Name: Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines 3D-gedruckten Einsatzes für Kokulturen von Endothelzellen und Keratinozyten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung parakriner Zellkommunikation und verbessert Proliferation sowie Migration in vitro.

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Diese Studie wurde in Zusammenarbeit mit BASF Beauty Care Solutions durchgeführt. Frau Charlie Colin-Pierre ist eine von BASF / CNRS finanzierte Doktorandin.
Wir danken Herrn Mehdi Sellami für die Konzeption der 3D-gedruckten Einsätze.

HINWEIS: Die 3D-Einsätze (Abbildung 1A) werden kommerziell beschafft und mit einem Photopolymerharz gedruckt, das mit Zellkultur und Autoklavieren biokompatibel ist (siehe Materialtabelle). In diesem Abschnitt wird ein detailliertes Protokoll zur Etablierung des Co-Kultur-Modells durch Inserts beschrieben (siehe Abbildung 1B). Es werden auch einige Anwendungsbeispiele bereitgestellt.
1. Einsetzen des sterilisierten Einsatzes in die 6-Well-Platten
<ol><li>Mischen Sie die beiden im Kit enthaltenen Komponenten (siehe Materialtabelle), Lebensmittelsilizium (Reagenz A) und Katalysator (Reagenz B), in einem Verhältnis von 10:1 (v/v) gemäß den Anweisungen des Herstellers. (Abbildung 1Ba). Verwenden Sie einen sterilisierten Spatel mit 70 % Ethanol, um die beiden Komponenten zu mischen. HINWEIS: Das Volumen der herzustellenden Siliziummischung hängt von der Anzahl der zu fixierenden Einsätze ab. Ein Überschuss an Katalysator kann dazu führen, dass das Siliziumgemisch zu schnell erstarrt.</li>
	<li>Bringen Sie die Einsätze mit einer Pinzette auf die Silikonmischung auf, so dass sich die Mischung homogen am unteren Rand der Einsätze verteilt (Abbildung 1Bb). Setzen Sie die Einsätze in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte ein und üben Sie sanften Druck auf die Einsätze aus, um sicherzustellen, dass die Einsätze in engem Kontakt mit der Platte stehen, um ein Auslaufen des Zellkulturmediums zu vermeiden (Abbildung 1Bc).</li>
	<li>Stellen Sie die Platte auf 37 °C, um den Erstarrungsprozess des Siliziums für 1 h zu unterstützen. HINWEIS: Die Erstarrungszeit hängt von der Menge des zugegebenen Katalysators ab.</li>
	<li>Nach dem Erstarren sterilisieren Sie die Platten mit den Einsätzen, indem Sie sie 30 Minuten bis 1 Stunde lang in ein 70%iges Ethanolbad tauchen.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Alkohol durch Pipettieren und lassen Sie die Platte über Nacht (Deckel offen) in einer Zellkulturhaube trocknen. HINWEIS: Der Alkohol muss vollständig verdampft sein, bevor der nächste Schritt durchgeführt wird, um Zellfixierung und Toxizität zu vermeiden. Die gebrauchsfertige Platte mit den Einsätzen kann vor der Verwendung unter trockenen und sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur mehrere Tage gelagert werden.</li>
</ol>2. Beschichtungen wie Poly-L-Lysin oder Poly-HEMA (optionaler Schritt)
HINWEIS: In diesem Experiment wird keine Beschichtung durchgeführt, und die Schritte werden bereitgestellt, um über die Möglichkeit der Beschichtung der Einsätze zu informieren.
<ol><li>Bereiten Sie die Beschichtungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
	<li>Berücksichtigen Sie ein Volumen von 200-400 μl für die größten Kompartimente und ein Volumen von 50-100 μl für die kleinsten Kompartimente für die Beschichtung des Einsatzes. Geben Sie die Beschichtungslösung in die einzelnen Fächer.</li>
	<li>Lassen Sie die Beschichtung nach Herstellerangaben unter sterilen Bedingungen trocknen.</li>
</ol>3. Aussaat der Zellen
<ol><li>Kultivieren Sie die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide (KORS) und humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs), wie vom Hersteller empfohlen. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, sobald die Zellen Konfluenz erreicht haben.<ol><li>Verwerfen Sie das Medium aus den Kolben und fügen Sie 5 ml Trypsin hinzu, um die Zellen zu lösen (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Den Kolben mit dem KORS 5 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2 erhitzen. Den Kolben mit den HDMECs 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Mischen Sie die Trypsinlösung, die KORS enthält, mit 5 ml mesenchymalem Stammzellmedium (MSCM), ergänzt mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) und Wachstumsfaktoren (Basalmedium mit Ergänzungskit, siehe Materialtabelle). Mischen Sie die Trypsinlösung, die die HDMECs enthält, mit 5 ml Endothelzellmedium (ECM), ergänzt mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Die Zellen werden in ein steriles konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Die KORS- und HDMEC-Suspensionen werden bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 2 mL des jeweiligen Mediums.</li>
		<li>Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblaufarbstoff (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Geben Sie 10 μl der Mischung in die Kammer des Zählobjektträgers.</li>
		<li>Legen Sie den Zählschieber in das Zellzählsystem ein (siehe Materialtabelle) und ermitteln Sie die Zellzahl und die Lebensfähigkeit.</li>
