Name: Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Lernen Sie die Etablierung von PDX-Modellen für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Diese Methode ermöglicht personalisierte Krebstherapie durch gezielte Arzneimitteltests.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Wissenschafts- und Technologieunterstützungsprogramm der Provinz Sichuan (Förderkennzeichen 2019JDRC0019 und 2021ZYD0097), das Projekt 1.3.5 für Exzellenzdisziplinen, West China Hospital, Sichuan University (Förderkennzeichen ZYJC18026), das Projekt 1.3.5 für Exzellenzdisziplinen – Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (Förderkennzeichen 2020HXFH023), den Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten (SCU2022D025), das internationale Kooperationsprojekt des Chengdu Science and Technology Bureau (Fördernummer 2022-GH02-00023-HZ), das Innovation Spark-Projekt der Universität Sichuan (Fördernummer 2019SCUH0015) und der Talent Training Fund for Medical-Engineering Integration des West China Hospital - University of Electronic Science and Technology (Fördernummer HXDZ22012).

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des West China Hospital der Universität Sichuan genehmigt wurden. Für die vorliegende Studie wurden immundefiziente NOD-SCID-Mäuse im Alter von 4-6 Wochen (beiderlei Geschlechts) und weibliche Balb/c-Nacktmäuse im Alter von 4-6 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle). Die Ethikkommission des West China Hospital genehmigte die Studie mit menschlichen Probanden (Protokollnummer 2020353). Jeder Patient gab eine schriftliche Einverständniserklärung ab.
1. Experimentelle Vorbereitung
<ol><li>Ordnen Sie Einwegklingen, sterilisierte Scheren und Pinzetten und andere für die Tumortransplantation erforderliche Instrumente an, legen Sie sie auf die ultrareine Werkbank und bestrahlen Sie sie im Voraus mit ultraviolettem Licht.</li>
	<li>Bereiten Sie sterile Kochsalzlösung und Petrischalen für die Verwendung während des Tests vor.</li>
</ol>2. Gewinnung und Transport von frischem Tumorgewebe
<ol><li>Frische Tumorproben (in der Regel größer als 5 mm x 5 mm) aus dem Operationssaal entnehmen und in ein 15-ml- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit steriler HTK-Lösung (siehe Materialtabelle) oder Kochsalzlösung geben. Beschriften Sie die Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Frische Tumorproben wurden durch chirurgische Entfernung oder Punktion von Patienten mit ATC oder HNSCC gewonnen.</li>
	<li>Stellen Sie die Zentrifugenröhrchen in eine im Voraus vorbereitete Eisbox. HINWEIS: Während dieser Zeit muss der Transplantationsarzt die für die Transplantation erforderlichen Gegenstände vorbereiten (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Zeit zwischen der Probenentnahme und dem Transport zum Labor für die PDX-Konstruktion 2 Stunden nicht überschreitet. Umgeben Sie die Röhrchen, die das Gewebe enthalten, während des Transports mit einem Eis-Wasser-Gemisch oder Eisbeuteln, um die Gewebeaktivität zu erhalten.</li>
</ol>3. Tumortransplantation
