Name: Eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie man eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde für räumlich aufgelöste Spektralmessungen in lebendem Gewebe konstruiert. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen in dicken, stark absorbierenden Materialien.

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Die Autoren danken Sanaz Vahidinia für die Vorstellung von Dr. Jorgensens Kollegen und seiner Arbeit. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Army Research Office (Nr. W911NF-10-0139), des Office of Naval Research (durch den MURI-Preis Nr. N00014-09-1-1053) und des NSF-INSPIRE-Preises NSF-1343158 unterstützt.

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Es bestehen keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur systematischen Charakterisierung der optischen Umgebung durch ein großes Volumen von lebendem Gewebe mit einer räumlichen Auflösung, die ungefähr der Skala einzelner Zellen entspricht. Diese kostengünstige, flexible und vor Ort handhabbare Methode könnte für alle Forscher nützlich sein, die die Ausbreitung von Licht in lebenden Systemen untersuchen. Erfahrungsgemäß erfordern diese Sonden im Vergleich zu bestehenden Methoden7 etwas mehr Übung und Geschic...

Überraschenderweise haben Landtiere und flache Meeresbewohner genug Licht in ihrem Körper für die visuelle Physiologie und sogar die Photosynthese. Zum Beispiel werden die Lichtverhältnisse in der Mitte des Kopfes einer Maus (außerhalb der starken Hämoglobinabsorptionsbänder) um drei oder vier Größenordnungen relativ zur Außenwelt abgeschwächt. Dies entspricht in etwa der Unterschied zwischen den Lichtverhältnissen im Innen- und Außenbereich. Die Opazität eines Gewebes oder Materials aufgrund starker Streuung ist also nicht dasselbe wie die Opazität aufgrund starker Lichtabsorption. Licht kann sich in einem stark vorwärtsstreuenden System über große Entfernungen ausbreiten, ähnlich wie Licht, das sich durch aquatische Systeme mit hohen Konzentrationen von Zellen und Partikeln ausbreitet1. Diese Beobachtung ist besonders auffallend vor dem Hintergrund, dass Opsin-Proteine nahezu ubiquitär in allen Geweben aller Tiere exprimiert werden. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie und wo Licht im lebenden Gewebe abgeschwächt und gestreut wird. Im Gegensatz zu aquatischen Systemen mit lebendem Gewebe ist es jedoch unmöglich, ein Instrument in die Wassersäule einzutauchen und Strahlungs- und Bestrahlungsstärkemessungen durchzuführen, und es ist eine neue Technik erforderlich.
Andere Methoden, die bisher zur Charakterisierung der Absorptions- und Streueigenschaften von lebendem Gewebe verwendet wurden, umfassen die Messung von Gewebereflexionssonden und/oder Ulbrichtschen Kugeln2,3, mikroskopische Methoden wie die konfokale Rastermikroskopie4, die Messung der Streuung von Laserlicht auf der Oberfläche5 und Modellierungstechniken wie der Monte-Carlo-Strahlungstransfer6. Die genannten experimentellen Methoden erfordern oft spezifische, große und teure Geräte oder detaillierte Kenntnisse über die Gewebestruktur und sind in der Regel nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die räumliche Struktur des Lichts tief im Gewebe zu charakterisieren.
Es gibt auch ähnliche sondenbasierte Verfahren, bei denen eine Injektionsnadel verwendet wird, um eine optische Faser durch Gewebe einzuführen 7,8,9. Unserer Erfahrung nach sind modifizierte Nadeln wirksam beim Durchstechen von Gewebe, erfordern jedoch erhebliche Kraft und reißen im Allgemeinen empfindliches Gewebe auf, wenn sie durch dicht gepackte Zellen gelangen. Daher erfordern diese Nadeln in der Regel einen chirurgischen Eingriff, bei dem mehr als ein Millimeter oder so in eine Gewebeschicht eingeführt wird. Die hier beschriebene Methode, bei der ein geschmierter, gezogener Glasträger verwendet wird, ist in der Lage, mit minimaler Verletzung des Gewebes und ohne zusätzliche Operation zwischen den Zellen zu gleiten.
Dieses Manuskript stellt eine Methode vor, die von der Arbeit von Jorgenson und Kollegen zur Messung von Licht in Algenmatten10,11 inspiriert ist, wobei glasgestützte optische Mikrosonden und tragbare Elektronik verwendet werden, die für die Untersuchung tief in dichtes Gewebe und für die Konstruktion und den Einsatz im Feld geeignet sind. Diese Sonden können so konstruiert werden, dass sie die skalare Bestrahlungsstärke (Licht, das aus allen Richtungen auf einen Punkt trifft) und die abwärts gerichtete Strahldichte (Licht, das eine horizontale Ebene schneidet) in lebendem Gewebe mit hoher räumlicher Auflösung charakterisieren. Diese Sonden wurden ursprünglich entwickelt, um den Strahlungstransport im Gewebe photosymbiotischer Riesenmuschelnzu messen 12. Standardmessungen der Absorption und Transmission des gesamten Gewebes reichten nicht aus, um die Photosyntheseleistung des Gewebes zu charakterisieren, da es einen großen Unterschied macht, ob das gesamte einfallende Licht von einigen wenigen Zellen absorbiert wird, die eine hohe Intensität an der Oberfläche des Gewebes aufweisen, oder von vielen Zellen, die eine geringe Intensität im gesamten Volumen des Gewebes aufweisen. In einem zweiten Projekt wurden diese Sonden verwendet, um die In-vivo-Bestrahlungsstärke im Gehirn einer Maus zu messen13,14 und so die Lichtumgebung von Opsinen zu charakterisieren, die tief im Gehirn exprimiert werden. Diese Mikrosonden sind sowohl klein als auch empfindlich genug, um die Bestrahlungsstärke im Gehirngewebe von Mäusen mit intaktem Fell, Haut und Knochen zu messen und zu zeigen, dass die physiologischen Lichtstärken leicht hoch genug sind, um die Opsine im tiefen Gehirn zu stimulieren.
Diese mikrooptische Sonde und der Messaufbau könnten für Forscher nützlich sein, die das Licht im Inneren von biologischem Gewebe quantifizieren und charakterisieren müssen, insbesondere für ein nuancierteres Verständnis der Photosynthese oder der Funktionen von Sehpigmenten, die außerhalb der Augen exprimiert werden. Diese Methode kann allein oder in Verbindung mit anderen Techniken verwendet werden, um die optischen Eigenschaften und die Lichtausbreitung in lebendem Gewebe zu geringen Kosten vollständig zu charakterisieren, mit kleinen, tragbaren Geräten, die im eigenen Haus gebaut werden, und mit aufgabenabhängig einstellbaren Parametern.