		<li>Bereiten Sie die Zellsuspension in einer Konzentration von 0,5 x 105 Zellen/ml im jeweiligen Medium vor. HINWEIS: Wenn die verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Adhärenzzeiten und/oder das Erreichen der idealen Konfluenz erfordern, kann die Zellimpfung je nach Zelltyp zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen.</li>
	</ol></li>
	<li>800 μL bis 1 mL der Zellsuspension mit einer Pipette in die einzelnen großen Kompartimente und 100-150 μL in die einzelnen kleinen Kompartimente verteilen.<ol><li>Säen Sie die KORS mit 1 x 10 5 Zellen/ml in MSC M, ergänzt mit5 % FBS und Wachstumsfaktoren in einem der großenKompartimente .</li>
		<li>Seed HDMEC in ECM , ergänzt mit 5% FBS und Wachstumsfaktoren bei 2,5 x 103 Zellen/ml in den kleinen Kompartimenten und bei 1,25 x 105 Zellen/ml in den anderen großen Kompartimenten. HINWEIS: Der Proliferationsassay kann in den kleinen Kompartimenten durchgeführt werden, und die Migrations- und Viabilitätsassays können in den großen Kompartimenten durchgeführt werden. Die Konzentration der ausgesäten Zellen wurde nach den Empfehlungen des Herstellers optimiert. Diese Konzentration ermöglicht eine gute Lebensfähigkeit der Zellen nach 24-48 h Inkubation.</li>
	</ol></li>
	<li>Platzieren Sie die Zellkulturplatte bei 37 °C mit 5 %CO2 oder unter den üblichen Bedingungen, um die Zelladhäsion und/oder -reifung zu ermöglichen. HINWEIS: Inkubieren Sie die Zellen 24-48 Stunden lang, ohne das Medium zu wechseln. Bei Bedarf kann das Medium der Fächer unabhängig voneinander gewechselt werden.</li>
</ol>4. Implementierung der Co-Kultur (Abbildung 1Bd)
HINWEIS: Die Implementierung der Co-Kultur entspricht dem Zeitpunkt, zu dem das gemeinsame Medium hinzugefügt wird. Die Hinzufügung eines einzigartigen Mediums für alle Zelltypen in den verschiedenen Kompartimenten bietet die Möglichkeit einer parakrinen Kommunikation zwischen den Zellen aufgrund des Vorhandenseins von Kommunikationsfenstern (eiförmige Löcher in den Wänden der 3D-gedruckten Einsätze). Führen Sie die Schritte 4.1 bis 4.3 aus, um die Co-Kultur zu implementieren.
<ol><li>Entleeren Sie das Nährmedium mit einer Pipette aus den verschiedenen Fächern der Einsätze. Im Falle einer 3D-Sphäroidzellkultur ist das Medium sehr vorsichtig zu entsorgen.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen mit 1 ml 37 °C warmem PBS in den großen Fächern und 200 μl 37 °C warmem PBS in den kleinen Kammern. Achten Sie auf eine sanfte Wäsche, um die Zellen nicht abzulösen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 ml eines gängigen Mediums hinzu, das so ausgewählt wurde, dass es für alle Zelltypen kompatibel ist. HINWEIS: In dieser Studie wird der basale ECM (ohne FBS und Wachstumsfaktoren) verwendet. Stellen Sie sicher, dass das Medium alle Fächer abdeckt (Ebene über den Kommunikationsfenstern [eiförmige Löcher in den Wänden], wie in Abbildung 1A dargestellt).</li>
	<li>Die Platte mit den Co-Kulturen für 24-48 h bei 37 °C mit 5 %CO2 platzieren.</li>
</ol>5. Beobachtung, Zählen und Schaben von Zellen
<ol><li>Beobachten Sie die Morphologie und zählen Sie die Zellzahl der verschiedenen Kompartimente während des Experiments unter einem Lichtmikroskop nach 24-48 h Inkubation. HINWEIS: Die erwartete Anzahl der Zellen hängt von den verwendeten Zelltypen (Größe, Morphologie usw.) und von der Kompartimentgröße ab. In diesem Experiment werden zwischen 0,5 x 10 6-1 x 10 6 KORS/ml und zwischen 0,25 x 10 6-0,75 x 10 6 HDMECs/ml in den großen Kompartimenten gezählt.</li>
	<li>Trennen Sie die Zellen mit Trypsin für die Zählung der Zellsuspensionen. HINWEIS: Berücksichtigen Sie für die Zellablösungslösung ein Volumen von 100-500 μl für die größten Kompartimente und ein Volumen von 10-50 μl für die kleinsten Kompartimente.</li>
	<li>Prüfen Sie die Viabilität mit Hilfe der Trypanblau-Färbung (siehe Schritte 3.1.6-3.1.8).</li>
</ol>6. Einlegereinigung für das Recycling
<ol><li>Entfernen Sie die Einsätze am Ende des Experiments durch eine leichte Drehung von der 6-Well-Platte (Abbildung 1Be).</li>
	<li>Entfernen Sie das Silikon von den Einsätzen, indem Sie es abziehen. Entfernen Sie bei Bedarf mit einem Spatel das restliche Silikon, das an den Wänden der Einsätze klebt (Abbildung 1Bf).</li>
	<li>Waschen Sie die Einsätze mit herkömmlichen Zellkulturreinigern und Reinigungsmitteln (Beispiel in der Materialtabelle).</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Einsätze für die spätere Verwendung in einem Autoklaven (Feststoffzyklus, 121 °C für 20 min) oder durch Eintauchen in ein 70%iges Ethanolbad für 1 h. HINWEIS: In diesem Schritt werden zwei Beispiele für mögliche Assays (Proliferations- und Migrationsassays) unter Verwendung der 3D-gedruckten Einsätze beschrieben (Abbildung 1Bd).</li>
</ol>7. Zellproliferations-Assay - WST-1-Assay
<ol><li>Befolgen Sie die Schritte 1-3.1, um die Zellen zu kultivieren. HINWEIS: Befolgen Sie den Schritt in diesem Abschnitt, um das Co-Kultursystem zu implementieren, um die Wirkung des KORS-Sekretoms auf die HDMEC-Proliferation zu untersuchen. KORS-Zellen werden verwendet, um die zuvor veröffentlichten Daten zu vergleichen8.<ol><li>Säen Sie die KORS mit 1 x 10 5 Zellen/ml in mesenchymalem Stammzellmedium (MSCM), ergänzt mit5% FBS und Wachstumsfaktoren in den großen Kompartimenten.</li>