<ol><li>Sobald das Tumorgewebe im Labor angekommen ist, wird es aufgezeichnet und neu nummeriert. HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die Patienteninformationen streng vertraulich behandelt. Die restlichen Schritte des Verfahrens wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durchgeführt. Beim Betreten des Labors wird empfohlen, einen Kittel über der Arbeitskleidung oder Schutzkleidung, einen Hut und eine Maske zu tragen. Die Behandlung des Tumorgewebes erfolgt in einer Biosicherheitswerkbank.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Zentrifugenröhrchen mit dem Tumorgewebe mit 75%igem Alkohol und legen Sie sie auf den OP-Tisch. Das Tumorgewebe wird mit einer sterilisierten Augenzange in 6 cm dicke, mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischalen überführt. Schneiden Sie sie anschließend mit einer Klinge in kleine Stücke von ca. 2 mm x 2 mm und 3 mm x 3 mm.</li>
	<li>Übertragen Sie die Stücke des Tumorgewebes in eine 6-cm-Petrischale mit der entsprechenden Menge Kochsalzlösung, wickeln Sie die Schale mit der Siegelfolie ein, stellen Sie sie in eine Eisbox und tragen Sie sie zusammen mit den erforderlichen Instrumenten (Schere, Pinzette und Impfnadeln) in den speziellen erregerfreien Tierraum (SPF).</li>
	<li>Bereiten Sie das Tier vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Entfernen Sie die Haare am rechten seitlichen Thorax von 4-6 Wochen alten weiblichen oder männlichen immundefizienten NOD-SCID-Mäusen und desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Alkohol. Betäuben Sie die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin (siehe Materialtabelle) und schmieren Sie ihre Augen mit Tierarztsalbe ein, um Trockenheit zu verhindern. Bestätigen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust des Pedalreflexes.</li>
		<li>Machen Sie einen 2-mm-Schnitt mit einer Schere durch die Haut in der Mitte des rechten seitlichen Brustkorbs von Mäusen.</li>
	</ol></li>
	<li>Nehmen Sie ein Tumorstück aus der Petrischale und legen Sie es mit einer Pinzette in die 2,4 mm x 2,0 mm große Trokarnadel (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Halten Sie die Maus fest, straffen Sie die Haut an der Einstichstelle, führen Sie den Tumor mit dem Trokar mit den Tumorstücken durch den ersten 2 mm Hautschnitt ein, bewegen Sie sich auf die Rückseite der Schulter und schieben Sie den Trokarkern.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Tumorstück herausgedrückt wird und in der durch die Trokarpunktion gebildeten Übergangshöhle verbleibt, und ziehen Sie dann den Trokar heraus.</li>
	<li>Wenn sich der Tumor beim Herausziehen mit der Nadel bewegt, verwenden Sie den Trokar, um ihn zurückzusetzen und den Schnitt zu vernähen. HINWEIS: In dieser Studie wurde jede Maus an den dorsalen Vorder- und Hinterbeinen geimpft. Pro Tumorprobe wurden von jedem Patienten ein bis drei Mäuse geimpft, basierend auf der Tumorgröße.</li>
</ol>4. Konservierung, Fixierung und Einfrieren von Tumorgewebe
HINWEIS: Das verbleibende Tumorgewebe wurde für die Konservierung von Samen, die Fixierung bzw. das Einfrieren von DNA/RNA/Proteinen verwendet.
<ol><li>Entfernen Sie die Kochsalzlösung mit einer sterilen Gaze von der Tumoroberfläche, bevor Sie sie in das Kryokonservierungsröhrchen legen, um sicherzustellen, dass die Tumoroberfläche nicht übermäßig nass wird.</li>
	<li>Geben Sie vier bis sechs Stücke von 2 mm x 2 mm Tumorgewebe in ein 2-ml-Zellkryokonservierungsröhrchen, geben Sie 1 ml Kryokonservierungslösung, die zu 90 % aus fötalem Knöberserum (FBS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) besteht, in das Röhrchen, legen Sie das Röhrchen in eine Gradientenkühlbox, frieren Sie es über Nacht bei −80 °C ein und schließen Sie es Übertragen Sie es in flüssigen Stickstoff.</li>
	<li>Legen Sie die 3 mm x 3 mm großen Tumorgewebeblöcke in 10%iges gepuffertes Formalin zur Gewebefixierung für die pathologische Untersuchung.</li>
