESCs umfassen aktive Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Epithelzelltypen differenzieren, und ruhende Stammzellen, die im Falle einer Verletzung als Reservestammzellen dienen. Die Regeneration des Darmepithels wird durch die sich selbst erneuernden und differenzierenden Fähigkeiten dieser aktiven IESCs gesteuert. Darüber hinaus sind das Gleichgewicht der kryptalen Stammzellpopulation und der Erhalt der Stammzellnische essentiell für die Darmregeneration. Die Organoidkultur ist ein wichtiger und attraktiver Ansatz zur Untersuchung von Proteinen, Signalmolekülen und Umwelthinweisen, die das Überleben und die Funktionen von Stammzellen regulieren. Dieses Modell ist kostengünstiger, weniger zeitaufwendig und manipulierbarer als Tiermodelle. Organoide ahmen auch die Mikroumgebung des Gewebes nach und sorgen für In-vivo-Relevanz . Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung von Kolonkrypten, die Einbettung dieser isolierten Kryptzellen in ein dreidimensionales Gelmatrixsystem und die Kultivierung von Kryptenzellen zur Bildung von Kolonorganoiden, die zur Selbstorganisation, Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind. Dieses Modell ermöglicht es, die Umwelt zu manipulieren - bestimmte Proteine wie Claudin-7 auszuschalten, Signalwege zu aktivieren / deaktivieren usw. - um zu untersuchen, wie diese Effekte die Funktion von Kolonstammzellen beeinflussen. Insbesondere wurde die Rolle des Tight-Junction-Proteins Claudin-7 bei der Funktion von Kolonstammzellen untersucht. Claudin-7 ist wichtig für die Aufrechterhaltung der intestinalen Homöostase und Barrierefunktion und -integrität. Knockout von Claudin-7 bei Mäusen induziert einen entzündlichen Darmerkrankungs-ähnlichen Phänotyp, der Darmentzündungen, Epithelhyperplasie, Gewichtsverlust, Schleimhautgeschwüre, Epithelzellablösung und Adenome aufweist. Zuvor wurde berichtet, dass Claudin-7 für intestinale epitheliale Stammzellfunktionen im Dünndarm benötigt wird. In diesem Protokoll wird ein Kolon-Organoid-Kultursystem etabliert, um die Rolle von Claudin-7 im Dickdarm zu untersuchen.