		<li>Die Zellkulturplatte wird für 24 h bei 37 °C mit 5 % CO2 platziert.</li>
		<li>Aussaat der HDMECs in Endothelzellmedium (ECM), ergänzt mit 5% FBS und Wachstumsfaktoren bei 2,5 x 103 Zellen/ml in den kleinen Kompartimenten.</li>
		<li>Die Zellkulturplatte wird für 24-48 h bei 37 °C mit 5 %CO2 platziert.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Medien aus allen Kompartimenten und implementieren Sie das Co-Kultur-System durch Zugabe von 3 ml nicht supplementiertem basales ECM (gemeinsames Zellkulturmedium für alle Kompartimente der 3D-gedruckten Einsätze).</li>
	</ol></li>
	<li>WST-1 wird im gemeinsamen Zellkulturmedium ECM verdünnt (1:10 Endverdünnung), um die WST-1-Lösung herzustellen. HINWEIS: Bereiten Sie für das Volumen der WST-1-Lösung mindestens 500 μl zusätzliche Lösung für den Rohling vor.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Zellkulturmedium durch Pipettieren aus dem Einsatz.</li>
	<li>Geben Sie die WST-1-Lösung in die ausgewählten Kompartimente (150 μl für die kleinen Kompartimente und 600 μl für die großen Kompartimente). Die Platte wird auf 37 °C mit 5 % CO2 gestellt.</li>
	<li>Nach der optimalen 30-minütigen Zellinkubationszeit werden 100 μl des Inkubationsmediums aus jeder Bedingung auf eine 96-Well-Platte übertragen.</li>
	<li>Beurteilen Sie die kolorimetrische Reaktion mit einem Mikroplatten-Reader zwischen 420 nm und 480 nm.<ol><li>Legen Sie die Platte auf den Mikroplatten-Reader und klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Protokoll bearbeiten.</li>
		<li>Wählen Sie den spezifischen Typ der verwendeten 96-Well-Platte (siehe Materialtabelle) und die Wellenlänge von 450 nm.</li>
		<li>Klicken Sie auf den Button Messung starten.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Zellmigrationsassay - Gerät mit zwei Migrationskammern
<ol><li>Befolgen Sie die Schritte 1-3.1, um die Zellen zu kultivieren. HINWEIS: Befolgen Sie die Schritte in diesem Abschnitt, um das Co-Kultursystem zu implementieren und die Wirkung des KORS-Sekretoms auf die HDMEC-Proliferation zu untersuchen.<ol><li>Säen Sie die KORS mit 1 x 10 5 Zellen/ml in MSC M, ergänzt mit5 % FBS und Wachstumsfaktoren in einem der großenKompartimente .</li>
		<li>Die Zellkulturplatte wird für 24 h bei 37 °C mit 5 % CO2 platziert.</li>
		<li>Legen Sie die beiden Migrationskammern in das andere große Fach mit Einsätzen.</li>
		<li>Die HDMECs in ECM , ergänzt mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren, werden bei 7 x 105 Zellen/Well der beiden Migrationskammern ausgesät.</li>
		<li>Die Zellkulturplatte wird für 24 h bei 37 °C mit 5 % CO2 platziert.</li>
		<li>Entsorgen Sie das Medium und die beiden Migrationskammern nach 24 Stunden oder zu einem optimalen Zeitpunkt, je nach Zelltyp, der migriert. Implementieren Sie das Co-Kultursystem durch Zugabe von 3 ml nicht supplementiertem basalem ECM. HINWEIS: Gehen Sie vorsichtig vor, um die Zellen nicht zu lösen. Wenn die Zellen sehr empfindlich auf eine Ablösung reagieren, die durch die Zugabe von gemeinsamem Medium hervorgerufen wird, ziehen Sie die beiden Migrationskammern nach der Zugabe des gemeinsamen Mediums ab.</li>
	</ol></li>
	<li>Beobachten und fotografieren Sie die von den Zellen bedeckte Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher Vergrößerung. HINWEIS: Die Bilder wurden mit einem Phasenkontrastmikroskop aufgenommen (siehe Materialtabelle). Die Bilder werden auf einem USB-Stick gespeichert und dann vom Wundheilungswerkzeug-Plugin der Software analysiert (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Messen Sie die freigelegte Oberfläche mit einer klassischen quantitativen Analysesoftware.<ol><li>Öffnen Sie das Bild in der Software und aktivieren Sie das Wundheilungswerkzeug, das in der Makroliste verfügbar ist.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche m , um die unbedeckte Oberfläche des Migrationsbildes zu messen.</li>
		<li>Die freiliegende Fläche wird nach folgender Formel berechnet: Prozentsatz der Abdeckung = ([mittlere Fläche ohne Zellen bei T0 − Fläche ohne Zellen zum Zeitpunkt T]/mittlere Fläche ohne Zellen bei T0) × 100. HINWEIS: Die 3D-gedruckten Einsätze sind vollständig an die meisten Techniken der Zellbiologie (z. B. Pseudoröhrchenbildungsassay, 3D-Kulturen) und für biochemische Experimente (z. B. Extraktion von DNA, RNA, Protein) angepasst.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Ma, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroid+culture+of+adipose+stromal+vascular+cells+for+studying+adipogenesis+in+beef+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle.</a> Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Die indirekte Zellkommunikation wird üblicherweise mit konditionierten Medien oder Co-Kultursystemen untersucht. Die konditionierte Medienaufbereitung ist im Vorfeld der Experimente zeitaufwändig und beschränkt sich auf einseitige Effektanalysen. Die vorherige Studie von Colin-Pierre et al.8 unter Verwendung konditionierter Medien wurde die indirekte Zellkommunikation zwischen zwei Zelltypen (HDMECs und KORS) durchgeführt. Die Daten dieser früheren Studie zeigten die Wirkung von KORS-kond...