	<li>Legen Sie den 3 mm x 3 mm großen Gewebeblock in ein 2-ml-Zellkryokonservierungsröhrchen, frieren Sie ihn schnell in flüssigem Stickstoff ein und stellen Sie ihn dann zur DNA/RNA- und Proteinextraktion in einen Kühlschrank mit einer Temperatur von −80 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie die klinischen Informationen der Patienten, wie z. B. die Raucheranamnese, die Tumorgröße, die Differenzierung, den pathologischen Subtyp, den Krebsgrad, das Krebsstadium, die Fernmetastasen, die Herkunft, die Krankengeschichte, die Immunhistochemie, die Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) bei HNSCC-Patienten und die Behandlungsmedikation.</li>
</ol>5. Passierung, Kryokonservierung und Reanimation von PDX-Modelltumoren
<ol><li>Messen Sie die Länge und Breite der subkutanen Tumore bei Mäusen einmal pro Woche mit Nonius-Messschiebern und berechnen Sie das Tumorvolumen nach der Formel: Tumorvolumen = 0,5 × Länge × Breite2. Zeichne die Tumorwachstumskurve.</li>
	<li>Wenn der PDX-Tumor 2.000 mm3 erreicht, wird er an die nächste Generation von Mäusen weitergegeben und eine erneute Tumortransplantation durchgeführt. Führen Sie die Vorbereitung der Instrumente gemäß Schritt 4 durch.</li>
	<li>Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation nach Betäubung mit 80 mg/kg Ketamin.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut mit 75%igem Alkohol. Schneiden Sie dann die Haut, die den Tumor umgibt, mit einer Schere ab, entfernen Sie den Tumor mit einer Pinzette und legen Sie ihn in eine Petrischale.</li>
	<li>Führen Sie die Tumortransplantation nach Schritt 3 durch.</li>
	<li>Führen Sie die Konservierung und Kryokonservierung der PDX-Modelltumoren gemäß Schritt 4 durch.</li>
	<li>Für die Wiederbelebung des Tumorgewebes gilt das Prinzip des langsamen Einfrierens und der schnellen Auflösung. Nachdem Sie die Kryogefäße aus flüssigem Stickstoff entnommen haben, legen Sie sie schnell in ein Wasserbad bei 37 °C, um sie schnell aufzulösen.</li>
	<li>Schütteln Sie die Kryogefäße vorsichtig im Wasserbad, um den Auftauprozess zu beschleunigen.</li>
	<li>Tauen Sie die Tumorstücke auf, geben Sie sie zum Waschen in die vorbereitete normale Kochsalzlösung und impfen Sie dann die nächste Generation von Mäusen. Für die spezifische Operation lesen Sie bitte das Gewebetransplantationsverfahren in Schritt 3.</li>
</ol>6. Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Lenvatinib und Cisplatin im ATC-PDX-Modell
HINWEIS: Das ATC-PDX-Modell wurde verwendet, um die therapeutische Wirkung des Tyrosinkinase-Inhibitors Lenvatinib und des Chemotherapeutikums Cisplatin25,26,27 zu testen.
<ol><li>Wählen Sie das Tumorgewebe der P5-Generation eines ATC-PDX-Modells (THY-017) aus, schneiden Sie es in 2-4mm 3 Gewebestücke und inokulieren Sie subkutan (Schritt 3) auf den rechten Rücken von zehn 4-6 Wochen weiblichen Balb/c-Nacktmäusen.</li>
	<li>Wählen Sie 15 Mäuse mit einem Tumorvolumen zwischen 50 und 150mm3 aus und teilen Sie sie in drei Gruppen ein.</li>
	<li>Verabreichen Sie einer Gruppe 15 Tage lang einmal täglich intragastrisch Lenvatinib (10 mg/kg), einer Gruppe alle 3 Tage alle 3 Tage intraperitoneal Cisplatin (3 mg/kg) für insgesamt sechs Dosen und der Kontrollgruppe das gleiche Volumen normaler Kochsalzlösung.</li>
	<li>Messen Sie zweimal pro Woche das Körpergewicht und das Tumorvolumen der Mäuse.</li>
	<li>Am Ende des Tests werden die Mäuse eingeschläfert (Schritt 5.3) und die Tumore gewogen.</li>
</ol>

