Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop

Unser Protokoll bietet eine Möglichkeit, die neuronale Reaktion auf mechanischen Stress in einer lebenden Maus zu visualisieren, was einen direkten Beweis dafür liefern kann, wie sich ein Schädel-Hirn-Trauma auf das Gehirn auswirkt. Mit dieser Technik kann das Zielprotein an der gleichen Stelle im Gehirn desselben Tieres sowohl für die akute als auch für die chronische Phase nach einem Schädel-Hirn-Trauma überwacht werden. Das interessierende Gen und der Viruspromotor können entsprechend verändert werden, um andere Proteine in den spezifischen Zelltypen im Gehirn zu untersuchen.

Tragen Sie zunächst eine Augensalbe auf die Augen der betäubten Maus auf. Entferne die Haare vom Oberkopf, indem du sie mit einer normalen Schere schneidest. Nach dem Anlegen eines 12 bis 15 Millimeter langen Mittellinienschnitts wird die Haut über der linken und rechten Schädelhälfte mit einer gebogenen Federschere herausgeschnitten.

Sobald der Schädel freigelegt ist, entfernen Sie die Knochenhaut, indem Sie sie vorsichtig mit dem sterilen Applikator mit Baumwollspitze reiben und mit steriler Kochsalzlösung spülen. Sobald der Schädelbereich getrocknet ist, markieren Sie die Einschlagstelle des Schädel-Hirn-Traumas (SHT) an den Koordinaten 2,5 Millimeter hinter dem Bregma und zwei Millimeter lateral von der sagittalen Naht nach rechts. Nehmen Sie die Maus schnell aus dem stereotaktischen Rahmen und legen Sie den Kopf auf das Pufferkissen unter dem TBI-Gerät.

Richten Sie die Impaktorspitze an der markierten Aufprallstelle aus. Heben Sie die Metallsäule an, indem Sie die angebundene Nylonschnur 15 Zentimeter über den Mauskopf ziehen, und lassen Sie sie dann los, so dass das Gewicht frei auf die Schallkopfstange fallen kann, die an der Schädelstelle in Kontakt mit der Schädeldecke steht. Legen Sie den Kopf der anästhesierten Maus auf den stereotaktischen Rahmen, der unter dem Operationsmikroskop gehalten wird.

Bohren Sie die Schädeloberfläche vorsichtig und langsam mit einem FG4-Hartmetallbohrer bei niedriger Rotordrehzahl, um die verbleibende Knochenhaut zu entfernen, und schaffen Sie eine raue Schädeloberfläche, so dass sich der Zahnzement sicher mit dem Schädel verbindet. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um Knochenstaub von der Schädeloberfläche zu spülen und zu entfernen. Um die seitlichen Muskeln vom Schädel zu trennen, etwa fünf Millimeter hinter dem Auge, wo sich die Naht zwischen Scheitel- und Schläfenschädel befindet, führen Sie die feinen geschlossenen Spitzen vorsichtig ein und bewegen Sie die geschlossenen Spitzen vorsichtig in die hintere Richtung bis zur Lambdoid-Naht.

Trennen Sie die seitlichen Muskeln auf der Seite, auf der die Implantation des Schädelfensters stattfinden wird. Waschen Sie die Ablagerungen mit Kochsalzlösung von der Operationsstelle ab und trocknen Sie den Bereich mit Gaze. Um den Kopfpfosten zu implantieren, markieren Sie den Mittelpunkt 2,5 Millimeter hinter dem Bregma und 1,5 Millimeter von der sagittalen Naht auf der rechten Hemisphäre entfernt mit einem Markerstift und einem chirurgischen Messschieber.

Zeichnen Sie dann den Umfang der Kraniotomie auf dem sauberen und trockenen Schädel nach. Lockern Sie die Ohrstange und drehen Sie den Kopf, so dass die Kraniotomieebene perfekt horizontal ist, und ziehen Sie dann die Ohrstange wieder fest. Verwende das Holzstäbchen eines Applikators mit Baumwollspitze, um zwei kleine Tropfen Sekundenkleber auf die vordere und hintere Kante des Kopfpfostens zu geben.

Positionieren Sie den Kopfpfosten aus Titan über der Mitte der Kraniotomie und stellen Sie ihn schnell so ein, dass er in derselben Ebene liegt, in der das Schädelfenster implantiert wird. Übe leichten Druck aus, bis der Sekundenkleber getrocknet ist, was in der Regel etwa 30 Sekunden dauert. Bereiten Sie Zahnzement in einer vorgekühlten Keramikschale vor, indem Sie 300 Milligramm Zementpulver, sechs Tropfen QuickBase-Flüssigkeit und einen Tropfen Katalysator gründlich mischen.

Tragen Sie schnell eine großzügige Menge Zahnzementmischung auf den äußeren Umfang des nachgezeichneten Umfangs auf und decken Sie die freiliegende Knochenoberfläche ab. Decken Sie jedoch nicht die Stelle der Kraniotomie ab. Lassen Sie die Ohrstange los und befestigen Sie den Kopfbügel am Metallrahmen, um sicherzustellen, dass der Kopf für ein präzises Bohren entlang des markierten Kraniotomieumfangs stabil ist.