<table><tbody><tr><td>1" Federkugellagerzentrum + D11 + A2: D31 + A2: A2: D31</td><td>Edmond Optics</td><td>37-935</td><td>Teil 2 des Manipulators zum Absenken der Probe</td></tr><tr><td>1/4" dicke Acrylplatte</td><td>McMaster-Carr</td><td>8505K754</td><td>Zur Herstellung von Petrischale-Halter</td></tr><tr><td>3/4" Mini-Federklemme</td><td>Amboss</td><td>99693</td><td>Verwendung als Gewicht zum Ziehen von optischen Fasern</td></tr><tr><td>8 mm Biopsiestempel</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9324386</td><td>Für Gewebeproben</td></tr><tr><td>Butanbrenner</td><td>McMaster-Carr</td><td>MT-51</td><td>Wärmequelle zum Ziehen von Fasern und Pipetten</td></tr><tr><td>Kollimationslinse</td><td>Thorlabs</td><td>LLG5A1-A</td><td>Zum Kollimieren der Lichtquelle durch flüssigen Lichtleiter</td></tr><tr><td>Druckluft</td><td>McMaster-Carr</td><td>7437K35</td><td>Zum Trocknen von gezogenen Fasern und Pipetten</td></tr><tr><td>Cyanacrylatkleber - flüssig</td><td>McMaster-Carr</td><td>66635A31</td><td>Zum Befestigen des konischen Faserendes oben an der gezogenen Pipette</td></tr><tr><td>Isolierband</td><td>McMaster-Carr</td><td>76455A21</td><td>Zum Befestigen der Faser in der Pipette und zum Anziehen von Klemmen Hochwertiges</td></tr><tr><td>Carborundum-Papier</td><td>McMaster-Carr</td><td>4649A24</td><td>Kleines Dreieck auf dem Exacto-Messerhalter eignet sich gut</td></tr><tr><td></td><td>Gelatine-Knox-10043000048679</td><td></td><td>Zum Sichern der Gewebebiopsie in der Petrischale</td></tr><tr><td>Glaspasteurpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td>Einweg-Glaspipette mit einer Länge von 5,75</td></tr>" <tr><td>Insulinspritzen, 31G Nadel</td><td>BD</td><td>320440</td><td>Zum Auftragen von Kleber</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>McMaster-Carr</td><td>54845T42</td><td>Zum Reinigen von gezogenen Fasern und Pipetten</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Cole-Parmer</td><td>SKU 33670-04</td><td>Zum Abwischen von Glasfasern und Glaspipetten reinigen</td></tr><tr><td>LED Treiber</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>Für die Stromversorgung der UV-LEDs</td></tr><tr><td>Lichtquelle für Messungen</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-78905-05</td><td>Weiße Lichtquelle mit geringer Hitze für Messungen</td></tr><tr><td>Lineare metrische X-Y-Z-Achse, Zahnstangentisch Edmond</td><td>Optics</td><td>55-023</td><td>Teil 1 des Manipulators zum Absenken der Probe</td></tr><tr><td>Flüssigkeitslichtleiter</td><td>Thorlabs</td><td>LLG5-4T</td><td>Für Lichtquelle bei Messungen</td></tr><tr><td>Magnetfüße</td><td>Siskiyou</td><td>MGB 8-32</td><td>Zur Verwendung mit