Eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe

Dieses Protokoll ist bedeutsam, weil es Strahlungsmessungen in dicken Materialien vereinfacht und ermöglicht und es uns ermöglicht, wichtige Informationen bei der Untersuchung lebender Systeme zu sammeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ortsaufgelöste Spektralmessungen in hochabsorbierenden Materialien mit baubaren Geräten und Experimenten, die in Feldlaboren durchgeführt werden können, ermöglicht. Diese Methode kann an jedes lebende System angepasst und angewendet werden.

Die Technik zur Herstellung der Sonden ist nuanciert, aber Übung macht den Meister. Passen Sie die Messtechnik an das zu untersuchende Material an und nehmen Sie Änderungen vor, die zu einer sichereren Gewebeposition und einer geringeren Sondenreibung führen. Bauen Sie zunächst die Glashülse mit einer 5,75-Zoll-Pasteurpipette.

Montieren Sie die Glaspipette mit einer montierbaren Krokodilklemme am breiten Ende so, dass das sich verjüngende Ende nach unten zum Boden zeigt und die Ausrichtung der Pipette senkrecht zum Boden ist. Legen Sie ein Pad Isolierband auf einen 50-Gramm-Kunststoff-Schraubstockgriff, um ein Verrutschen zu verhindern, und hängen Sie den Schraubstockgriff am konischen Ende der Pipette auf. Erhitzen Sie mit einem kleinen Butangasbrenner das sich verjüngende Ende der Pipette wie im Manuskript beschrieben.

Wenn sich die Pipettenlänge um etwa fünf Zoll vergrößert hat, entfernen Sie sofort die Flamme. Verwenden Sie als nächstes eine kleine Schere oder einen Glasschneider, um das gezogene Ende der Pipette abzuschneiden. Feilen Sie alle scharfen Stellen des beschnittenen Endes mit Carborundumpapier ab und spülen Sie winzige Glasscherben oder Staub mit Isopropylalkohol und anschließender Druckluft ab.

Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Glasfaser zu durchtrennen, und entfernen Sie einen SMA-Stecker einer SMA-terminierten Glasfaser. Stellen Sie sicher, dass Sie in der Nähe eines der SMA-Anschlüsse schneiden. Entfernen Sie dann die folgenden fünf Zentimeter Kunststoff- und Glasfaserummantelung, so dass die blanke Glasfaser freigelegt wird und aus dem Rest der gesamten Baugruppe herausragt.

Verwenden Sie den Butangasbrenner, um die Polyamid-Polymerbeschichtung von der Glasfaser abzubrennen. Mit Isopropanol abspülen und die blanke Glasfaser mit einem fusselfreien Tuch abwischen. Montieren Sie nun das blanke Ende des Lichtwellenleiters direkt in einer Zangenklemme an einer Tisch- oder Regalkante, wobei das SMA-terminierte Ende der Faser in Richtung Boden hängen bleibt.

Fügen Sie etwa vier bis sechs Zoll von der Stelle entfernt, an der die blanke Glasfaser in der Zangenklemme gehalten wird, die Gewichte zum Ziehen mit zwei kleinen Klemmen am ummantelten Ende der Faser hinzu. Um die Faser zu ziehen, beginnen Sie mit der Flamme des Butangasbrenners. Halten Sie den Butangasbrenner einen Zentimeter von der blanken Faser entfernt, wie im Manuskript beschrieben.

Und lassen Sie die Faser dehnen, ziehen, trennen und auf den Boden fallen. Überprüfen Sie die Faser unter dem Mikroskop und schneiden Sie das Ende der Faser ggf. mit einer kleinen Sezierschere ab. Verwenden Sie einen undurchsichtigen Schaumstoffstift, um die Seiten der Faser abzudunkeln und das Eindringen von Streulicht zu verhindern.

Ziehen Sie die Spitze des Stifts vorsichtig über die Faser, so dass nur ein kleiner Bereich an der Spitze unbedeckt bleibt. Führen Sie die konische Glasfaser vorsichtig unter einem Stereomikroskop in das breite Ende der veränderten Glaspipette ein und drücken Sie die Faser, bis etwa ein Millimeter blanke Faser aus dem konischen Ende der Pipette herausragt. Befestigen Sie das ummantelte Ende der Glasfaser mit Isolierband am breiten Ende der Pipette.

Geben Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf eine kleine Nadel. Berühren Sie vorsichtig den Tropfen Klebstoff an der Schnittkante der gezogenen Pipette und vermeiden Sie dabei das blanke Ende der gezogenen Faser. Um die Faserspitze mit einer Streukugel zu modifizieren, erzeugen Sie das Rohmaterial, indem Sie einen Tropfen UV-härtenden Klebstoffs mit Titandioxidpulver in einem gleichen Verhältnis mischen.

Befestigen Sie die Sonde an einem Mikromanipulator mit einem Montagestangenhalter, so dass sich die Sonde in horizontaler Ausrichtung befindet. Bereiten Sie ein Arbeitsreservoir für das Streumaterial vor, indem Sie die Spitze eines Drahtes oder einer Nadel in die vorbereitete Mischung tauchen, so dass sich ein Tröpfchen Klebstoff bildet. Montieren Sie den Draht oder die Nadel mit dem Tropfen in der Nähe der Spitze der horizontalen Sonde.