Mögliche Interessenkonflikte werden nicht offengelegt.

In dieser Studie konnten die subkutanen PDX-Modelle von ATC und HNSCC erfolgreich etabliert werden. Es gibt viele Aspekte, auf die beim Bau von PDX-Modellen geachtet werden muss. Wenn das Tumorgewebe vom Patienten getrennt wird, sollte es so schnell wie möglich in die Eisbox gelegt und zur Impfung ins Labor geschickt werden. Nachdem der Tumor im Labor angekommen ist, muss der Bediener auf die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes achten und aseptische Verfahren anwenden. Da das Tumorgewebe bei Nadelbiopsieproben besond...

Das PDX-Modell ist ein Tiermodell, bei dem menschliches Tumorgewebe in immundefiziente Mäuse transplantiert wird und in der von den Mäusen bereitgestellten Umgebung wächst1. Herkömmliche Tumorzelllinienmodelle leiden unter mehreren Nachteilen, wie z. B. der mangelnden Heterogenität, der Unfähigkeit, die Tumormikroumgebung zu erhalten, der Anfälligkeit für genetische Variationen während wiederholter In-vitro-Passagen und der schlechten klinischen Anwendung 2,3. Die Hauptnachteile gentechnisch veränderter Tiermodelle sind der potenzielle Verlust der genomischen Merkmale menschlicher Tumore, die Einführung neuer unbekannter Mutationen und die Schwierigkeit, den Grad der Homologie zwischen Maustumoren und menschlichen Tumoren zu bestimmen4. Hinzu kommt, dass die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodelle teuer, zeitaufwendig und relativ ineffizient ist4.
Das PDX-Modell hat gegenüber anderen Tumormodellen viele Vorteile in Bezug auf die Widerspiegelung der Tumorheterogenität. Aus histopathologischer Sicht ersetzt das Maus-Pendant zwar im Laufe der Zeit das menschliche Stroma, aber das PDX-Modell bewahrt die morphologische Struktur des Primärtumors gut. Darüber hinaus bewahrt das PDX-Modell die metabolomische Identität des Primärtumors für mindestens vier Generationen und spiegelt die komplexen Wechselbeziehungen zwischen Tumorzellen und ihrer Mikroumgebung besser wider, was es einzigartig in der Simulation von Wachstum, Metastasierung, Angiogenese und Immunsuppression von menschlichem Tumorgewebe macht 5,6,7. Auf zellulärer und molekularer Ebene spiegelt das PDX-Modell die Heterogenität zwischen und innerhalb des Tumors menschlicher Tumore sowie die phänotypischen und molekularen Merkmale des ursprünglichen Krebses genau wider, einschließlich Genexpressionsmuster, Mutationsstatus, Kopienzahl sowie DNA-Methylierung und Proteomik 8,9. PDX-Modelle mit unterschiedlichen Passagen weisen die gleiche Sensitivität gegenüber medikamentöser Therapie auf, was darauf hindeutet, dass die Genexpression von PDX-Modellen sehr stabil ist10,11. Studien haben eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem Ansprechen des PDX-Modells auf ein Medikament und dem klinischen Ansprechen der Patienten auf dieses Medikament gezeigt12,13. Daher hat sich das PDX-Modell zu einem leistungsstarken präklinischen und translationalen Forschungsmodell entwickelt, insbesondere für das Wirkstoffscreening und die Vorhersage klinischer Prognosen.
Schilddrüsenkrebs ist ein häufiger bösartiger Tumor des endokrinen Systems und eine bösartige Erkrankung des Menschen, deren Inzidenz in den letzten Jahren rapide zugenommen hat14. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist mit einer medianen Überlebenszeit von nur 4,8 Monaten der bösartigste Schilddrüsenkrebs15. Obwohl in China jedes Jahr nur bei einer Minderheit der Schilddrüsenkrebspatienten ATC diagnostiziert wird, liegt die Sterblichkeitsrate bei fast 100 %16,17,18. ATC wächst in der Regel schnell und dringt in das angrenzende Gewebe des Halses sowie in die zervikalen Lymphknoten ein, und etwa die Hälfte der Patienten hat Fernmetastasen19,20. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist die sechsthäufigste Krebserkrankung der Welt und eine der häufigsten Krebstodesursachen, wobei jedes Jahr schätzungsweise 600.000 Menschen an HNSCC erkranken21,22,23. Das HNSCC umfasst eine große Anzahl von Tumoren, darunter solche in der Nase, den Nasennebenhöhlen, dem Mund, den Mandeln, dem Rachen und dem Kehlkopf24. ATC und HNSCC sind zwei der wichtigsten Malignome von Kopf und Hals. Um die Entwicklung neuartiger Therapeutika und personalisierter Behandlungen zu erleichtern, ist es notwendig, robuste und fortschrittliche präklinische Tiermodelle wie PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu entwickeln.
In diesem Artikel werden detaillierte Methoden zur Etablierung des subkutanen PDX-Modells von ATC und HNSCC vorgestellt, die Schlüsselfaktoren analysiert, die die Tumoraufnahmerate in der Modellkonstruktion beeinflussen, und die histopathologischen Charakteristika zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Währenddessen wurden in vivo pharmakodynamische Tests unter Verwendung der erfolgreich konstruierten PDX-Modelle durchgeführt, um deren klinische Relevanz zu validieren.

