Virusvermehrung und zellbasierte kolorimetrische Quantifizierung

Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung des Zika-Virus, ohne auf die zytopathische Wirkung angewiesen zu sein. Es hängt von der Antikörpererkennung der Viruskomponente ab. Die Verwendung von virusspezifischen Antikörpern kann bei der Identifizierung verschiedener Virus-Serotypen in gemischten Populationen helfen.

Diese Methode hat Vorteile gegenüber klassischen Plaque-bildenden Assays. Es ist schneller und eignet sich für Anwendungen mit hohem Durchsatz, wenn es mit einem automatisierten Bildgebungssystem für eine schnelle Zellzählung angewendet wird. Das vorgeschlagene Protokoll ist in hohem Maße anpassungsfähig.

Mit entsprechenden Modifikationen kann das vorgeschlagene Protokoll auf verschiedene Zelltypen und virale Ziele angewendet werden. Beginnen Sie mit der Züchtung von Vero-Zellen in einer 75 Quadrat=Zentimeter großen Zellkulturflasche, die 12 Milliliter DMEM enthält, ergänzt mit 10% FBS und zwei Millimol L-Glutamin. Den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid stellen.

Um die Zellmonoschicht zu infizieren, verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um das Wachstumsmedium aus dem Zellkulturkolben zu entfernen. Spülen Sie den Kolben mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette zweimal mit drei Millilitern DPBS aus. Als nächstes werden zwei Milliliter serumfreies DMEM und 20 Mikroliter Zika-Virus-Inokulum in den Zellkulturkolben gegeben.

Lassen Sie den Kolben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren und dabei leicht schaukeln, um die Adsorption des Virus zu fördern. Am Ende der Inkubation wird mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette das verdünnte Virusinokulum vorsichtig aus dem Zellkulturkolben entnommen und verworfen. Spülen Sie den Zellkulturkolben zweimal mit drei Millilitern DPBS.

Geben Sie dann 12 Milliliter Erhaltungsmedien in die Zellkulturflasche, um die infizierten Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie die infizierten Vero-Zellen drei Tage lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach dreitägiger Inkubation wird der Zellkulturüberstand mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geerntet.

Für die Virusquantifizierung werden Vero-Zellen in dafür vorgesehenen Platten ausgesät und über Nacht bei 37 Grad Celsius mit einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid wachsen lassen. Bereiten Sie sechs sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Platte vor, um eine zehnfache serielle Verdünnung durchzuführen, einschließlich eines zusätzlichen Röhrchens für eine Negativkontrolle. Für ein 24-Well-Platten-Setup geben Sie 450 Mikroliter serumfreies DMEM in alle sechs Mikrozentrifugenröhrchen.

Für ein 96-Well-Platten-Setup geben Sie 135 Mikroliter serumfreies DMEM in sechs zusätzliche Röhrchen. Um eine serielle Verdünnung für das 24-Well-Plattenexperiment durchzuführen, werden 50 Mikroliter des Zika-Virus-Stamms in das 10 bis minus ein Röhrchen mit 450 Mikrolitern serumfreiem DMEM gegeben. Für das 96-Well-Plattenexperiment werden 15 Mikroliter Zika-Virus-Stamm in das 10 bis minus ein Röhrchen mit 135 Mikrolitern serumfreiem DMEM gegeben.

Vortex jedes Röhrchen, um das Virus und das Medium gründlich zu vermischen und eine gleichmäßige Verteilung der Viruspartikel innerhalb der Verdünnung zu gewährleisten. Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze, resuspendieren Sie das 10 bis minus ein Röhrchen und überführen Sie 50 und 15 Mikroliter verdünntes Zika-Virus in das 10 bis minus zwei Röhrchen als zweite zehnfache Verdünnung für die 24- bzw. 96-Well-Platten. Entfernen und entsorgen Sie das Konditionsmedium für jede Vertiefung der entsprechenden Platte.

Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit DPBS aus, um Rückstände zu entfernen. Beginnen Sie mit der höchsten Verdünnung und geben Sie das seriell verdünnte Virusinokulum in die Vertiefungen und arbeiten Sie sich auf die niedrigste Verdünnung hin. Nach einer Stunde Inkubation wird die Virussuspension aus den Vertiefungen entfernt und entsorgt, beginnend mit der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration.

Waschen Sie die infizierten Zellen zweimal mit DPBS, um alle Spuren der Virussuspension zu entfernen. Überlagern Sie die Vertiefung mit DMEM und 1,5 % Carboxymethylcellulose mit niedriger Viskosität. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Nach der Inkubation wird das Overlay-Medium entfernt und verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Verwenden Sie für die 96-Well-Platte eine Mehrkanalpipette, um das Overlay-Medium zu entfernen und zu entsorgen, und waschen Sie die Zellen dreimal mit 60 Mikrolitern PBS pro Well. Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nach 20 Minuten entsorgen Sie das Paraformaldehyd und waschen die Zellen dreimal mit PBS. Als nächstes fügen Sie 3, 3'Diaminobenzidinperoxidase-Substrat hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln. Stoppen Sie die Reaktion nach 30 Minuten, indem Sie die Vertiefungen mit Wasser waschen.

Lassen Sie die Platten über Nacht an der Luft trocknen und fahren Sie mit der Zählung der Brennpunkte fort. Zählen Sie die Brennpunkte für jedes Replikat der ausgewählten Verdünnung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Brennpunkte für jeden. Die infizierten Vero-Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion fixiert.

Bei der 2-Well-Platte wurde das erste Auftreten von Virusherden 48 Stunden nach der Infektion beobachtet, obwohl die Herdegröße zu klein war, um sie genau zu zählen. Nach 96 Stunden nach der Infektion gab es keine Anzeichen einer Zellablösung. 60 Stunden nach der Infektion hatte sich die Größe der Herde auf ein optimales Niveau für die Zählung erhöht.

Im Laufe der Zeit wurden die Brennpunkte größer und begannen, in ihrer Intensität miteinander zu verschmelzen oder sich zu überlappen, wodurch sich Cluster bildeten, die im Laufe der Zeit wuchsen. Daher wurden Herde, die sich 60 Stunden nach der Infektion bildeten, ausgewählt, um den Zika-Virus-Titer in einer 24-Well-Platte zu bestimmen. Bei der 96-Well-Platte blieben die Zellen 72 Stunden nach der Infektion intakt.

Das Auftreten von Virusherden wurde erstmals 24 Stunden nach der Infektion beobachtet. Bis zu 36 Stunden nach der Infektion waren die Herde jedoch zu klein. Die optimale Herdgröße wurde 48 Stunden nach der Infektion erreicht.

Zu letzteren Zeitpunkten wurden überlappende oder verschmolzene Herde beobachtet, und die Anzahl der überlappenden Herde nahm im Laufe der Zeit zu. Die Herde, die sich 48 Stunden nach der Infektion bildeten, wurden ausgewählt, um den Virustiter von Zika-Virus-Isolaten zu bestimmen. Geben Sie vorsichtig DPBS an der Seite jedes Wells hinzu und schwenken Sie die Platten ein- bis dreimal hin und her, um Zelltrümmer und überschüssiges Medium zu entfernen.

Diese Technik wird Forschern in der Zika-Forschung sehr zugute kommen und kann auch auf breiter Basis angepasst werden, um andere klinisch wichtige Viren zu quantifizieren, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für die Virusüberwachung und -diagnose macht.