In vivo kommunizieren Zellen entweder direkt (Zellkontakt) oder indirekt (durch Sekretion von Molekülen) miteinander. Um die Zellkommunikation zu untersuchen, können verschiedene Kokulturmodelle entwickelt werden, wie z. B. die direkte Co-Kultur (die verschiedenen Zelltypen befinden sich in direkter Interaktion im selben Well) und die kompartimentierte Co-Kultur (die verschiedenen Zelltypen befinden sich in indirekter Wechselwirkung in verschiedenen Kompartimenten eines Kultursystems)1. Darüber hinaus können konditionierte Medien für Co-Kultursysteme verwendet werden, bei denen die indirekte Wechselwirkung dadurch ermöglicht wird, dass sezernierte Moleküle, die in den konditionierten Medien eines Effektorzelltyps enthalten sind, auf eine Responderzelle Typ1 übertragen werden.
Im Falle von parakrinen Zellkommunikationsstudien liefern indirekte Co-Kultursysteme Modelle, die Zellinteraktionen in vivo stark widerspiegeln. Indirekte Kokultursysteme wurden entwickelt und kommerzialisiert, was die Etablierung indirekter Cokulturmodelle ermöglicht 2,3. Leider bieten die meisten indirekten Co-Kultursysteme nur zwei Kompartimente. Andere indirekte Co-Kultur-Systeme bieten mehrere Kompartimente, aber sie sind weniger skalierbar im Vergleich zu dem System, über das im vorliegenden Manuskript berichtet wird. Einige von ihnen erlauben keine klassische Visualisierung unter dem Mikroskop und stellen oft spezifische Anwendungsmethoden vor. In mehreren Studien wird die parakrine Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen mit dem konditionierten Medienmodell 4,5,6,7 untersucht. Dies ist eine einfachere Art der Untersuchung im Vergleich zu indirekten Co-Kultursystemen, da keine spezifischen Methoden oder Materialien festgelegt werden müssen1. Auf der anderen Seite ist die Herstellung von konditionierten Medien zeitaufwändig und liefert nur Informationen über die einseitige Zellsignalisierung (Effektor zu Responder)1.
In dieser Arbeit wird ein neuer, einfacher Weg zur Untersuchung der Zellkommunikation vorgeschlagen. Durch die Kombination mehrerer Zelltypen in direkter oder indirekter Interaktion und in 2D- oder 3D-Formaten bieten die gedruckten Inserts zahlreiche Vorteile für den einfachen Aufbau von Co-Kulturmodellen. Der 3D-gedruckte Einsatz ist für die Platzierung in den Vertiefungen von 6-Well-Platten geeignet und ist kreisförmig und ermöglicht die Trennung des Wells in vier Kammern (zwei große Fächer und zwei kleine Fächer; Abbildung 1A). Die 3D-gedruckten Einsätze zeichnen sich durch das Fehlen eines Bodens aus. Somit stehen die Zellen in direktem Kontakt mit der Platte, auf der der Einsatz platziert wird. Darüber hinaus kann jedes Fach unabhängig von den anderen beschichtet werden. Darüber hinaus kann das Zellverhalten leicht unter dem Lichtmikroskop verfolgt werden. Das Vorhandensein von Kommunikationsfenstern in jeder Wand des Einsatzes ermöglicht es, zum optimalen Zeitpunkt ein gemeinsames Medium hinzuzufügen, um verschiedene Experimente der Co-Kultur durchzuführen. Zahlreiche Kombinationen von Kokulturen können durchgeführt werden, um die direkte und/oder indirekte Kommunikation zwischen mehreren Zelltypen zu untersuchen. So kann beispielsweise ein Modell der indirekten Co-Kultur zwischen vier verschiedenen Zelltypen in Monolayer und/oder in 3D (Sphäroide) entworfen werden. Eine Kombination aus direkten und indirekten Kokulturmodellen kann auch durch das Mischen verschiedener Zelltypen im selben Kompartiment durchgeführt werden. Die Wirkung komplexer Strukturen (Organoide, Gewebeexplantation usw.) auf verschiedene Zelltypen könnte ein weiteres Beispiel für Modelle sein, die erstellt werden können. Darüber hinaus sind die 3D-gedruckten Inserts kompatibel mit zellbiologischen Funktionsassays (Proliferation, Migration, Pseudoröhrenbildung, Differenzierung usw.) und mit biochemischen Tests (Extraktion von DNA, RNA, Protein, Lipiden usw.). Schließlich bieten die 3D-gedruckten Inserts eine breite Palette von experimentellen Schemata von Co-Kulturmodellen mit der Möglichkeit, gleichzeitig verschiedene Assays im selben Experiment in den verschiedenen Kompartimenten zu kombinieren.
Einige Kapazitäten der 3D-gedruckten Einsätze werden vorgestellt, um sie als schnelles und einfach zu bedienendes Co-Kulturmodell zu validieren. Im Vergleich zu einer bereits veröffentlichten Studie zur parakrinen Zellkommunikation wird die Fähigkeit der 3D-gedruckten Inserts als wertvolles Co-Kultur-Modell demonstriert. Um diesen Punkt zu beurteilen, wurde die Regulation der Endothelzellproliferation und -migration durch Keratinozyten zwischen dem 3D-gedruckten Insert-System und dem klassischen System unter Verwendung konditionierter Medien verglichen. Die 3D-gedruckten Einsätze ermöglichen es, im Vergleich zum herkömmlichen System mit konditionierten Medien schnell ähnliche Ergebnisse zu erzielen. In der Tat bieten die 3D-gedruckten Inserts ein robustes Modell, um Zellinteraktionen in beide Richtungen zu untersuchen, ohne dass konditionierte Medien hergestellt werden müssen, und mit der Möglichkeit, die Proliferations- und Migrationsassays im selben Experiment parallel durchzuführen.
Abschließend wird in dieser Arbeit ein neues und gebrauchsfertiges Modell zur Untersuchung der Zellkommunikation vorgeschlagen. Die 3D-gedruckten Einsätze sind mit allen adhärenten Zelltypen kompatibel und ermöglichen die Durchführung zahlreicher Kombinationen von Co-Kulturen, die darauf abzielen, näher an In-vivo-Bedingungen zu sein.