<table><tbody><tr><td>2,4 mm x 2,0 mm Trokar</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-9065</td><td></td></tr><tr><td>Balb/c Nacktmäuse</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>401</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Suzhou Antai</td><td>BSC-1300IIA2</td><td></td></tr><tr><td>Klinge</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-0823</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen &nbsp;</td><td>Corning</td><td>430791/430829</td><td></td></tr><tr><td>Kryokonservierungsröhrchen</td><td>Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol HTK-Lösung</td><td>Custodiol</td><td>2103417</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>D5879-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>METTLER</td><td>ME104</td><td></td></tr><tr><td>Elektronischer digitaler Messschieber</td><td>Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd</td><td>0-220</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04001-500</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics 26</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd&nbsp;</td><td></td><td></td>100761663</tr><tr><td>Lenvatinib</td><td>ApexBio</td><td>A2174</td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID immundefiziente Mäuse</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.</td><td>406</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Streptokokken-Lösung</td><td>Biologische Industrie</td><td>03-03101BCS</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>WHB</td><td>WHB-60/WHB-100</td><td></td></tr><tr><td>Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Sichuan Kelun</td><td>W220051705</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-0110</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd</td><td>18-1241</td><td></td></tr><tr><td>Tierarztsalbe</td><td>Pfizer Inc.</td><td></td><td></td>P10015353</tr><tr><td>Xylazine</td><td>Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd</td><td>070031777</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung und charakterisierung von patientenabgeleiteten xenotransplantatmodellen des anaplastischen schilddrüsenkarzinoms und des kopf-hals-plattenepithelkarzinoms

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Patient-derived xenograft (PDX)-Modelle bewahren die histologischen und genetischen Merkmale des Primärtumors und bewahren seine Heterogenität. Pharmakodynamische Ergebnisse, die auf PDX-Modellen basieren, korrelieren stark mit der klinischen Praxis. Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist die bösartigste Subform des Schilddrüsenkarzinoms mit starker Invasivität, schlechter Prognose und begrenzter Behandlung. Obwohl die Inzidenzrate von ATC nur 2%-5% des Schilddrüsenkrebses ausmacht, liegt die Sterblichkeitsrate bei 15%-50%. Das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) ist mit über 600.000 Neuerkrankungen weltweit eine der häufigsten bösartigen Erkrankungen des Kopfes und Halses. Im Folgenden werden detaillierte Protokolle vorgestellt, um PDX-Modelle von ATC und HNSCC zu erstellen. In dieser Arbeit wurden die Schlüsselfaktoren, die die Erfolgsrate der Modellkonstruktion beeinflussen, analysiert und die histopathologischen Merkmale zwischen dem PDX-Modell und dem Primärtumor verglichen. Darüber hinaus wurde die klinische Relevanz des Modells validiert, indem die in vivo therapeutische Wirksamkeit repräsentativer klinisch eingesetzter Medikamente in den erfolgreich konstruierten PDX-Modellen evaluiert wurde.