Um die Kraniotomie durchzuführen, verwenden Sie einen chirurgischen Messschieber, um den Durchmesser des markierten Kreises wie zuvor gezeigt zu überprüfen, und stellen Sie ihn bei Bedarf so ein, dass das Schädelfenster genau in die Kraniotomie passt. Ätzen und verdünnen Sie den Schädel mit einem elektrischen Zahnbohrer entlang der Außenseite des markierten Kreises mit einem FG4-Hartmetallbohrer, wodurch eine Spur entsteht, innerhalb derer der Schädel ausgedünnt werden kann. Bewässern Sie den Bereich mit Kochsalzlösung, um den Knochenstaub wegzuspülen.

Fahren Sie mit der Verdünnung des Schädels mit einem FG 1/4 Hartmetallbohrer fort, bis der Schädel hauchdünn und durchsichtig ist. Beenden Sie regelmäßig das Bohren und spülen Sie den gesamten Bereich erneut mit steriler Kochsalzlösung, um die Erwärmung durch den Bohrer zu verringern und den Knochenstaub abzuwaschen. Beenden Sie die Schädelausdünnung mit einem EF4-Hartmetallbohrer und fahren Sie mit dem Ausdünnen und Bohren des restlichen Schädels entlang der Spur fort.

Führen Sie eine 0,5 Millimeter große Pinzette mit feiner Spitze durch die gerissene Stelle und heben Sie den Knochenlappen vorsichtig nach oben, ohne das darunter liegende Gehirn einzudrücken. Nach Entfernung des Knochenlappens wird der Kraniotomiebereich mit Kochsalzlösung gespült. Entfernen Sie mit der gebogenen chirurgischen Pinzette vorsichtig die sichtbare Arachnoidalsubstanz.

Nehmen Sie das sterile Glasfenster mit der geraden Spitze mit dem drei Millimeter dicken Glasdeckglas nach unten auf. Platzieren Sie das Glasfenster über der Kraniotomiekorte, um sicherzustellen, dass das Fenster genau an den Kraniotomiekand anpasst. Das fünf Millimeter große Deckglas befindet sich oben.

Bereiten Sie den Zahnzement wie zuvor gezeigt vor und warten Sie etwa sechs Minuten, bis der Zement pastös und dickflüssig wird. Während Sie darauf warten, dass der Zement pastös und dickflüssig wird, üben Sie mit einem stereotaktischen Manipulator einen ausreichenden Druck auf das Fenster aus, um zu überprüfen, ob der Schädel das Glasfenster sicher und dicht berühren kann. Verwenden Sie einen verstellbaren Präzisionsapplikatorpinsel, um eine kleine Menge Zement entlang der Fensterkante hinzuzufügen, um das Glasfenster mit dem Schädel zu versiegeln.

Warten Sie etwa 10 Minuten, bis der Zement vollständig getrocknet ist, lassen Sie ihn dann vorsichtig los und entfernen Sie den Manipulator über dem Fenster. Beenden Sie den Zahnzement mit dem Dentalbohrer mit einem FG4-Hartmetallbohrer, wenn überschüssiger Zement das Fenster bedeckt. Etwa vier Stunden nach der Operation wurde eine Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt, bei der das Gefäßsystem auf oberflächlicher Ebene schwarz und in der Tiefe von etwa 400 Mikrometern die EGFP-Proteinexpression diffus im gesamten Zellkörper verteilt war.

Eine Woche und vier Monate nach dem SHT wurde das Gefäßmuster, das am Nullpunkt des Tages beobachtet wurde, als Referenz verwendet, um dieselbe Bildgebungsregion zu lokalisieren. Das Gefäßmuster ähnelt dem am Tag Null. In ähnlicher Weise wurde die EGFP-Expression im gesamten Zellkörper nachgewiesen.

Die Fluoreszenzintensität am Tag Null und nach vier Monaten war sowohl auf der oberflächlichen als auch auf der tieferen Ebene ähnlich. Die Fluoreszenzintensität nach einer Woche war jedoch geringer als die von Tag Null und vier Monaten, was möglicherweise auf die translationale Repression zurückzuführen ist, die für andere SHT-Modelle berichtet wurde. Es ist wichtig, bei der Durchführung des Kraniotomieschritts äußerste Vorsicht walten zu lassen, um eine Schädigung des Hirngewebes zu vermeiden.

Lassen Sie die Bohrspitze nicht in das Gehirn einführen. Mit dieser Technik können Forscher verschiedene Proteine von Interesse in derselben Zelle longitudinal über verschiedene Phasen nach dem Schädel-Hirn-Trauma hinweg visualisieren und so Informationen über die Lokalisation, Expression und Löslichkeit dieses Proteins im Säugetiergehirn nach einem Trauma liefern.