Analyse und Bildgebung von Osteozyten

Es wird postuliert, dass die Scherspannung der Strömung ein Mechano-Stimulator von Osteozyten ist. Da eine direkte Messung keine Option ist, sind konfokale bildabgeleitete Modelle von Osteozyten ein wertvolles Werkzeug für die Durchführung von numerischen Strömungsanalysen, um die Spannungen der Fluidströmung auf die dendritischen Membranen der Osteozyten zu bewerten. Ein Teil der in unserem Labor durchgeführten Arbeiten entspricht den jüngsten Entwicklungen auf diesem Gebiet, bei denen die tatsächliche Morphologie der Osteozyten-Lücken, einschließlich der Tortuosität und Dichte der Dendriten, zusammen mit dem Knochen und dem lakunar-kanalikulären Netzwerk verwendet wird, um die Scherspannung des Flüssigkeitsflusses und die Stellen in der dendritischen Struktur der Osteozyten numerisch zu bestimmen, an denen die Spannung hoch ist.

Zu den aktuellen Technologien gehören verschiedene computergestützte Modellierungen, wie z. B. die abschließende Elementanalyse, die numerische Strömungsmechanik, die Wechselwirkung zwischen der Fluidstruktur, die bildbasierte Modellierung, einschließlich Röntgen- oder Konfokalmikroskop für genaue 3D-Modelle, und mechanische Prüfsysteme zur Validierung der Modelle durch Messung von Knochenreaktionen, wie z. B. Dehnungen unter kontrollierten Belastungsbedingungen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Verlust von Dendriten aufgrund von Alterung oder Knochenerkrankungen ein Faktor dafür ist, dass die Knochen weniger auf körperliche Aktivität reagieren. Wir haben vorhergesagt, dass Osteozyten mechanische Belastungen durch Bereiche mit hoher Scherbelastung durch hohe Flüssigkeitsströmung, die Dendriten, erkennen.

Und die Scherspannung der Fluidströmung korreliert mit der lakunaren Morphologie, insbesondere der Oberfläche. Mit der Etablierung dieses Protokolls arbeiten wir nun an einem NIH-Projekt zur Untersuchung der Scherspannung der Flüssigkeitsströmung in den Osteozytendendriten von Mäuseknochen zweier verschiedener Altersgruppen und Geschlechter. Diese Studie wird dazu beitragen, zu bestimmen, wie sich Alterung und Geschlechtsunterschiede auf die Mechano-Transduktion im Knochen aufgrund von Belastung auswirken.

Zu Beginn fixieren Sie den von der Maus gesammelten Oberschenkelknochen in kaltem 4%-Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung für 24 Stunden bei vier Grad Celsius unter leichtem Schaukeln. Spülen Sie am nächsten Tag die knochen- und phosphatgepufferte Kochsalzlösung und betten Sie sie schnell in ein schnell polymerisierendes Acryl ein. Dicke 300-Mikrometer-Querscheiben über dem dritten Trochanter schneiden.

Polieren Sie die Knochenabschnitte mit Schleifpapier auf eine endgültige Dicke von 90 bis 100 Mikrometern. Spülen Sie dann die polierten Abschnitte jeweils fünf Minuten lang mit 70 %, 95 % und 100 % Ethanol ab. Die Abschnitte in 1%fit C in 100%Ethanol vier Stunden lang im Dunkeln unter mäßigem Schütteln färben.

Waschen Sie anschließend die Abschnitte gründlich in 100%igem Ethanol. Trocknen Sie sie über Nacht an der Luft, bevor Sie sie in einen Tropfen Umhängemittel auf einem Objektträger legen. Montieren Sie ein Deckglas auf die Probe.

Stellen Sie an einem konfokalen Mikroskop einen 488-Nanometer-Laser für die Anregung und ein Emissionssammelfenster von 496 bis 596 Nanometern ein. Nehmen Sie zunächst ein Bild mit geringer Vergrößerung des gesamten Knochenabschnitts mit dem 5-fach-Objektiv auf. Nehmen Sie dann Bilder der drei interessierenden Regionen mit dem 20-fach-Objektiv auf.

Verwenden Sie ein Ölobjektiv mit 100 x 1,44 numerischer Apertur mit einem Digitalzoom von 1,7 und einer Schrittweite von 0,126 Mikrometern, um detaillierte Z-Stapel von 400 Z-Ebenen mit einer Pixelauflösung von 1024 x 1024 Pixeln und einer Pixelauflösung von 0,089 Mikrometern zu erfassen. Für die Computermodellierung von Maus-Osteozyten öffnen Sie die ImageJ-Software, nachdem Sie gesammelte Z-Stapelbilder des Mausfemurs im TIFF-Format importiert haben, und passen Sie den Schwellenwert im Abschnittsmenü an, um die Intensitätsgrenzen für die Aufnahme in eine Maske zu ändern. Schneiden Sie mit der Schnittmaske eine Lücke mit ihren Canaliculi als interessierenden Bereich ab.