Um die regulatorischen Wirkungen von Claudin-7 auf Dickdarmstammzellen zu untersuchen, wurden Kolonkrypten aus murinem Dickdarmgewebe isoliert, wie oben beschrieben und in Abbildung 1A gezeigt. Sobald die Krypten aus dem primären Gewebe isoliert waren, wurden sie in einer 3D-Matrix in einer 96-Well-Platte plattiert, um 11 Tage lang zu wachsen (Abbildung 1). Normale gesunde Krypten schließen das Lumen und werden am 2. Tag zu Sphäroiden und beginnen schließlich et...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung eines murinen Kolonorganoidsystems zur Untersuchung der Aktivität und Funktion von Kolonstammzellen in einem Claudin-7-Knockout-Modell.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der Funktion von Dickdarmstammzellen in einer manipulierbaren Umgebung mit geringeren Zeitkosten als Tiermodelle. Die Organoidkultur ermöglicht die Untersuchung der Stammzellfunktion in einer immunfreien Umgebung. Dies ermöglicht es, die Auswirkungen einer bestimmten Ursache zu lokalisieren, wie z.B. den Knockout von Claudin-7.Das Verständnis der Mechanismen der Stammzellfunktion könnte Aufschluss über neue therapeutische Ziele für schwächende Krankheiten wie entzündliche Darmerkrankungen und Darmkrebs geben. Um die Isolierung von Kolonkrypten von der eingeschläferten Maus zu beginnen, machen Sie einen Einschnitt von etwa zwei Zoll entlang der Mittellinie der Maus. Dann stecken Sie die Haut zurück, um den Bauch freizulegen.Schneiden Sie den Dickdarm direkt unter dem Kokalum von der proximalen Seite und oberhalb des Rektums von der distalen Seite, um den Dickdarm zu isolieren. Als nächstes entfernen Sie das Fettgewebe, das am Dickdarm befestigt ist, mit einer Pinzette. Nachdem Sie den Kot mit dem flachen Ende der Pinzette aus dem isolierten Dickdarm herausgedrückt haben, schneiden Sie das Gewebe längs auf.Waschen Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit kaltem PBS, indem Sie das Gewebe zwischen den Wäschen mit einer Pinzette in PBS herumwirbeln. Dann schneiden Sie das Gewebe mit einer sauberen, scharfen Schere in kleine Stücke von etwa drei bis fünf Millimetern. Nachdem Sie den Dickdarm von einer anderen euthanasierten Maus isoliert haben, kombinieren Sie alle Gewebestücke in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kalten epithelialen Dissoziationsmedien und inkubieren Sie die Dickdarmgewebestücke in epithelialen Dissoziationsmedien für 90 Minuten bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln.Lassen Sie die Gewebefragmente nach der Inkubation auf den Boden des Röhrchens sinken. Nach dem Absetzen verwerfen Sie das epitheliale Dissoziationsmedium, ohne die Gewebefragmente zu stören. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit kaltem PBS waschen.Entsorgen Sie so viel PBS wie möglich während der letzten Wäsche. Als nächstes fügen Sie kalte Krypta-Dissoziationsmedien zu den gewaschenen Darmgewebestücken in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und schütteln Sie es fünf bis 10 Minuten von Hand. Unter der Zellkulturhaube filtern Sie die Medien mit dem Gewebe mit einem 70-Mikron-Nylonzellsieb in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Nach der Filtration zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Entsorgung des Überstandes, ohne die pelletierten Krypten zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in drei bis vier Milliliter kaltem PBS. Pipette 10 Mikroliter der Kryptasuspension in einer Linie auf einem Objektträger.Zählen Sie mit dem Mikroskop die Anzahl der vollen, langen Krypten, um die Kryptenkonzentration zu schätzen, und berechnen Sie das geeignete Volumen an Krypten, die erforderlich sind, um 10 Krypten pro Mikroliter in einer 96-Well-Platte zu beschichten. Zentrifugieren Sie ein geeignetes Volumen isolierter Krypten in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, ohne die pelletierten Krypten zu stören.Fügen Sie dann 100 Mikroliter Gelmatrix zu den pelletierten Krypten hinzu, ohne Luftblasen einzuführen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis die Gelmatrix teilweise verfestigt ist. Dann werden 10 Mikroliter der Gelmatrix mit den Krypten in jeder Vertiefung einer vorgewärmten 96-Well-Kulturplatte vermischt, um eine Kuppelform zu bilden.Lassen Sie 10 bis 20 Minuten, bis die Gelmatrix vollständig eingestellt ist, indem Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid in einen Inkubator stellen. Schließlich werden 100 Mikroliter der frisch zubereiteten Arbeitslösung aus mit Antibiotika angereicherten L-WRN-Medien in jede Vertiefung gegeben und die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubiert. Um die Organoide zu ernten, entfernen Sie alte Medien aus den Vertiefungen durch Vakuumsaugen und fixieren Sie die Organoide mit 4% Paraformaldehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur.Dann 4% Paraformaldehyd aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugen entfernen und die Organoide mit 100 Mikrolitern 30% Saccharose pro Vertiefung bei vier Grad Celsius behandeln. Entfernen Sie nach 24 Stunden 30% Saccharose aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung, bevor Sie 10 Mikroliter PBS in jede Vertiefung geben. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Boden der Vertiefung vorsichtig zu zerkratzen, um die kuppelhaltigen Organoide zu dissoziieren.Als nächstes entfernen Sie das PBS, das die dissoziierten Organoide enthält, mit einer Pipette aus der Vertiefung und geben Sie es in eine beschriftete Kunststoffform, die zu 90% mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung gefüllt ist. Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Organoide aus allen Vertiefungen entfernt wurden. Fügen Sie 2-Methylbutan zu einem Dewar-Kolben aus Edelstahl hinzu, der Trockeneispellets enthält, genug, um die Pellets zu bedecken.Schockgefrieren des Organoids, das OCT-Block enthält, indem Sie es stetig über dem 2-Methylbutan halten. Zum Schluss lagern Sie den organoidhaltigen OCT-Block bei minus 80 Grad Celsius, bis er zum Schneiden bereit ist. Das repräsentative Bild unterstreicht das erfolgreiche Wachstum von Kolonoiden aus normalen Krypten, die Claudin-7 enthalten.Die Krypten, die Claudin-7 enthielten, begannen am zweiten Tag Sphäroide zu bilden, begannen am fünften Tag zu knospen und wuchsen und knospten weiter, bis sie am neunten Tag geerntet wurden. Im Gegensatz dazu konnten Krypten ohne Claudin-7 keine richtigen Kolonoide bilden. Nach einer zwei- bis dreitägigen Behandlung mit 4-Hydroxytamoxifen erschienen die Claudin-7-Knockout-Krypten als kreisförmige Zellklumpen.Im Gegensatz zur Kontrolle wuchsen die Krypten nicht zu gesunden Sphäroiden heran. Immunfluoreszenzfärbung für Claudin-7 in der geernteten Kontrolle und die bedingten Knockout-Organoide bestätigten den erfolgreichen Knockout von Claudin-7 in Kultur. Die Kontrollkolonoide zeigten am neunten Tag sehr wenig apoptotische Signale.Claudin-7-Knockout-Kolonoide zeigten jedoch gleichzeitig eine hohe Apoptose. Stellen Sie vor der Beschichtung eine partielle Erstarrung sicher. Die Beschichtung vor der teilweisen Erstarrung führt dazu, dass sich die Gelmatrix ausbreitet und die Kuppel nicht gebildet wird, was das Überleben und das Wachstum der Krypten beeinträchtigt.Dieses Protokoll kann für die Arzneimittelforschung, die Untersuchung der zellulären Kommunikation, des Arzneimittelmetabolismus, der Lebensfähigkeit, der Proliferation und der Entwicklung einer patientenspezifischen personalisierten Behandlung verwendet werden. Die Etablierung der Organoidkultur hat das Studium von Krankheiten und die personalisierte Medizin revolutioniert.