Legen Sie eine Streukugel auf die Spitze der Sonde. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Spitze der optischen Faser der Sonde langsam und vorsichtig in die vorbereitete Mischung zu drücken. Dann würde man schnell die Spitze aus dem Kleber ziehen und die Streukugel in einem Mikroskop betrachten.

Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich ein kugelförmiger Klebstofftropfen der gewünschten Größe an der Spitze der Glasfaser abgelagert hat. Bereiten Sie das Geschirr vor, um die Proben zu montieren. Erhitzen Sie mit einem Butangasbrenner das große Ende einer Pasteurpipette, um ein Loch mit einem Durchmesser von 0,5 Zentimetern im Boden einer Kunststoff-Petrischale zu schmelzen.

Verschließen Sie das Loch an der Unterseite der Schale mit Isolierband oder Laborklebeband. Füllen Sie dann eine Petrischale zu einem Viertel und eine zweite Petrischale ganz mit der flüssigen Gelatine und lassen Sie sie kurz vor dem Gelieren auf Raumtemperatur abkühlen. Legen Sie die Biopsie in eine Schale in das Polster aus zähflüssiger Gelatine, das sich in dem Loch am Boden der Schale gebildet hat.

Geben Sie mit einer Pasteurpipette vorsichtig Gelatine bei Raumtemperatur um die Biopsie hinzu, bis die Petrischale voll ist. Verwenden Sie für die leere Probe nur die mit Gelatine gefüllte Schale. Befestigen Sie die Sonde an einer vertikal ausgerichteten Halterung, so dass sie auf die Lichtquelle zeigt, und befestigen Sie die Sonde mit Klemmen, Schlauchschellen oder Klebeband an einem optischen Tischpfosten.

Schließen Sie das SMA-terminierte Ende der Glasfaser der Sonde an ein USB-Glasfaserspektrometer an und verbinden Sie das Spektrometer über ein USB-Kabel mit dem Computer. Halten Sie die Sonde und die Manipulatoren in der exakt ausgerichteten Position, in der die Daten erfasst werden. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, eine feine Nadel oder eine Pipette, um vorsichtig eine kleine Menge Silikongleitmittel auf den Teil der Sonde aufzutragen, der in das Gewebe eingeführt wird, um die Reibung zwischen den Seiten der Sonde und der Gewebeprobe zu verringern.

Entfernen Sie nun das Klebeband, das das Loch in der Proben-Petrischale abdeckt, und legen Sie es in den Probenhalter, um sicherzustellen, dass es durch Reibung sicher an Ort und Stelle gehalten wird. Senken Sie die Probe mit dem Mikromanipulator auf die Sonde ab und lassen Sie die Sonde durch das Loch an der Unterseite der Petrischale in die Gelatine eindringen. Fahren Sie fort, bis die Sonde etwa fünf Millimeter von der Unterseite der Gelatineschicht entfernt ist.

Schalten Sie die Lichtquelle ein. Passen Sie mit der Spektrometersoftware die Integrationszeit des Spektrometers an, bis das Signal so hoch wie möglich, aber nicht sättigend ist. Legen Sie die Anzahl der durchschnittlichen Scans zwischen zwei und fünf und den Wert der Glättungspixel auf sechs fest.

Die nutzbaren Integrationszeiten in dieser Phase können für diese Baseline zwischen einer und 15 Millisekunden variieren. Stellen Sie sicher, dass die Integrationszeit für die Messung geeignet ist, indem Sie sicherstellen, dass das Spektrum weder zu verrauscht noch zu gesättigt ist. Ändern Sie bei Bedarf die Integrationszeit.

Bewegen Sie die Probe mit dem Mikromanipulator eine bestimmte Strecke nach unten und führen Sie die Messungen durch. Speichern Sie die Spektren an jeder vertikalen Position im Gewebe weiter. Das mikroskopische Erscheinungsbild der Sonde, die durch das Gewebe nach oben kommt, wird visualisiert.

Der prozentuale Anteil des Lichts in unterschiedlichen Gewebetiefen relativ zur Basislinie wird angezeigt. Das Wichtigste, woran Sie denken sollten, ist, dass diese Sonden zerbrechlich sind, also nehmen Sie sich Zeit und stellen Sie sicher, dass die Sondenverbindungen sicher sind, bevor Sie fortfahren. Nach der Herstellung der Sonde können die Messtechniken angepasst werden.

Zum Beispiel können Sonden ohne die Streukugel verwendet werden, um die Strahldichte zu messen, die den Detektor aus einer einzigen Richtung erreicht. Nach der Entwicklung dieser Sonde konnten die Forscher das Licht sowohl im Gehirn als auch im Fettgewebe von Mäusen mit einer Variation unseres Messapparats messen. Dies half bei der Beantwortung der Frage, ob genügend Licht vorhanden ist, um die tief im Gewebe vorhandenen Photorezeptoren zu aktivieren.