<table><tbody><tr><td>Autoklav</td><td>Getinge</td><td>APHP</td><td>Solid cycle, 121 &deg; C für 20 min</td></tr><tr><td>Biomed Clear</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>Abformung durchgeführt von der Firma 3D-Morphoz (Reims, Frankreich)</td></tr><tr><td>Zellkultur-Detergenzien&nbsp;</td><td>Tounett</td><td>A18590/0116</td><td></td></tr><tr><td>Zellproliferationsreagenz WST-1</td><td>Roche</td><td>11,64,48,07,001</td><td></td></tr><tr><td>Zählobjektträger</td><td>NanoEnTek</td><td>EVE-050</td><td></td></tr><tr><td>Kultur-Einsatz 2 Well in &mu;-Schale 35 mm</td><td>Ibidi</td><td>80206</td><td>Gerät mit zwei Migrationskammern.&nbsp;</td></tr><tr><td>Endothelzellmedium</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td>Basalmedium +/- 25 ml fötales Rinderserum (FBS, 0025), 5 ml Endothelzellwachstumsergänzung (ECGS, 1052) und 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung (P/S, 0503).</td></tr><tr><td>EVE Automatisierter Zellzähler</td><td>NanoEnTek</td><td>NESCT-EVE-001E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core</td><td>Fisher</td><td>Scientific AMEX1200</td><td>10-fache Vergrößerung</td></tr><tr><td>Silikon-Reagenzien- und Katalysator-Kit für Lebensmittel</td><td>Artificina</td><td>RTV 3428 A und B&nbsp;</td><td>(10:1)</td></tr><tr><td>FORM 3B Drucker</td><td>Formlabs</td><td>PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC</td><td>Abformung durchgeführt von der Firma 3D-Morphoz</td></tr><tr><td>Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC)</td><td>ScienCell</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS)</td><td>ScienCell</td><td>2420</td><td></td></tr><tr><td>Macro Wound Healing Tool Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Software zur Messung der unbedeckten Oberfläche (für Assays)</td></tr><tr><td>Mesenchymales Stammzellmedium&nbsp;</td><td>ScienCell</td><td>7501</td><td>Basalmedium +/-25 ml fötales Rinderserum (FBS, 0025), 5 ml Nahrungsergänzungsmittel für mesenchymale Stammzellen (MSCGS, 7552) und 5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung (P/S, 0503)</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader SPECTRO star NANO</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>BMG LABTECH Software</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Promocell</td><td>C-40232</td><td>Ohne Ca2+ / Mg2+</td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>NanoEnTek</td><td>EBT-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin / EDTA</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td>Inkubation von KORS bei 37 &°; C mit 5% CO2 für 5 min. Inkubation von HDMECs für 5 Minuten bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>96-Well-Platte Nunclon Delta Surface</td><td>Thermoscientific</td><td>167008</td><td></td></tr></tbody></table>