Insgesamt wurden 18 Schilddrüsenkrebsproben transplantiert und fünf PDX-Modelle für Schilddrüsenkrebs erfolgreich konstruiert (27,8 % Tumorentnahmerate), darunter vier Fälle von undifferenziertem Schilddrüsenkrebs und ein Fall von anaplastischem Schilddrüsenkrebs. Der Zusammenhang zwischen der Erfolgsrate der Modellkonstruktion und dem Alter, dem Geschlecht, dem Tumordurchmesser, dem Tumorgrad und der Differenzierung wurde analysiert. Obwohl die Modellerfolgsrate von Tumorproben Grad 4 höher war als bei Proben mit niedri...

Das vorliegende Protokoll etabliert und charakterisiert ein patientenabgeleitetes Xenotransplantat-Modell (PDX) für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom (ATC) und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC), da PDX-Modelle schnell zum Standard im Bereich der translationalen Onkologie werden.

Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Dieses Protokoll hilft bei der Erstellung von ATC- und HNSCC-PDX-Modellen, die die Tumorheterogenität und die molekulare Vielfalt besser widerspiegeln und klinische Ergebnisse vorhersagen. Die Technik ist einfach zu bedienen, hat eine hohe Erfolgsquote und kann auch für andere PDX-Modelle geeignet sein. Diese Technik kann auf das Empfindlichkeitsscreening gegen Krebsmedikamente ausgeweitet werden, um die personalisierte Behandlung von Krebspatienten zu steuern.Eine Person, die diese Technik noch nie durchgeführt hat, kann auf einige Schwierigkeiten stoßen, und es wird empfohlen, auf jedes Detail des Schemas zu achten. Nach der Entnahme von ATC- und HNSCC-Tumorproben in einem 50-Millimeter-Zentrifugenröhrchen mit steriler HTK-Lösung werden diese mit 75%igem Alkohol desinfiziert. Übertragen Sie das Tumorgewebe mit einer sterilisierten Augenzange in eine sechs Zentimeter dicke, mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischale und schneiden Sie es mit einer Klinge in kleine Stücke.Übertragen Sie die Stücke dann in eine neue sechs Zentimeter dicke Petrischale mit der Kochsalzlösung und wickeln Sie sie mit Siegelfolie ein. Stellen Sie die eingewickelte Schale in eine Eisbox und tragen Sie sie mit Schere, Pinzette und Impfnadeln in den erregerfreien Tierraum. Entfernen Sie nach der Betäubung der Maus die Haare am rechten seitlichen Brustkorb und desinfizieren Sie den Bereich mit 75%igem Alkohol.Machen Sie mit einer Schere einen zwei Millimeter langen Schnitt in der Mitte des rechten seitlichen Brustkorbs. Nehmen Sie mit einer Pinzette das Gewebe aus der Petrischale und legen Sie es in die Trokarnadel. Halten Sie die Maus fest und spannen Sie die Haut an der Einstichstelle.Führen Sie den Trokar mit dem Tumorstück in die Inzision zum Unterhautraum ein, bewegen Sie sich dann zur Rückseite der Schulter und schieben Sie den Trokarkern ein. Um das verbleibende Gewebe mit einer sterilen Gaze zu reservieren, entfernen Sie Kochsalzlösung von der Tumoroberfläche und achten Sie darauf, dass sie nicht übermäßig nass ist. Geben Sie vier bis sechs Gewebestücke in ein Zwei-Milliliter-Zellkryokonservierungsröhrchen und geben Sie einen Milliliter Kryokonservierungslösung in das Röhrchen.Legen Sie die Tube dann in eine Gradientenkühlbox und frieren Sie sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein. Zum