Name: Automatisierung des Mikronukleus-Assays mittels bildgebender Durchflusszytometrie und künstlicher Intelligenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Erfahren Sie, wie bildgebende Durchflusszytometrie und künstliche Intelligenz den Mikronukleus-Assay automatisieren. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige DNA-Schadensanalysen für Toxizitätstests.

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<ol><li>Fenech, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HUMN+project+initiative+and+review+of+validation%2C+quality+control+and+prospects+for+further+development+of+automated+micronucleus+assays+using+image+cytometry+systems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hygiene+and+Environmental+Health%22%5BJournal%5D)">HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems.</a> International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).</li>
<li>OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals</a>. , OECD Publishing. Paris. (2016).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus technique.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).</li>
<li>Bonassi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increased+micronucleus+frequency+in+peripheral+blood+lymphocytes+predicts+the+risk+of+cancer+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans.</a> Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).</li>
<li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary+on+the+SFTG+international+collaborative+study+on+the+in+vitro+micronucleus+test%3A+To+Cyt-B+or+not+to+Cyt-B%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FFundamental+and+Molecular+Mechanisms+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B.</a> Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Seager, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations%2C+evaluation+and+validation+of+a+semi-automated%2C+fluorescent-based+scoring+protocol+for+micronucleus+testing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells.</a> Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).</li>
<li>Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+scoring+of+lymphocyte+micronuclei+by+the+MetaSystems+Metafer+image+cytometry+system+and+its+application+in+studies+of+human+mutagen+sensitivity+and+biodosimetry+of+genotoxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure.</a> Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).</li>
<li>Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+scored+by+flow+cytometry+provides+a+comprehensive+evaluation+of+cytogenetic+damage+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).</li>
<li>Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+scoring+by+flow+cytometry%3A+Differential+staining+of+micronuclei+versus+apoptotic+and+necrotic+chromatin+enhances+assay+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).</li>
<li>Basiji, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+Amnis+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of Amnis imaging flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+the+Imagestream%C2%AE+imaging+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer.</a> Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).</li>
<li>Verma, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+FlowSight%C2%AE+imaging+flow+cytometry+as+a+platform+to+assess+chemically+induced+micronuclei+using+human+lymphoblastoid+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro.</a> Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).</li>
<li>Wills, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-laboratory+automation+of+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).</li>
<li>Rodrigues, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+micronucleus+assay+using+imaging+flow+cytometry+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Npj+Systems+Biology+and+Applications%22%5BJournal%5D)">The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning.</a> Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20(2021).</li>
<li>Rodrigues, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+to+perform+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+multispectral+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59324(2019).</li>
<li>Lovell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+negative+historical+control+group+data+from+the+in+vitro+micronucleus+assay+using+TK6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%2FGenetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Hennig, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+solution+for+advanced+imaging+flow+cytometry+data+analysis+using+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning.</a> Methods. 112, 201-210 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren sind angestellt bei der Luminex Corporation, einem DiaSorin-Unternehmen, dem Hersteller des bildgebenden Durchflusszytometers ImageStream und der in dieser Arbeit verwendeten Software Amnis AI.

Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt den Einsatz von Deep-Learning-Algorithmen zur Automatisierung des Scorings des MN-Assays. Mehrere neuere Veröffentlichungen haben gezeigt, dass intuitive, interaktive Werkzeuge die Erstellung von Deep-Learning-Modellen zur Analyse von Bilddaten ermöglichen, ohne dass tiefgreifende Rechenkenntnisse erforderlich sind18,19. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll, das ein benutzeroberflächengesteuertes Softwarepaket verwen...

