Dreidimensionale Kultur von murinen Kolonkrypten zur Untersuchung der Funktion von intestinalen Stammzellen ex vivo

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Untersuchung der Funktion von Dickdarmstammzellen in einer manipulierbaren Umgebung mit geringeren Zeitkosten als Tiermodelle. Die Organoidkultur ermöglicht die Untersuchung der Stammzellfunktion in einer immunfreien Umgebung. Dies ermöglicht es, die Auswirkungen einer bestimmten Ursache zu lokalisieren, wie z.B. den Knockout von Claudin-7.

Das Verständnis der Mechanismen der Stammzellfunktion könnte Aufschluss über neue therapeutische Ziele für schwächende Krankheiten wie entzündliche Darmerkrankungen und Darmkrebs geben. Um die Isolierung von Kolonkrypten von der eingeschläferten Maus zu beginnen, machen Sie einen Einschnitt von etwa zwei Zoll entlang der Mittellinie der Maus. Dann stecken Sie die Haut zurück, um den Bauch freizulegen.

Schneiden Sie den Dickdarm direkt unter dem Kokalum von der proximalen Seite und oberhalb des Rektums von der distalen Seite, um den Dickdarm zu isolieren. Als nächstes entfernen Sie das Fettgewebe, das am Dickdarm befestigt ist, mit einer Pinzette. Nachdem Sie den Kot mit dem flachen Ende der Pinzette aus dem isolierten Dickdarm herausgedrückt haben, schneiden Sie das Gewebe längs auf.

Waschen Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit kaltem PBS, indem Sie das Gewebe zwischen den Wäschen mit einer Pinzette in PBS herumwirbeln. Dann schneiden Sie das Gewebe mit einer sauberen, scharfen Schere in kleine Stücke von etwa drei bis fünf Millimetern. Nachdem Sie den Dickdarm von einer anderen euthanasierten Maus isoliert haben, kombinieren Sie alle Gewebestücke in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit kalten epithelialen Dissoziationsmedien und inkubieren Sie die Dickdarmgewebestücke in epithelialen Dissoziationsmedien für 90 Minuten bei vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln.

Lassen Sie die Gewebefragmente nach der Inkubation auf den Boden des Röhrchens sinken. Nach dem Absetzen verwerfen Sie das epitheliale Dissoziationsmedium, ohne die Gewebefragmente zu stören. Wiederholen Sie den Vorgang, wenn Sie das Gewebe 10 bis 15 Mal mit kaltem PBS waschen.

Entsorgen Sie so viel PBS wie möglich während der letzten Wäsche. Als nächstes fügen Sie kalte Krypta-Dissoziationsmedien zu den gewaschenen Darmgewebestücken in einem 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und schütteln Sie es fünf bis 10 Minuten von Hand. Unter der Zellkulturhaube filtern Sie die Medien mit dem Gewebe mit einem 70-Mikron-Nylonzellsieb in ein frisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Nach der Filtration zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von der Entsorgung des Überstandes, ohne die pelletierten Krypten zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in drei bis vier Milliliter kaltem PBS. Pipette 10 Mikroliter der Kryptasuspension in einer Linie auf einem Objektträger.

Zählen Sie mit dem Mikroskop die Anzahl der vollen, langen Krypten, um die Kryptenkonzentration zu schätzen, und berechnen Sie das geeignete Volumen an Krypten, die erforderlich sind, um 10 Krypten pro Mikroliter in einer 96-Well-Platte zu beschichten. Zentrifugieren Sie ein geeignetes Volumen isolierter Krypten in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann den Überstand mit einer 1.000-Mikroliter-Pipette, ohne die pelletierten Krypten zu stören.

Fügen Sie dann 100 Mikroliter Gelmatrix zu den pelletierten Krypten hinzu, ohne Luftblasen einzuführen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis die Gelmatrix teilweise verfestigt ist. Dann werden 10 Mikroliter der Gelmatrix mit den Krypten in jeder Vertiefung einer vorgewärmten 96-Well-Kulturplatte vermischt, um eine Kuppelform zu bilden.