ein innovativer 3d-gedruckter einsatz, der für einfache 2d- und 3d-zellkulturen entwickelt wurde

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

Die klassischen Analysen der indirekten Kommunikation zwischen verschiedenen Zelltypen erfordern den Einsatz konditionierter Medien. Darüber hinaus ist die Herstellung von konditionierten Medien nach wie vor zeitaufwändig und weit entfernt von physiologischen und pathologischen Zuständen. Obwohl einige Modelle der Co-Kultur kommerziell erhältlich sind, bleiben sie auf spezifische Assays beschränkt und eignen sich hauptsächlich für zwei Arten von Zellen. 
Hier kommen 3D-gedruckte Inserts zum Einsatz, die mit zahlreichen funktionellen Assays kompatibel sind. Der Einsatz ermöglicht die Aufteilung einer Vertiefung einer 6-Well-Platte in vier Kammern. Eine Vielzahl von Kombinationen kann eingestellt werden. Darüber hinaus sind in jeder Wand der Kompartimente Fenster so gestaltet, dass eine potentielle interzelluläre Kommunikation zwischen jedem Kompartiment im Nährmedium volumenabhängig möglich ist. Zum Beispiel kann die parakrine interzelluläre Kommunikation zwischen vier Zelltypen in Monolayern, in 3D (Sphäroide) oder durch Kombination beider untersucht werden. Darüber hinaus kann ein Mix aus verschiedenen Zelltypen im selben Kompartiment im 2D- oder 3D-Format (Organoide) ausgesät werden. Das Fehlen eines Bodens in den 3D-gedruckten Einsätzen ermöglicht die üblichen Kulturbedingungen auf der Platte, eine mögliche Beschichtung auf der Platte, die den Einsatz enthält, und eine direkte Visualisierung durch optische Mikroskopie. Die Mehrfachkompartimente bieten die Möglichkeit, verschiedene Zelltypen unabhängig voneinander zu sammeln oder in jedem Kompartiment unterschiedliche Reagenzien für die RNA- oder Proteinextraktion zu verwenden. In dieser Studie wird eine detaillierte Methodik vorgestellt, um den neuen 3D-gedruckten Einsatz als Co-Kultursystem zu verwenden. Um die verschiedenen Fähigkeiten dieses flexiblen und einfachen Modells zu demonstrieren, wurden zuvor veröffentlichte funktionelle Assays der Zellkommunikation in den neuen 3D-gedruckten Inserts durchgeführt und als reproduzierbar nachgewiesen. Die 3D-gedruckten Einsätze und die konventionelle Zellkultur mit konditionierten Medien führten zu ähnlichen Ergebnissen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich bei dem 3D-gedruckten Einsatz um ein einfaches Gerät handelt, das an zahlreiche Modelle von Co-Kulturen mit adhärenten Zelltypen angepasst werden kann.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein optimiertes Co-Kultursystem beschrieben, um durch die Verwendung von konditionierten Medien robuste, zuverlässige und signifikante Daten zu erhalten, die mit klassischen Methoden vergleichbar sind. Die 3D-gedruckten Inserts ahmen die in vivo Mikroumgebungsbedingungen verschiedener Zelltypen im Zusammenspiel nach, indem sie die Schwierigkeiten und die zeitaufwändige Herstellung von konditionierten Medien im Vorfeld der Experimente überwinden. Eine zuvor veröffentlichte Studie ...