three-dimensional-culture-murine-colonic-crypts-to-study-intestinal

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik, um ganze Krypten aus dem Dünndarm einer Maus zu isolieren. Die isolierten ganzen Krypten können zur Vermehrung langlebiger und sich selbst erneuernder 3D-Organoide in vitro verwendet werden.

Isolierung von Darmkrypten: Eine Methode zur Isolierung ganzer Krypten aus dem Dünndarm des Mausmodells

Verbesserte Bildgebungstechnologie ermöglicht die dreidimensionale Bildgebung von Organen während der Entwicklung. Hier beschreiben wir ein ganzes Organkultursystem, das eine Live-Bildgebung der sich entwickelnden Zotten im fötalen Mausdarm ermöglicht.

Maus Fetal ganze Darm-System für Kultur Ex-vivo- Manipulation von Signalwegen und dreidimensionale Live-Imaging von Zotte Entwicklung

Wir beschreiben eine Methode zur Etablierung menschlicher Enteroide aus Dünndarmkrypten und Kolonoide aus Dickdarmkrypten, die sowohl aus chirurgischem Gewebe als auch aus Biopsien entnommen wurden. In diesem methodischen Artikel stellen wir die Kulturmodalitäten vor, die für das erfolgreiche Wachstum und die Erhaltung von humanen Enteroiden und Kolonoiden unerlässlich sind.

Gründung des Menschen Epithelial Enteroids und Colonoids von Whole Gewebe und Biopsie

Darmepithel-Stammzellen (ISCs) mit Paneth-Zellen vermischt. Diese Zellen sind differenziert Nachkommen des ISC, die den ISCs unterstützen und antibakteriellen Schutz. Hier zeigen wir, wie wir verwendet transgene bedingte Mausmodellen, um festzustellen, dass Paneth-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Darmepithelien zu spielen.

Protokolle für die Analyse der Rolle der Paneth-Zellen bei der Regeneration des Murine Darm mit Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mausmodelle

Wir beschreiben Schritt-für-Schritt-Anleitungen zu: 1) effiziente Technische Darmorganoide mit magnetischen Nanopartikeln für lenti- oder retrovirale Transduktion, und, 2) erzeugen gefrorene Abschnitte aus technischen Organoiden. Dieser Ansatz bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Genexpression in Organoiden effizient zu verändern, um nachgelagerte Effekte zu untersuchen.

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Das Verfahren beschreibt die Isolierung der Zotten aus dem Darmepithel der Maus, die einer Dedifferenzierung unterzogen werden, um ihr organoidbildendes Potenzial zu bestimmen.

3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie man murine primäre epitheliale Dickdarmmonoschichten direkt aus Darmkrypten erzeugt. Wir bieten experimentelle Ansätze zur Erzeugung konfluenter Monoschichten auf permeablen Filtern, konfluente Monoschichten für die Kratzwundeheilung und biochemische Studien sowie spärliche und konfluente Monoschichten für die Immunfluoreszenzanalyse.

Erzeugung von murinen primären Dickdarmepithel-Monoschichten aus Darmkrypten

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Isolierung von murinen Kolonkrypten für die Entwicklung von 3-dimensionalen Kolonoiden beschreibt. Die etablierten Kolonoide können dann terminalisiert werden, um die zelluläre Zusammensetzung des Wirtsepithels widerzuspiegeln, bevor sie eine entzündliche Herausforderung erhalten oder angewiesen werden, eine epitheliale Monoschicht zu bilden.

Untersuchung der epithelialen Effekte von intestinalen Entzündungen in vitro auf etablierte murine Kolonoide

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung von murinen Dünndarmkrypten und kultivieren intestinale 3D-Organoide aus den Krypten. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Generierung von Organoiden aus einer einzelnen intestinalen Stammzelle in Abwesenheit einer subepithelialen zellulären Nische.

Die 3D-Kultivierung von Organoiden aus murinen Darmkrypten und einer einzelnen Stammzelle für die Organoidforschung

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

Erfahren Sie die dreidimensionale Kultur muriner Kolonkrypten zur Untersuchung intestinaler Stammzellen ex vivo. Diese Methode ermöglicht die Analyse genetischer Modifikationen wie Claudin-7-Knockout.

Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Weitere Videos entdecken