Umhüllen Sie die Lücke in einem imaginären größeren Würfel mit Seitenlängen von 21, 14 und 19 Mikrometern. Führen Sie einen Vorgang zum Vergrößern des Bereichs durch, um die verbundenen Pixelbereiche auszuwählen und ein einheitliches lakunarkanalikuläres Netzwerk (LCN) zu erstellen. Wandeln Sie anschließend mit der Operation "Berechneter Teil" die lakunarkanalikuläre Maske in ein Objekt um.

Reduzieren Sie das LCN-Volumen mit der Glättungsoperation, um die Osteozyten- und dendritischen Membranen aufzubauen. Exportieren Sie dann die Objekte. Kombinieren Sie zwei Oberflächen der dendritischen Membranen LCN und Osteozyten zu einer Oberfläche.

Verwenden Sie nun die Remesh-Operation, um ein volumetrisches Modell des lakunaren Kanalikularraums zu erstellen. Exportieren Sie das Modell als STL-Datei, und passen Sie den Objektmaßstab auf Mikrometer an. Wählen Sie in einer dreidimensionalen bildbasierten Verarbeitungssoftware das volumetrische Modell des lakunar-kanalikulären Raums der Maus als Basismodell, um unterschiedliche Osteozytenmodelle zu erstellen.

Wählen Sie einen niedrigeren Schwellenwert, um die Lichtintensität des Bildes zu verringern und eine Lücke mit weniger Canaliculi zu erhalten. Als nächstes entwickeln Sie Osteozytenmodelle mit unterschiedlichen lakunar-kanalikulären Raumdicken oder Dendritenkanaldurchmessern. Bauen Sie größere oder kleinere Osteozytenmodelle durch Wickeln bzw. Glätten.

Um eine Fluidströmung in der Simulationssoftware zu erzeugen, importieren Sie die entwickelten konfokalen bildbasierten Geometrien in die CFX-Software. Stellen Sie die Abmessungen der Einheit auf Nanometer ein. Klicken Sie anschließend auf Subtrahieren, um einen einzelnen Körper des lakunaren Kanikularraums zu erhalten.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die generierte Facette und konvertieren Sie sie von Facetten in eine feste Domäne, ohne Flächen zusammenzuführen. Klicken Sie auf Netz und wählen Sie lineare tetraedrische Elemente mit einer Elementgröße von 0,06 Mikrometern aus. Verfeinern Sie das Netz mit einer Netzkonvergenzstudie.

Wählen Sie nun die Oberfläche aus und wählen Sie die Canaliculi auf der Oberseite des imaginären Würfels als flüssige Einlässe. Wählen Sie mit dem Kasten die Kanonikul auf den anderen fünf Flächen als Flüssigkeitsauslässe. Exportieren Sie dann das Netz.

Nachdem Sie eine weitere Fluidströmung erstellt haben, importieren Sie das fließende Netz in den Setup-Bereich von CFX. Definieren Sie mit der Option Berandung einfügen zwei Randbedingungen für Ein- und Auslässe für die Flächen. Üben Sie einen Flüssigkeitseinlassdruck von 300 bzw. null Pascal auf die Ein- und Auslässe aus.

Behandeln Sie die restlichen Flächen wie rutschfeste Wände. Behandeln Sie die interstitielle laminare Flüssigkeit aus der Materialbibliothek wie Wasser. Legen Sie die Abschnitte Wärmeübertragung, Verbrennung und Wärmestrahlung auf keine fest.

Wählen Sie Turbulenz als Fluidkennlinie im LCN aus. Führen Sie als Nächstes die Software mit doppelter Genauigkeit und Direktstart als Übermittlungstyp aus. Fügen Sie eine neue Kontur in den Ergebnisbereich der CFD-Software ein.

Erstellen Sie eine Fluidströmungsschubspannung oder FFSS-Kontur, indem Sie die Wandscherung auf den dendritischen Membranen der Osteozyten als Variable in der Domäne auswählen. Fügen Sie als Nächstes eine Kontur der Geschwindigkeitsstromlinien innerhalb des lakunar-kanalikulären Bereichs ein, beginnend mit den Einlässen. Die durchschnittliche FFSS auf Osteozyten und dendritischen Membranen im jungen Osteozytenmodell betrug 0,42 Pascal, was signifikant höher war als 0,13 Pascal im gealterten Osteozytenmodell.

Die FFSS nahm in Osteozyten mit größerem lakunarem Kanalraum zu, wie in Modell sieben und Modell acht zu sehen war, wo Modell acht die höchste FFSS aufwies. Die niedrigsten FFSS-Werte von 0,19 Pascal und 0,13 Pascal wurden in Modell zwei bzw. Modell vier mit der geringsten kanalikulären Dichte beobachtet. Es wurde keine signifikante Veränderung des FFSS mit zunehmendem Dendritendurchmesser beobachtet, wie in den Modellen fünf und sechs zu sehen war.