Der Mikronukleus-Assay (MN) ist in der genetischen Toxikologie von grundlegender Bedeutung, um DNA-Schäden bei der Entwicklung von Kosmetika, Pharmazeutika und Chemikalien für den menschlichen Gebrauch zu bewerten 1,2,3,4. Mikrokerne werden aus ganzen Chromosomen oder Chromosomenfragmenten gebildet, die sich nach der Teilung nicht in den Zellkern eingliedern und zu kleinen, kreisförmigen Körpern verdichten, die vom Zellkern getrennt sind. Somit kann MN als Endpunkt zur Quantifizierung von DNA-Schäden in Genotoxizitätstestsverwendet werden 1.
Die bevorzugte Methode zur Quantifizierung von MN ist in einmal geteilten zweikernigen Zellen (BNCs) durch Blockierung der Teilung mit Cytochalasin-B (Cyt-B). In dieser Version des Assays wird die Zytotoxizität auch durch das Scoring von einkernigen (MONO) und mehrkernigen (POLY) Zellen beurteilt. Der Assay kann auch durch Scoring von MN in nicht blockierten MONO-Zellen durchgeführt werden, was schneller und einfacher zu bewerten ist, wobei die Zytotoxizität anhand der Zellzählung vor und nach der Exposition bewertet wird, um die Proliferation zu beurteilen 5,6.
Die physikalische Bewertung des Assays wurde in der Vergangenheit durch manuelle Mikroskopie durchgeführt, da dies eine visuelle Bestätigung aller Schlüsselereignisse ermöglicht. Die manuelle Mikroskopie ist jedoch anspruchsvoll und subjektiv1. Daher wurden automatisierte Techniken entwickelt, darunter das Scannen von Objektträgern und die Durchflusszytometrie, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Während Objektträger-Scanning-Methoden die Visualisierung von Schlüsselereignissen ermöglichen, müssen Objektträger mit optimaler Zelldichte erstellt werden, was schwierig zu erreichen sein kann. Darüber hinaus fehlt dieser Technik oft die zytoplasmatische Visualisierung, was das Scoring von MONO- und POLY-Zellen beeinträchtigen kann 7,8. Während die Durchflusszytometrie eine Hochdurchsatz-Datenerfassung ermöglicht, müssen die Zellen lysiert werden, so dass die Verwendung der Cyt-B-Form des Assays nicht möglich ist. Darüber hinaus bietet die konventionelle Durchflusszytometrie als nicht-bildgebendes Verfahren keine visuelle Validierung von Schlüsselereignissen 9,10.
Daher wurde die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) untersucht, um den MN-Assay durchzuführen. Der ImageStreamX Mk II kombiniert die Geschwindigkeit und statistische Robustheit der konventionellen Durchflusszytometrie mit den hochauflösenden Bildgebungsmöglichkeiten der Mikroskopie in einem einzigen System11. Es hat sich gezeigt, dass durch den Einsatz von IFC hochauflösende Bilder aller Schlüsselereignisse erfasst und automatisch mit Hilfe von merkmalsbasierten12,13 oder Techniken der künstlichen Intelligenz (KI)14,15 bewertet werden können. Durch die Verwendung von IFC zur Durchführung des MN-Assays ist die automatische Bewertung von viel mehr Zellen im Vergleich zur Mikroskopie in kürzerer Zeit möglich.
Diese Arbeit weicht von einem zuvor beschriebenen Bildanalyse-Workflow16 ab und diskutiert alle Schritte, die erforderlich sind, um ein Random Forest (RF)- und/oder Convolutional Neural Network (CNN)-Modell unter Verwendung der Amnis AI-Software (im Folgenden als "KI-Software" bezeichnet) zu entwickeln und zu trainieren. Es werden alle notwendigen Schritte beschrieben, einschließlich der Befüllung von Ground-Truth-Daten mit KI-gestützten Tagging-Tools, der Interpretation der Ergebnisse des Modelltrainings und der Anwendung des Modells zur Klassifizierung zusätzlicher Daten, die die Berechnung der Genotoxizität und Zytotoxizität ermöglichen15.