Magnetstreifen</td></tr><tr><td>Magnetstreifen</td><td>Siskiyou</td><td>MS-6.0</td><td>Zur magnetischen Montage an Steckbrett</td></tr><tr><td>Manipulator #1</td><td>Siskiyou</td><td>MX10R</td><td>4-Achsen-Manipulator mit Pipettenhalter</td></tr><tr><td>Opakerstift, klein</td><td>WindowTint</td><td>TOP01</td><td>Zur Trübung der Seite der optischen Faser, um das Eindringen von Streulicht in die Sonde zu verhindern</td></tr><tr><td>Optisches Steckbrett</td><td>Edmond Optics</td><td>03-640</td><td>Zur stabilen Befestigung von Sondenhalter, Probe, Mikroskop und Lichtquelle</td></tr><tr><td>Optische Fasern</td><td>Ocean Optics</td><td>P-100-2-UV-VIS</td><td>Etwa 4 Fasern sind gut zu haben</td></tr><tr><td>Plasma-Lichtquelle</td><td>Thorlabs</td><td>HPLS345</td><td>Für Geweberadiometrie-Messungen</td></tr><tr><td>Kunststoff-Zangenklemme</td><td>McMaster-Carr</td><td>5070A11</td><td>Zangenklemme zum Ziehen der Pipette</td></tr><tr><td>Polystyrol-Petrischalen</td><td>Thomas scientific</td><td>3488N10</td><td>Probenhalter, genügend Volumen für die Probendicke plus ~10 mm Gelatine auf</td></tr><tr><td>der Oberseite Rasierklingen</td><td>McMaster-Carr</td><td>3962A3</td><td>Zum Abisolieren von Ummantelungen aus optischen</td></tr><tr><td>Fasern Silikonölschmiermittel</td><td>Thomas scientific</td><td>1232E30</td><td>Zur Verringerung der Reibung zwischen Sonde und Gewebe</td></tr><tr><td>Software zur Datenanalyse</td><td>Matlab</td><td></td><td>Ausgewählte Software für die Datenanalyse</td></tr><tr><td>Spektrometer + Spektrometer-Software</td><td>Avantes</td><td>AvaSpec-2048L</td><td>Spektrometer kann jede Marke sein, dieses ist kompatibel mit sma-terminierten optischen Fasern und wird mit einer eigenen Software für den Betrieb des Spektrometers geliefert</td></tr><tr><td>Titandioxidpulver</td><td>Sigma Aldrich</td><td>718467-100G</td><td>Zur Herstellung von Streukugeln</td></tr><tr><td>Toolour Tischclip</td><td>Toolour</td><td>Toolour0004</td><td>Zum Halten der Pipette beim Ziehen und zum Halten fertiger Sonden</td></tr><tr><td>Trigger-Action-Stangenklemmen</td><td>mcMaster-Carr</td><td>51755A2</td><td>Gut zum Halten von optischen Fasern beim Ziehen oder Aushärten von</td></tr><tr><td>UV-härtendem Klebstoff</td><td>Delo Photobond</td><td>GB368</td><td>Zum Herstellen von Streukugeln</td></tr><tr><td>UV-Lichtquelle</td><td>Thorlabs</td><td>M365FP1</td><td>Lichtquelle zum Aushärten von Klebstoff in Streukugeln, diese ist sma-faserkompatibel, höhere Intensität = kürzere Aushärtungszeit</td></tr><tr><td>Weiße LED-Lichtquelle</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHF2</td><td>Zur Charakterisierung von gezogenen Fasern und Streukugeln</td></tr></tbody></table>