In dieser Arbeit wird ein neu entworfener 3D-gedruckter Einsatz als Modell der Co-Kultur vorgestellt und durch die Untersuchung der parakrinen interzellulären Kommunikation zwischen Endothelzellen und Keratinozyten validiert.

Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

Dieses Protokoll kann zur Untersuchung zahlreicher Kulturstudien verwendet werden und bietet ein neues Werkzeug zur Untersuchung der direkten Zellkommunikation. Dieses neue Gerät spart viel Zeit bei der Erstellung eines Kulturmodells und ist auf verschiedene Zelltypen anwendbar, die eine bestimmte Beschichtung benötigen oder nicht. Die vier Kompartimente der 3D-gedruckten Einsätze ermöglichen es nämlich, verschiedene Zelltypen in Monolayern oder in 3D auf die gleiche Weise mit verschiedenen Kombinationen zu kultivieren.Die 3D-gedruckten Einsätze sind langlebiger, flexibler, skalierbarer und können zur Entwicklung von experimentellen Modellen für die Untersuchung von Physiopathologien wie Immunologie oder Androgenese verwendet werden. Mischen Sie zunächst die beiden im Kit enthaltenen Komponenten, Lebensmittelsilizium und Katalysator, in einem Verhältnis von 10:1 mit einem sterilisierten Spatel mit 70 % Ethanol gemäß den Anweisungen des Herstellers. Tragen Sie die Einsätze mit einer Pinzette auf die Silikonmischung auf, so dass sich die Mischung homogen am unteren Rand des Einsatzes verteilt.Setzen Sie die Einsätze in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte ein und üben Sie sanften Druck aus, um sicherzustellen, dass die Einsätze in engem Kontakt mit der Platte stehen, um ein Auslaufen des Zellkulturmediums zu vermeiden. Stellen Sie die Platte auf 37 Grad Celsius, um den Erstarrungsprozess des Siliziums eine Stunde lang zu unterstützen. Nach dem Erstarren sterilisieren Sie die Platten mit den Einsätzen, indem Sie sie 30 Minuten bis zu einer Stunde lang in ein 70%iges Ethanolbad tauchen.Als nächstes entsorgen Sie den Alkohol durch Pipettieren und lassen die Platte über Nacht in einer Zellkulturhaube trocknen. Um die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide und der menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen zu kultivieren, entsorgen Sie das Medium aus den Kolben und fügen Sie fünf Milliliter Trypsin hinzu, um die Zellen abzulösen. Den Kolben mit den Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid erhitzen und den Kolben mit den menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.Mischen Sie in einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen die Trypsinlösung, die die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide enthält, mit fünf Millilitern mesenchymalem Stammzellmedium, das mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren ergänzt ist, und die menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen mit fünf Millilitern Endothelzellmedium, ergänzt mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren. Die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide und humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellsuspensionen werden bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern ihres jeweiligen Mediums.Mischen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblaufarbstoff und geben Sie 10 Mikroliter der Mischung in die Kammer des Zählobjektträgers. Setzen Sie den Zählschieber in das Zellzählsystem ein und ermitteln Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit. Nach der Herstellung der Zellsuspension bei einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter im jeweiligen Medium verteilen Sie 800 Mikroliter bis einen Milliliter der Zellsuspension in die einzelnen großen Kompartimente und 100 bis 150 Mikroliter in die einzelnen kleinen Kompartimente mit einer Pipette.Sehen Sie sich die Keratinozyten in mesenchymalem Stammzellmedium an, die mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren ergänzt werden, und die humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen in Endothelzellmedium, ergänzt mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren in den kleinen und anderen großen Kompartimenten. Platzieren Sie die Zellkulturplatte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid oder unter den üblichen Bedingungen, um die Zelladhäsion und/oder -reifung zu ermöglichen. Entleeren Sie das Nährmedium mit einer Pipette aus den verschiedenen Fächern der Einsätze.Dann spülen Sie die Zellen mit einem Milliliter 37 Grad Celsius warmem PBS in den großen Fächern und 200 Mikrolitern in den kleinen Fächern. Fügen Sie drei Milliliter eines gängigen Mediums hinzu, das so ausgewählt wurde, dass es für alle Zelltypen kompatibel ist. Stellen Sie die Platte mit den Co-Kulturen 24 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid auf.Trennen Sie die Zellen mit Trypsin für die Zellsuspensionszählung ab und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Färbung. Nach der Beobachtung der Morphologie wird die Zellzahl der verschiedenen Kompartimente während des Experiments unter einem Lichtmikroskop nach 24 bis 48 Stunden Inkubation gezählt. Entfernen Sie zunächst die Einsätze am Ende des Experiments durch eine leichte Drehung von der Sechs-Well-Platte und entfernen Sie dann das Silikon von den Einsätzen, indem Sie es abziehen.Waschen Sie die Einsätze mit herkömmlichen Zellkulturreinigern und Reinigungsmitteln. Sterilisieren Sie dann die Einsätze für die zukünftige Verwendung in einem Autoklaven oder tauchen Sie sie eine Stunde lang in ein 70%iges Ethanolbad. Der Phänotyp und die Zellviabilität wurden verglichen, wobei eine Lebensfähigkeit von 90 % in den Wells der sechs Well-Platten und 91 % in den 3D-gedruckten Inserts für Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide beobachtet wurde.Die Lebensfähigkeit menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen betrug 85 % in den Vertiefungen der Sechs-Well-Platte, während 86 % in den 3D-gedruckten Einsätzen lagen. Die indirekte Zellkommunikation zwischen Keratinozyten und Endothelzellen in den 3D-gedruckten Inserts zeigte, dass in Gegenwart von Keratinozyten in den Inserts die Proliferation der humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen nach 24 Stunden signifikant um das 1,5-fache und nach 48 Stunden um das 3,1-fache im Vergleich zur Kontrolle zunahm. Es wurde jedoch gezeigt, dass der Keratinozyt des äußeren Wurzelscheidenbedingungsmediums die Proliferation menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen nach 24 Stunden um das 1,5-fache und nach 48 Stunden um das 2,1-fache erhöht.Das 3D-gedruckte Insert-Co-Kulturmodell wurde getestet, um die Wirkung von Keratinozyten auf die Migration menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen zu bestimmen. In der Kontrollbedingung wanderten die Endothelzellen und bedeckten nach 24 Stunden etwa 44 % der Wundfläche. In Gegenwart von Keratinozyten wurde ein signifikanter Anstieg der Migration menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen beobachtet, was zeigt, dass 43 %, 67 % und 99 % der Wundfläche nach drei, 12 bzw. 24 Stunden bedeckt waren.In ähnlicher Weise nimmt die Migration von HDMECs in Gegenwart von Keratinozyten des äußeren Wurzelscheidenbedingungsmediums zu. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Abdichtung des Einsatzes an der Platte sicherzustellen, um das Austreten des Zellmediums von einem Kompartiment in ein anderes zu verhindern. Es könnten verschiedene Anwendungen durchgeführt werden, wie z. B. Proliferations-, Migrations-, Sedativbildungsassays für DNA-, RNA-, Protein- und andere Analysen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Mikro-Bioreaktoren. Ein Chip kann bis zu 10 Mio. Zellen, die unter genau definierten Bedingungen im Hinblick auf die Strömung, Sauerstoffspannung etc. in einem sterilen, geschlossenen Kreislauf kultiviert werden können.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Wir berichten über eine Vorrichtung und ein neues Verfahren Zellen und Embryonen zu untersuchen. Einzelne Zellen werden in Mikroresonator-Arrays genau bestellt. Ihre 3D Haft ist ein Schritt in Richtung 3D-Umgebungen unter physiologischen Bedingungen auf und lässt zu Organell Orientierung. Durch die Steuerung der Zellform, minimiert diese Setup-Variabilität in Standardtests berichtet.