<table><tbody><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Cleanser - Coulter Clenz&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Reiniger.&nbsp; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr><tr><td>Colchicine</td><td>MilliporeSigma</td><td>64-86-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning Vakuumfilter mit Flaschenaufsatz&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS430769</td><td>0,22 &Mikro; m Filter, 500 mL Flasche</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>MilliporeSigma</td><td>14930-96-2</td><td>5 mg Flasche</td></tr><tr><td>Debubbler - 70% Isopropanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Behälter mit 200 mL Debubbler füllen.&nbsp; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>MilliporeSigma</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1X</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++MG++ Kostenlos&nbsp;</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, 10%, methanolfrei, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>Dies wird für das 4%ige und 1%ige Formalin verwendet. ACHTUNG: Formalin/Formaldehyd giftig beim Einatmen und Verschlucken. Reizt die Augen, die Atemwege und die Haut. Kann durch Einatmen oder Hautkontakt eine Sensibilisierung verursachen. Gefahr schwerer Augenschäden&nbsp; Potentielle Krebsgefahr. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>Guava Muse Cell Analyzer</td><td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td>Es wurde ein Guava Muse Cell Analyzer in der Standardkonfiguration verwendet.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>10 mg/ml Lösung</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>MilliporeSigma</td><td>69-65-8</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäuren 100X</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen</td><td>100220</td><td>A 2 Kamera ImageStreamX Mark II ausgestattet mit den Lasern 405 nm, 488 nm und 642 nm Es wurde verwendet.</td></tr><tr><td>MIFC-Analysesoftware - IDEAS</td><td>Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen</td><td>100220</td><td>"Bildanalyse-Software" Die Begleitsoftware zur MIFC (ImageStreamX MKII)</td></tr><tr><td>MIFC-Software - INSPIRE</td><td>Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen</td><td>100220</td><td>"Bilderfassungssoftware" Dies ist die Software, die die MIFC (ImageStreamX MKII)</td></tr><tr><td>Amnis AI-Software</td><td>ausführt Luminex, ein DiaSorin-Unternehmen</td><td>100221</td><td>"AI Software" Dies ist die Software, die die Erstellung von Modellen mit künstlicher Intelligenz zur Analyse von Daten ermöglicht</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>MilliporeSigma</td><td>50-07-7</td><td></td></tr><tr><td>NEAA Mixture 100x</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>13-114E</td><td></td></tr><tr><td>Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Spülen - Reinstwasser oder entionisiertes Wasser</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Verwenden Sie Reinstwasser oder entionisiertes Wasser.&nbsp; Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Spülung.</td></tr><tr><td>RNase</td><td>MilliporeSigma</td><td>9001-99-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Hülle - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>Dies ist das gleiche wie Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung 1x&nbsp; Ca++MG++ kostenlos.&nbsp; Füllen Sie den Behälter mit 900 mL Mantel.</td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td>HyClone</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>Sterilisator - 0,4%&ndash; 0,7 % Hypochlorit</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>Dies ist durchschnittlich 10 % Clorox-Bleiche, die durch Entlühen von Clorox-Bleiche mit Wasser hergestellt werden kann. Füllen Sie den Behälter mit 200 mL Sterilisator.</td></tr><tr><td>T25-Kolben</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td></td></tr><tr><td>T75-Kolben</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TK6-Zellen</td><td>MilliporeSigma</td><td>95111735</td><td></td></tr></tbody></table>

automatisierung des mikronukleus-assays mittels bildgebender durchflusszytometrie und künstlicher intelligenz

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

Der Mikronukleus-Assay (MN) wird weltweit von Aufsichtsbehörden verwendet, um Chemikalien auf genetische Toxizität zu bewerten. Der Assay kann auf zwei Arten durchgeführt werden: durch Bewertung von MN in einmal geteilten, durch Zytokinese blockierten zweikernigen Zellen oder vollständig geteilten einkernigen Zellen. In der Vergangenheit war die Lichtmikroskopie die Goldstandardmethode, um den Assay zu bewerten, aber sie ist mühsam und subjektiv. Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten Jahren zur Bewertung des Assays eingesetzt, ist jedoch durch die Unfähigkeit, wichtige Aspekte der zellulären Bildgebung visuell zu bestätigen, eingeschränkt. Die bildgebende Durchflusszytometrie (IFC) kombiniert Hochdurchsatz-Bilderfassung und automatisierte Bildanalyse und wurde erfolgreich eingesetzt, um schnell Bilder von allen Schlüsselereignissen im MN-Assay zu erfassen und zu bewerten. Kürzlich wurde gezeigt, dass Methoden der künstlichen Intelligenz (KI), die auf Convolutional Neural Networks basieren, zur Bewertung von MN-Assay-Daten verwendet werden können, die von IFC erfasst wurden. In diesem Whitepaper werden alle Schritte beschrieben, um mithilfe von KI-Software ein Deep-Learning-Modell zu erstellen, um alle wichtigen Ereignisse zu bewerten, und um dieses Modell anzuwenden, um zusätzliche Daten automatisch zu bewerten. Die Ergebnisse des KI-Deep-Learning-Modells lassen sich gut mit der manuellen Mikroskopie vergleichen und ermöglichen so eine vollautomatische Bewertung des MN-Assays durch die Kombination von IFC und KI.

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die Verwendung der KI-Software zur Erstellung eines Modells für den MN-Assay. Der Benutzer lädt die gewünschten .daf-Dateien in die KI-Software und weist dann den Ground-Truth-Modellklassen mithilfe der KI-gestützten Cluster- (Abbildung 2) und Predict-Tagging-Algorithmen (Abbildung 3) Objekte zu. Sobald alle Ground-Truth-Modellklassen mit ausreichend Objekten gefüllt wurden, kann das Modell mi...