Schluss in flüssigen Stickstoff überführen. Verwenden Sie für die Wiederbelebung der PDX-Modelltumoren einmal pro Woche Messschieber Vernier-Messschieber, um die Länge und Breite des subkutanen Tumors zu messen.Berechnen Sie das Tumorvolumen und zeichnen Sie die Tumorwachstumskurve. Schneiden Sie dann mit einer Schere die euthanasierte Maushaut ab, die den Tumor umgibt. Entfernen Sie den Tumor mit einer Pinzette und legen Sie ihn in eine Petrischale.Führen Sie die Tumortransplantation bis zur fünften Generation von Mäusen durch, wie zuvor gezeigt. Wählen Sie das Tumorgewebe einer Maus des Modells ATC PDX der P5-Generation aus. Schneiden Sie es in zwei bis vier Kubikmillimeter große Stücke.Impfen Sie diese Stücke subkutan, wie zuvor gezeigt, auf den rechten Rücken einer nackten, vier bis sechs Wochen alten weiblichen BALB/c-Maus. Wenn der Tumor 50 bis 150 Kubikmillimeter groß ist, teilen Sie die Mäuse in drei Gruppen ein. Messen Sie nach der Verabreichung von Lenvatinib, Cisplatin und der Kontrolle zweimal pro Woche das Körpergewicht der Maus.Messen Sie auch das Tumorvolumen. Die Korrelationsanalyse zeigte, dass die Erfolgsrate der ATC-PDX-Modellkonstruktion nicht von Alter, Geschlecht, Tumordurchmesser, Tumorgrad und Differenzierung abhängig war. Die Tumorentnahmerate in der HNSCC PDX-Modellkonstruktion zeigte, dass der Grad der Differenzierung mit der Modellerfolgsrate assoziiert war, während die anderen Parameter keinen Einfluss auf die Tumorentnahmerate hatten.Die Tumorwachstumskurven für jedes PDX-Modell zeigten, dass die ATC-Proben stabil an die P3-Generation weitergegeben wurden, während zwei Fälle von HNSCC-Proben nach dem Übergang in die P1-Generation keine Tumore bildeten. Die Tumorwachstumsrate der P0-Generation war für die meisten PDX-Modelle relativ langsamer als für die späteren Passagen, was wahrscheinlich auf die Anpassung der Mikroumgebung der Maus zurückzuführen ist. Die histopathologische Untersuchung zeigte, dass die PDX-Tumoren die morphologischen Merkmale der Primärtumoren beibehalten.Die Behandlung mit Lenvatinib hemmte das Tumorwachstum signifikant und zeigte im ATC-PDX-Modell im Vergleich zur Kontrollgruppe ein geringeres Tumorgewicht. Darüber hinaus zeigten die mit Lenvatinib behandelten Mäuse keine erkennbaren Veränderungen ihres Gesamtgewichts. Eine übermäßige Cisplatin-Dosierung führte zu einer erheblichen Toxizität, die sich in Gewichtsverlust und sogar Tod zeigte.Frische Tumore müssen mehrmals mit normaler Kochsalzlösung gewaschen werden, bevor sie in Stücke geschnitten werden. Das Mischen und Beimpfen von biopsierten Tumorproben führt wahrscheinlich zur Tumorbildung. Dieses Modell kann für die tumorbiologische Forschung, das Screening von Medikamenten und die personalisierte Therapie verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Generierung einer orthotopen Mausmodell der anaplastischen Schilddrüsenkarzinom wird hier beschrieben. Diese Technik beschäftigt chirurgische Platzierung des menschlichen anaplastischen Schilddrüsenkrebs Zellen in der Schilddrüse von immungeschwächten Mäusen, wodurch eine weitere klinisch relevante Einstellung, um den Krankheitsverlauf sowie Bildschirm innovative therapeutische Interventionen zu studieren.