Bestellen Einzelzellen und Einzel Embryos in 3D Confinement: Ein neues Gerät für High Content Screening

In mehrzelligen Organismen lösen sekretierte lösliche Faktoren Reaktionen von verschiedenen Zelltypen als Ergebnis der parakrinen Signalübertragung aus. Insert-Co-Kultursysteme bieten eine einfache Möglichkeit, die Veränderungen zu beurteilen, die durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden.

Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe in variablen Größen mit einer angepassten 3D-gedruckten Kunststoff-Formenbau. PDMS-negative sind in der Form 3D-gedruckten geheilt; dann wird Agarose in die ausgehärtete PDMS negative gegossen. Zellen sind in die resultierende Agarose-Brunnen gesät, wo sie ins Gewebe Ringe aggregieren.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Wir präsentieren Ihnen ein Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix, eine wiederholbare Musterbildung zu erhalten. Eine kubische Gerät mit zwei verschiedenen Hydrogele wird eingesetzt, um Multi-direktionalen Imaging für Gewebebildung Muster zu erreichen.

Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

In dieser Arbeit wird ein Herstellungsprotokoll für eine neue Art von Kultursubstrat mit Hunderten von Mikrobehältern promm2 vorgestellt, in dem Organoide kultiviert und mittels hochauflösender Mikroskopie beobachtet werden können. Die Zellimpf- und Immunfärbungsprotokolle sind ebenfalls detailliert.

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie die Herstellung eines 3D-gedruckten Einsatzes für Kokulturen von Endothelzellen und Keratinozyten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung parakriner Zellkommunikation und verbessert Proliferation sowie Migration in vitro.

Ein innovativer 3D-gedruckter Einsatz, der für einfache 2D- und 3D-Zellkulturen entwickelt wurde

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