Der Mikronukleus-Assay (MN) ist ein etablierter Test zur Quantifizierung von DNA-Schäden. Die Bewertung des Assays mit herkömmlichen Techniken wie manueller Mikroskopie oder merkmalsbasierter Bildanalyse ist jedoch mühsam und herausfordernd. In diesem Artikel wird die Methodik zur Entwicklung eines Modells der künstlichen Intelligenz beschrieben, um den MN-Assay anhand von bildgebenden Durchflusszytometriedaten zu bewerten.

Automatisierung des Mikronukleus-Assays mittels bildgebender Durchflusszytometrie und künstlicher Intelligenz

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...

Die Durchführung des Mikrokernassays mit bildgebender Durchflusszytometrie überwindet viele Einschränkungen herkömmlicher Methoden, einschließlich niedrigem Durchsatz, Score-Variabilität und fehlender visueller Bestätigung von Ereignissen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle Schlüsselereignisse mittels bildgebender Durchflusszytometrie erfasst und mit künstlicher Intelligenz analysiert werden können. Diese Methode hat das Potenzial, im groß angelegten Screening von Chemikalien und anderen Verbindungen eingesetzt zu werden, um Toxizität bei höherem Durchsatz als derzeit verfügbar zu testen.Bei der Erstellung eines neuen KI-Modells besteht die größte Herausforderung darin, genügend Bilder von Zellen mit Mikrokernen zu erhalten, daher ist es wichtig, die Bild-Tagging-Algorithmen zu verwenden. Starten Sie zunächst die Software für künstliche Intelligenz oder KI. Klicken Sie unter Experimenttyp auf das Optionsfeld neben Trainieren, um ein Trainingsexperiment zum Erstellen des Convolutional Neural Network- oder CNN-Modells zu starten, und klicken Sie auf Weiter.Klicken Sie bei den Klassennamen auf Hinzufügen. Geben Sie im Popup-Fenster Mononucleated ein und klicken Sie auf OK, um die einkernige Klasse zur Liste der Klassennamen hinzuzufügen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die anderen Klassennamen hinzuzufügen, z. B. Mononukleiert mit MN, Zweikernig, Zweikernig mit MN, Mehrkernig und Unregelmäßige Morphologie.Klicken Sie unter "Dateien auswählen" auf "Dateien hinzufügen" und suchen Sie nach den gewünschten Dateien, die der KI-Software hinzugefügt werden sollen, um die Ground-Truth-Daten zu erstellen. Suchen Sie als Nächstes auf dem Bildschirm Basispopulation auswählen die nicht-apoptotische Population aus der Populationshierarchie. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die nicht-apoptotische Population, wählen Sie Alle übereinstimmenden Populationen auswählen und klicken Sie auf Weiter.Um eine markierte Wahrheitspopulation von einkernigen Zellen mit Mikrokern zuzuweisen, klicken Sie links unter Modellklassen auf die Klasse Mononukleiert mit MN, und klicken Sie dann rechts auf die entsprechende markierte Wahrheitspopulation. Sobald alle entsprechenden Wahrheitspopulationen zugewiesen sind, klicken Sie auf Weiter. Stellen Sie auf dem Bildschirm Kanäle auswählen sicher, dass die geeigneten Kanäle für das Experiment ausgewählt sind.Wählen Sie hier Hellfeld oder BF als Kanal eins, Herds für DNA als Kanal sieben und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie abschließend auf dem Bestätigungsbildschirm auf Experiment erstellen. Klicken Sie auf Tagging, um die Benutzeroberfläche des Tagging-Tools zu starten.Klicken Sie dann auf die Zoom-Werkzeuge, um die Bilder zur einfacheren Anzeige zuzuschneiden. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Bildgröße anzupassen und die Anzahl der Bilder zu bestimmen, die in der Galerie angezeigt werden sollen. Klicken Sie auf die Option Anzeigeeinstellung und wählen Sie min-max, was das beste Kontrastbild zur Identifizierung aller Schlüsselereignisse bietet.Klicken Sie anschließend auf Galerieanzeige einrichten, um die Farbe des DNA-Bildes in Gelb oder Weiß zu ändern, wodurch die Visualisierung kleiner Objekte verbessert wird. Klicken Sie auf Cluster, um den Algorithmus auszuführen und Bilder mit ähnlicher Morphologie zu gruppieren. Sobald das Clustering abgeschlossen ist, klicken Sie auf die einzelnen Cluster und beginnen Sie mit der Zuweisung von Bildern zu den entsprechenden Modellklassen.Nachdem jeder Modellklasse mindestens 25 Objekte zugewiesen wurden, wird der Vorhersagealgorithmus verfügbar. Klicken Sie auf Vorhersage. Nachdem die Ausführung des Vorhersagealgorithmus abgeschlossen ist, fügen Sie den entsprechenden Modellklassen Objekte aus den vorhergesagten Klassen hinzu.Sobald jeder Modellklasse mindestens 100 Objekte zugewiesen sind, klicken Sie oben auf dem Bildschirm auf die Registerkarte Training und dann auf die Schaltfläche Trainieren. Sobald das Modelltraining abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen, um die Modellgenauigkeit zu bewerten. Sobald das Modelltraining abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Menüschaltfläche, um ein neues Experiment zu definieren.Klicken Sie unter Experimenttyp auf das Optionsfeld neben Klassifizieren, um ein Klassifizierungsexperiment zu starten, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie auf das Modell, das für die Klassifizierung verwendet werden soll, und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie auf dem Bildschirm "Dateien auswählen" auf "Dateien hinzufügen".Suchen Sie nach den Dateien, die nach dem CNN-Modell klassifiziert werden sollen, und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie als Nächstes auf dem Bildschirm Basispopulation auswählen auf das Kontrollkästchen neben der nicht-apoptotischen Population in einer der geladenen Dateien. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die nicht-apoptotische Population, klicken Sie auf Select All Matching Populations, um diese Population aus allen geladenen Dateien auszuwählen, und klicken Sie dann auf Weiter.Vergewissern Sie sich auf dem Bildschirm "Kanäle auswählen", dass Kanal eins für das helle Feld und Kanal sieben für die DNA-Färbung ausgewählt ist, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie abschließend auf dem Bestätigungsbildschirm auf Experiment erstellen. Die KI-Software lädt das ausgewählte Modell und alle Bilder aus den ausgewählten Datendateien.Klicken Sie nach dem Laden auf Fertig stellen. Klicken Sie anschließend auf Klassifizieren, um den Klassifizierungsbildschirm zu öffnen. Und verwenden Sie die Kontrollkästchen, um auszuwählen, ob Random Forest oder RF und CNN verwendet werden sollen.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Klassifizieren. Dadurch wird der Prozess der Verwendung der RF- und CNN-Modelle gestartet, um zusätzliche Daten zu klassifizieren und alle Objekte zu identifizieren, die zu den angegebenen Modellklassen gehören. Sobald die Klassifizierung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Ergebnisse anzeigen.Klicken Sie auf die Schaltfläche DAFs aktualisieren, um das Fenster DAFs mit Klassifizierungsergebnissen aktualisieren aufzurufen, und klicken Sie dann auf OK, um die DAF-Dateien zu aktualisieren. Um den Bericht zu generieren, klicken Sie auf dem Ergebnisbildschirm auf Bericht generieren. Wenn ein individueller Bericht für jeden Eingangs-DAF erforderlich ist, aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Bericht für jeden Eingangs-DAF erstellen.Andernfalls klicken Sie einfach auf OK, um die Berichte zu erhalten. Der KI-gestützte Cluster-Algorithmus gruppiert ähnliche Objekte innerhalb eines Segments entsprechend der Morphologie sowohl der nicht klassifizierten Objekte als auch der Objekte, die den Ground-Truth-Modellklassen zugewiesen wurden. Cluster mit mononukleären Zellen befinden sich auf der einen Seite der Objektkarte, während sich die mehrkernigen Zellen auf der gegenüberliegenden Seite befinden.Zweikernige Zellcluster liegen zwischen ein- und mehrkernigen Zellclustern. Schließlich fallen Cluster mit unregelmäßiger Morphologie in verschiedene Bereiche der Objektkarte. Der Vorhersagealgorithmus ist robuster als der Clusteralgorithmus, wenn es darum geht, subtile Morphologien in Bildern zu identifizieren.Zum Beispiel einkernige Zellen mit MN im Vergleich zu einkernigen Zellen ohne MN. Die Leistung des Modells kann mithilfe von Werkzeugen bewertet werden, einschließlich Klassenverteilungshistogrammen, Genauigkeitsstatistiken und einer interaktiven Konfusionsmatrix. In Histogrammen der Klassenverteilung gilt: Je näher die Prozentwerte zwischen der Wahrheit und den vorhergesagten Grundgesamtheiten liegen, desto genauer ist das Modell. In der Genauigkeitsstatistik gilt: Je näher diese Metriken an 100 % liegen, desto genauer ist das Modell bei der Identifizierung von Ereignissen in den Modellklassen.Schließlich gibt die interaktive Konfusionsmatrix an, wo das Modell Ereignisse falsch klassifiziert. Die Genotoxizität wurde anhand des prozentualen Anteils der Mikrokerne durch Mikroskopie gemessen, der durch klare Balken angezeigt wurde, und die AI durch gestrichelte Balken nach einer 3-stündigen Exposition und einer 24-stündigen Erholung für Mannitol, Etoposid und Mitomycin C, wobei sowohl die Cytochalasin-B- als auch die Nicht-Cytochalasin-B-Methode verwendet wurden. Stellen Sie beim Erstellen eines Trainingsexperiments sicher, dass die geladenen Daten Bilddaten aus Positiv- und Negativkontrollproben enthalten.Mikrokerne sind selten, und es sind ausreichende Bilder erforderlich, um ein genaues KI-Modell zu erstellen. Dieses Verfahren ermöglicht die Erstellung von KI-Modellen zur Analyse von Bildfluss-Mikrokerndaten in jedem Studienbereich, wie z. B. der Strahlenbiodosimetrie. Eine schnelle und robuste KI-basierte Methode zur Identifizierung von Mikrokernen könnte sich auf andere Anwendungen ausdehnen, wie z. B. die Quantifizierung von Mikrokernen, die das Risiko der Krebsentwicklung vorhersagen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie.

Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Der In-vitro-Mikrokern-Assay ist eine etablierte Methode zur Bewertung von Genotoxizität und Zytotoxizität, aber die Bewertung des Assays mittels manueller Mikroskopie ist mühsam und leidet unter Subjektivität und Inter-Scorer-Variabilität. In diesem Artikel wird das Protokoll beschrieben, das entwickelt wurde, um eine vollautomatische Version des Tests mit multispektraler Bildflusszytometrie durchzuführen.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

Der Einsatz von künstlicher Intelligenz (Ai) zur Analyse von Bildern entwickelt sich im Vergleich zu häufig verwendeten Methoden zu einem leistungsfähigen, weniger voreingenommenen und schnellen Ansatz. Hier trainierten wir Ai, eine zelluläre Organelle, primäre Zilien zu erkennen und Eigenschaften wie Länge und Färbeintensität rigoros und reproduzierbar zu analysieren.

Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien

Automatisierte Assays mit Multi-Well-Mikroplatten sind vorteilhafte Ansätze zur Identifizierung von Signalwegregulatoren, indem sie die Bewertung einer Vielzahl von Bedingungen in einem einzigen Experiment ermöglichen. Hier haben wir das etablierte Makropinosomen-Bildgebungs- und Quantifizierungsprotokoll an ein 96-Well-Mikroplattenformat angepasst und bieten einen umfassenden Überblick über die Automatisierung mit einem Multimode-Plattenleser.

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Dieses Protokoll beschreibt einen quantitativen Ansatz zur Messung der mikrobiellen Autoaggregation mittels bildgebender Durchflusszytometrie.

Bildgebende Durchflusszytometrie zur Untersuchung der mikrobiellen Autoaggregation

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

In diesem Artikel werden Schritt-für-Schritt-Methoden zur Automatisierung der bildbasierten Zellkernquantifizierung mithilfe eines ausführbaren Open-Source-Programms beschrieben, das über eine Reihe von Zelldichten validiert wurde. Dieses Programm bietet eine Alternative, die Barrieren in Bezug auf Kosten, Zugänglichkeit für Benutzer mit begrenzten technologischen Fähigkeiten und anwendungsspezifische Validierung beseitigt, die den Nutzen bestehender Technologien einschränken können.

Verwendung von Computer-Vision-Bibliotheken zur Optimierung der Zellkernquantifizierung

Erfahren Sie, wie bildgebende Durchflusszytometrie und künstliche Intelligenz den Mikronukleus-Assay automatisieren. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige DNA-Schadensanalysen für Toxizitätstests.

Automatisierung des Mikronukleus-Assays mittels bildgebender Durchflusszytometrie und künstlicher Intelligenz

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