Digitale Genschaltkreise auf Basis von CRISPR-Cas-Systemen und Anti-CRISPR-Proteinen

Unser Protokoll erklärt, wie digitale Schaltkreise von Hefegenen entworfen, aufgebaut und analysiert werden, die CRISPR-dCas-Systeme vom Typ zwei und fünf und die entsprechenden Anti-CRISPR-Proteine verwenden. Es ist ein Assemblierungsaufenthalt, weil es keine Standardverfahren zum Zusammenstellen und Testen synthetischer Transkriptionsnetzwerke in Diensten sammelt. Bereiten Sie zunächst ein Reaktionsgemisch vor, das 20 bis 40 Nanogramm DNA-Template, einen Mikroliter Forward-Primer, einen Mikroliter Reverse-Primer, fünf Mikroliter DNTP-Mix, 0,5 Mikroliter DNA-Polymerase, 10 Mikroliter 5x DNA-Polymerase-Reaktionspuffer und doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern enthält.

Amplifizieren Sie die DNA-Sequenzen mit dem Touchdown-PCR-Programm auf einem Thermocycler, wie im Manuskript beschrieben. Isolieren Sie die PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese und verdünnen Sie die DNA-Sequenzen aus dem Agarosegel mit einem DNA-Gel-Extraktionskit. Mit der Gibson-Assemblierungsmethode werden die gereinigten PCR-Produkte in den aufgeschnittenen Shuttle-Vektor eingeführt, indem die äquimolare DNA-Mischung eine Stunde lang bei 50 Grad Celsius eingelassen wird.

Konstruieren Sie den dCas12a-Akzeptorvektor mittels Touchdown-PCR und der Gibson-Assemblierungsmethode, wie zuvor gezeigt. Die Hefecodon optimierten dCas12a-Proteine werden durch Verdau mit BamH1 und Xhol1 und Ligation mit T4-DNA-Ligase in die beiden neu konstruierten Akzeptorvektoren eingefügt. In ähnlicher Weise werden die Plasmide auf der Grundlage des pRS2403-Shuttle-Vektors konstruiert, um die Anti-CRISPR-Proteine mittels Touchdown-PCR und der Gibson-Assemblierungsmethode zu exprimieren.

Um eine mikroskopische Zelldetektion durchzuführen, geben Sie zwei Mikroliter der Zelllösung auf einen Objektträger und decken Sie ihn mit einem Deckglas ab. Beobachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop, indem Sie die Fluoreszenzlichtquelle, das Mikroskop und den Computer einschalten. Nachdem Sie die Nummer der Leuchtstofflampe notiert haben, öffnen Sie die Mikroskopsoftware auf dem Computer.

Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und wählen Sie die 40-fache Objektivlinse, während Sie die Zellen unter grünem Licht beobachten. Bewegen Sie den Kursfokusknopf, bis die Kontur der Hefezellen erscheint, und den Feinfokusknopf, um die Zellen zu fokussieren. Um die Zellen zu erkennen, wechseln Sie nach dem Schließen des Mikroskop-Sichtfelds auf den Computerbildschirm und klicken Sie auf Live.

Warten Sie drei bis fünf Sekunden. Klicken Sie auf Aufnehmen, um ein Bild aufzunehmen und das Bild zu speichern. Schalten Sie als Nächstes den Computer, das Mikroskop und die Leuchtstoffröhre aus.

Schalten Sie die FACS-Maschine 20 Minuten vor den Messungen ein, um den Laser aufzuwärmen, und mischen Sie 20 Mikroliter der Zellkultur mit 300 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. Führen Sie die FACS-Software auf dem Computer aus, der mit dem FACS-Computer verbunden ist, und erstellen Sie ein neues Experiment. Stellen Sie dann die Messparameter ein.

Wählen Sie als Nächstes den Filter entsprechend den Anregungs- und Emissionswellenlängen der Proben aus und stellen Sie die Erfassungszellennummer auf 10.000 ein. Stellen Sie die FITC-Filterspannung ein, indem Sie die Intensität der fluoreszierenden Kügelchen messen, und stellen Sie sicher, dass der relative Unterschied in der Intensität der Kügelchen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Experimenten 5 % nicht überschreitetWaschen Sie die Maschine einige Sekunden lang mit doppelt destilliertem Wasser, um mögliche überschüssige Kügelchen zu entfernen. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der Probe und klicken Sie auf Vorschau, während Sie drei bis fünf Sekunden auf die Stabilität der Probeninjektion warten.