Ein orthotopen Mausmodell des Anaplastic Schilddrüsenkarzinom

Unter Verwendung Patienten stammenden Tumoren in einem subkutanen präklinischen Modell ist eine hervorragende Möglichkeit, die Wirksamkeit neuer Therapien, prädiktive Biomarker Entdeckung und arzneimittelresistente Wege zu untersuchen. Dieses Modell, das in der Arzneimittelentwicklung wesentlich ist, das Schicksal vieler neuartiger Krebstherapien vor der klinischen Untersuchung zu bestimmen.

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von vom Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX) und primären Krebszelllinien aus chirurgischen Magenkrebsproben. Die Methoden sind ein nützliches Instrument für die Arzneimittelentwicklung und die Krebsbiologieforschung.

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

Metastasierung des Zentralnervensystems PDX-Modelle repräsentieren die phänotypischen und molekularen Merkmale der humanen Metastasierung und sind damit hervorragende Modelle für präklinische Studien. Hier wird beschrieben, wie PDX-Modelle erstellt werden und welche Inokulationswege am besten für präklinische Studien verwendet werden.

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

Hier stellen wir eine Standard-Pipeline vor, um murine ATC-Tumore durch spontane gentechnisch veränderte Mausmodelle zu erhalten. Des Weiteren präsentieren wir die Tumordynamik und pathologische Informationen über die primären und metastasierten Läsionen. Dieses Modell wird den Forschern helfen, die Tumorentstehung zu verstehen und die Entdeckung von Medikamenten zu erleichtern.

Spontanes Mausmodell des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms

Das vorliegende Protokoll beschreibt das Verfahren zur Etablierung eines patientenabgeleiteten Xenotransplantat-Mausmodells (PDX) unter Verwendung von humanem Osteosarkomgewebe.

Etablierung eines patienteneigenen Xenotransplantat-Mausmodells mit humanem Osteosarkomgewebe

In dieser Studie wird ein orthotopes Modell für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) vorgestellt, das auf der intrapulmonalen Inokulation von multizellulären Sphäroiden von fluoreszierenden A549-iRFP-Zellen basiert. Das Modell rekapituliert klinische NSCLC-Stadien und spricht auf Cisplatin an, entsprechend der dynamischen In-vivo-Überwachung der langwelligen Fluoreszenz.

Konstruktion eines orthotopen Xenotransplantatmodells für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, der das Fortschreiten der Krankheit nachahmt und die Wirkstoffaktivität vorhersagt

Die Entwicklung von orthotopen pädiatrischen Hirntumormodellen erfordert akribische Präzision, bei der Krebszellen mit einem stereotaktischen Gerät präzise implantiert werden. Die hier vorgestellte Methodik beschreibt die Schritte bei der Vorbereitung von Hirntumorzellen, der Durchführung intrakranieller Injektionen und der Implementierung eines postoperativen Überwachungssystems zur Beurteilung der Hirntumortransplantation.

Etablierung von orthotopen patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen für Hirntumoren mit Hilfe eines stereotaktischen Geräts

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente, nicht-chirurgische Methode zur orthotopen Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen bei Mäusen. Die Technik beinhaltet eine enzymatische Tumordissoziation, gefolgt von einer direkten Injektion in die Brustfettpolster, was eine Hochdurchsatzimplantation ermöglicht. Die umfassende Validierung gewährleistet die Modelltreue und ermöglicht strenge Studien über verschiedene Brustkrebs-Subtypen hinweg.

Hochdurchsatz-Dissoziation und orthotope Implantation von Xenotransplantaten von Brustkrebspatientinnen

Lernen Sie die Etablierung von PDX-Modellen für anaplastisches Schilddrüsenkarzinom und Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom. Diese Methode ermöglicht personalisierte Krebstherapie durch gezielte Arzneimitteltests.

Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms (Video) | JoVE Journal

Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms

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