eine intragewebe-radiometrie-mikrosonde zur messung der strahldichte in situ in lebendem gewebe

An Intra-Tissue Radiometry Microprobe for Measuring Radiance In Situ in Living Tissue

Organismen erscheinen vor allem deshalb undurchsichtig, weil ihre äußeren Gewebeschichten stark an einfallendem Licht gestreut werden; Stark absorbierende Pigmente, wie z. B. Blut, haben typischerweise eine enge Absorption, so dass der mittlere freie Weg des Lichts außerhalb der Absorptionsspitzen recht lang sein kann. Da Menschen nicht durch Gewebe hindurchsehen können, stellen sie sich im Allgemeinen vor, dass Gewebe wie Gehirn, Fett und Knochen wenig oder gar kein Licht enthalten. Photoresponsive Opsin-Proteine werden jedoch in vielen dieser Gewebe exprimiert, und ihre Funktionen sind nur unzureichend verstanden. Auch die Strahlkraft im Gewebe ist wichtig für das Verständnis der Photosynthese. Zum Beispiel sind Riesenmuscheln stark absorbierend, halten aber eine dichte Algenpopulation tief im Gewebe aufrecht. Die Lichtausbreitung durch Systeme wie Sedimente und Biofilme kann komplex sein, und diese Gemeinschaften können einen wichtigen Beitrag zur Produktivität von Ökosystemen leisten. Daher wurde eine Methode zur Konstruktion optischer Mikrosonden zur Messung der skalaren Bestrahlungsstärke (Photonenfluss, der einen Punkt schneidet) und der Abwärtsbestrahlungsstärke (Photonenfluss, der eine Ebene senkrecht durchquert) entwickelt, um diese Phänomene im lebenden Gewebe besser zu verstehen. Diese Technik ist auch in Feldlaboren umsetzbar. Diese Mikrosonden bestehen aus wärmegezogenen Lichtwellenleitern, die dann in gezogenen Glaspipetten befestigt werden. Um die Winkelakzeptanz der Sonde zu verändern, wird dann eine 10-100 μm große Kugel aus UV-härtendem Epoxidharz, gemischt mit Titandioxid, am Ende einer gezogenen, getrimmten Faser befestigt. Die Sonde wird in lebendes Gewebe eingeführt und ihre Position wird mit einem Mikromanipulator kontrolliert. Diese Sonden sind in der Lage, die Strahldichte von Gewebe in situ mit einer räumlichen Auflösung von 10-100 μm oder auf der Skala einzelner Zellen zu messen. Diese Sonden wurden verwendet, um das Licht zu charakterisieren, das die Fett- und Gehirnzellen 4 mm unter der Haut einer lebenden Maus erreicht, und um das Licht zu charakterisieren, das ähnliche Tiefen in lebendem algenreichem Riesenmuschelgewebe erreicht.