Lassen Sie 10 bis 20 Minuten, bis die Gelmatrix vollständig eingestellt ist, indem Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid in einen Inkubator stellen. Schließlich werden 100 Mikroliter der frisch zubereiteten Arbeitslösung aus mit Antibiotika angereicherten L-WRN-Medien in jede Vertiefung gegeben und die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubiert. Um die Organoide zu ernten, entfernen Sie alte Medien aus den Vertiefungen durch Vakuumsaugen und fixieren Sie die Organoide mit 4% Paraformaldehyd für eine Stunde bei Raumtemperatur.

Dann 4% Paraformaldehyd aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugen entfernen und die Organoide mit 100 Mikrolitern 30% Saccharose pro Vertiefung bei vier Grad Celsius behandeln. Entfernen Sie nach 24 Stunden 30% Saccharose aus den Vertiefungen durch Vakuumabsaugung, bevor Sie 10 Mikroliter PBS in jede Vertiefung geben. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Boden der Vertiefung vorsichtig zu zerkratzen, um die kuppelhaltigen Organoide zu dissoziieren.

Als nächstes entfernen Sie das PBS, das die dissoziierten Organoide enthält, mit einer Pipette aus der Vertiefung und geben Sie es in eine beschriftete Kunststoffform, die zu 90% mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung gefüllt ist. Setzen Sie den Vorgang fort, bis alle Organoide aus allen Vertiefungen entfernt wurden. Fügen Sie 2-Methylbutan zu einem Dewar-Kolben aus Edelstahl hinzu, der Trockeneispellets enthält, genug, um die Pellets zu bedecken.

Schockgefrieren des Organoids, das OCT-Block enthält, indem Sie es stetig über dem 2-Methylbutan halten. Zum Schluss lagern Sie den organoidhaltigen OCT-Block bei minus 80 Grad Celsius, bis er zum Schneiden bereit ist. Das repräsentative Bild unterstreicht das erfolgreiche Wachstum von Kolonoiden aus normalen Krypten, die Claudin-7 enthalten.

Die Krypten, die Claudin-7 enthielten, begannen am zweiten Tag Sphäroide zu bilden, begannen am fünften Tag zu knospen und wuchsen und knospten weiter, bis sie am neunten Tag geerntet wurden. Im Gegensatz dazu konnten Krypten ohne Claudin-7 keine richtigen Kolonoide bilden. Nach einer zwei- bis dreitägigen Behandlung mit 4-Hydroxytamoxifen erschienen die Claudin-7-Knockout-Krypten als kreisförmige Zellklumpen.

Im Gegensatz zur Kontrolle wuchsen die Krypten nicht zu gesunden Sphäroiden heran. Immunfluoreszenzfärbung für Claudin-7 in der geernteten Kontrolle und die bedingten Knockout-Organoide bestätigten den erfolgreichen Knockout von Claudin-7 in Kultur. Die Kontrollkolonoide zeigten am neunten Tag sehr wenig apoptotische Signale.

Claudin-7-Knockout-Kolonoide zeigten jedoch gleichzeitig eine hohe Apoptose. Stellen Sie vor der Beschichtung eine partielle Erstarrung sicher. Die Beschichtung vor der teilweisen Erstarrung führt dazu, dass sich die Gelmatrix ausbreitet und die Kuppel nicht gebildet wird, was das Überleben und das Wachstum der Krypten beeinträchtigt.

Dieses Protokoll kann für die Arzneimittelforschung, die Untersuchung der zellulären Kommunikation, des Arzneimittelmetabolismus, der Lebensfähigkeit, der Proliferation und der Entwicklung einer patientenspezifischen personalisierten Behandlung verwendet werden. Die Etablierung der Organoidkultur hat das Studium von Krankheiten und die personalisierte Medizin revolutioniert.