Klicken Sie abschließend auf Erwerben. Messen Sie die Perlen am Ende des Experiments erneut. Nachdem Sie überprüft haben, ob die relative Differenz zwischen den beiden Perlenmessungen mehr als 5 % beträgtExportieren Sie die FACS-Daten als FCS-Dateien.

Öffnen Sie R Studio, und laden Sie das Skript BDverse_analysis. R, um die FCS-Dateien zu analysieren. Legen Sie den Namen des Experiments als ename, den Verzeichnispfad, in dem die FCS-Dateien gespeichert sind, als dir_d fest, und die Ergebnisdateien werden als dir_r erstellt.

Stellen Sie als Nächstes den Fluoreszenzkanal ein. Legen Sie die Anzahl der Samples fest, die gemessen wurden. Die Dimensionen von Punktdiagrammen und die maximale Länge der x- und y-Achse für Balkendiagramme und Boxplots.

Wählen Sie die Benotungsmethode, indem Sie den Hashtag aus den entsprechenden Zeilen entfernen. Wählen Sie das flowSet-Objekt aus, das der gewählten Gating-Methode und der Punktplot-Auflösung entspricht, die mindestens gleich 256 sein sollte. Kommentieren Sie die beiden Filteranweisungen aus, um Messungen zu entfernen, bei denen die Fluoreszenz negativ ist, und um Ausreißer zu entfernen, die auf andere Experimente zurückzuführen sind, wie im Manuskript beschrieben.

Drücken Sie auf Quelle und führen Sie das Skript aus. Alle Dateien, die die Ergebnisse der Analyse enthalten, werden in dir_r erstellt. Die beste Aktivierungseffizienz von dSpCas9-VP64 wurde erreicht, wenn sechs lexOp-Zielstellen auf dem synthetischen Promotor vorhanden waren.

Während für dCas12a-VPR die höchste Aktivierungseffizienz erzielt wurde, wenn drei Kopien von lexOp in den synthetischen Promotor eingefügt wurden. Die Aktivierung durch CRISPR-RNA und Single-Guide-RNA auf einem integrativen Plasmid war 1,4 bis 2,4 und 1,1 bis 1,5-fach höher als bei der Platzierung auf einem episomalen Plasmid. Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass ein episomaler Vektor unabhängig vom Expressionssystem ein viel höheres Maß an Single Guide RNA CRISPR RNA produzierte als der integrative Vektor.

Die Aktivierungseffizienz des Komplexes dSpCas9 und der Gerüst-RNA, die MCP-VP64 rekrutiert, wurde getestet. Die Gerüst-RNA, die einen einzelnen Wildtyp und eine F6MS2-Haarnadel enthielt, ergab eine 5,27- bzw. 4,3-fache Aktivierung. Die Kombination der beiden Haarnadeln ergab jedoch eine 7,54-fache mit der höchsten Aktivierungseffizienz.

Vier verschiedene Promotoren wurden verwendet, um die Expression von drei Arten von Typ-Zwei-Anti-CRISPR zu steuern, was zeigte, dass sie dosisabhängig wirkten. Ein starker Promotor reduzierte das Fluoreszenzniveau auf 0,21, 0,11 bzw. 0,13 seines Wertes. Die Titrationskurve zeigt, dass sich die Schaltung wie ein Knotengang verhält, mit einem Ein-Aus-Verhältnis von fast 2,3.

Der Typ fünf Anti-CRISPR A reduziert die Fluoreszenzexpression sowohl von denAS-Cas12a als auch von dLB-Cas12a als Aktivatoren von 19% auf 71%Die Beziehung zwischen Aktivatoren und Repressoren wurde untersucht, wobei der Acr-VA-Aktivator große Schwankungen in seiner Leistung zeigte, wenn er von pGAL1 unter pTEF1 produziert wurde, und der genetische CYC1t-pCYC1noTata Typ fünf Anti-CRISPR-A1 zeigte nur eine gewisse Repression auf dem bloßen dLB Cas12a. Die FACS-Maschine ist zerbrechlich und muss daher vorsichtig behandelt werden. Die Zelllösung sollte nie zu dicht sein und die Maschine muss sauber gehalten werden.