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Aufbau einer mikrooptischen Sonde, mit der die Bestrahlungsstärke des Auftriebs gemessen werden kann (das Licht, das aus einer Richtung auf einen Punkt trifft) oder, mit der Hinzufügung einer lichtstreuenden kugelförmigen Spitze, die skalare Bestrahlungsstärke (das Licht, das einen Punkt aus allen Richtungen erreicht). Diese Sonden können die Bestrahlungsstärke mit räumlicher Auflösung messen, die sich den Längenskalen einzelner Zellen im lebenden Gewebe annähert. Dieses Prot...

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe beschrieben. Diese Arbeit enthält Details zum Aufbau von mikroskaligen Sonden für verschiedene Messungen von Strahldichte und Bestrahlungsstärke, bietet Anleitungen für die Montage von Gewebe zur Charakterisierung der Strahldichte und skizziert Berechnungsmethoden zur Analyse der resultierenden Daten.

Eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe

Organisms appear opaque largely because their outer tissue layers are strongly scattering to incident light; strongly absorbing pigments, such as blood, ...

Dieses Protokoll ist bedeutsam, weil es Strahlungsmessungen in dicken Materialien vereinfacht und ermöglicht und es uns ermöglicht, wichtige Informationen bei der Untersuchung lebender Systeme zu sammeln. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ortsaufgelöste Spektralmessungen in hochabsorbierenden Materialien mit baubaren Geräten und Experimenten, die in Feldlaboren durchgeführt werden können, ermöglicht. Diese Methode kann an jedes lebende System angepasst und angewendet werden.Die Technik zur Herstellung der Sonden ist nuanciert, aber Übung macht den Meister. Passen Sie die Messtechnik an das zu untersuchende Material an und nehmen Sie Änderungen vor, die zu einer sichereren Gewebeposition und einer geringeren Sondenreibung führen. Bauen Sie zunächst die Glashülse mit einer 5,75-Zoll-Pasteurpipette.Montieren Sie die Glaspipette mit einer montierbaren Krokodilklemme am breiten Ende so, dass das sich verjüngende Ende nach unten zum Boden zeigt und die Ausrichtung der Pipette senkrecht zum Boden ist. Legen Sie ein Pad Isolierband auf einen 50-Gramm-Kunststoff-Schraubstockgriff, um ein Verrutschen zu verhindern, und hängen Sie den Schraubstockgriff am konischen Ende

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Brusttumor-Zellen, die Luciferase werden subkutan in Mäuse implantiert und visualisiert mit Hilfe der optischen Bildgebung, das Tumorwachstum und die Entwicklung nicht-invasiv in einer Längsschnittstudie zu überwachen.

In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung...

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

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Wir beschreiben ein nicht-invasives Verfahren zur Unterscheidung entzündlichen Phasen. Systemische Lieferung von Luminol zeigt Bereiche der akuten Entzündung abhängig MPO-Aktivität in neutrophilen Granulozyten. Im Gegensatz dazu ermöglicht das Einstreuen Lucigenin zur Visualisierung der chronischen Entzündung abhängig Phox Aktivität in Makrophagen.

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In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

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Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Europium thenoyltrifluoroacetonate (EuTFC) eine optische lumineszenz Linie bei 612 nm, deren Aktivierungseffizienz sinkt stark mit der Temperatur. Wenn eine mit einem dünnen Film aus diesem Material beschichtete Probe Mikro abgebildet ist, kann die 612 nm lumineszenten Reaktionsintensität in eine direkte Karte von Probenoberflächentemperatur umgewandelt werden.

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Der Aufbau und die Verwendung eines multimodalen Mikroendoskops wird beschrieben, das oberflächliche Gewebebilddaten mit gewebephysiologischen Parametern wie Hämoglobinkonzentration, Melaninkonzentration und Sauerstoffsättigung koregistrieren kann. Diese Technik kann für die Beurteilung der Gewebestruktur und -perfusion nützlich sein und für die individuellen Bedürfnisse des Untersuchers optimiert werden.

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Erfahren Sie, wie man eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde für räumlich aufgelöste Spektralmessungen in lebendem Gewebe konstruiert. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen in dicken, stark absorbierenden Materialien.

Eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe

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