Name: Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung humaner Lebersphäroide aus peripherem Blut für Toxikologie und Arzneimittelforschung. Diese nicht-genetische Methode nutzt BDPC-derivierte Hepatozyten und ermöglicht patientenspezifische Studien.

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Die Autoren sind besonders dankbar für die technische Unterstützung von Oksana und John Greenacre. Diese Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH, Heidelberg, unterstützt.

Für die Durchführung dieser Experimente wurde die ethische Genehmigung (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) eingeholt und die Einverständniserklärung aller Spender vor der Blutentnahme in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien unterzeichnet.
1. Herstellung mononukleärer Zellen (MNCs) aus menschlichem peripherem Blut (PB)
<ol><li>Extrahieren Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern mit Hilfe von geschultem medizinischem Personal gemäß dem Standardprotokoll.</li>
	<li>Isolieren Sie PBMNCs mit Dichtegradientenmedien gemäß dem von Becker-Kojić et al.13 veröffentlichten Protokoll. Isolieren Sie durch Pipettieren die Interphasenschicht zwischen Plasma- und Dichtegradientenmedien und verwenden Sie sterile Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), um die isolierten Zellen zu waschen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Zählkammer und zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Standardmethoden.</li>
</ol>2. Dedifferenzierung von MNCs nach Aktivierung mit humanem GPI-verankertem Glykoprotein
<ol><li>6 x 106 mononukleäre Zellen in PBS/1% Rinderserumalbumin (BSA) in ein Polystyrolröhrchen (15 ml) geben und mit dem spezifischen Antikörper 30 min bei 37 °C nach Becker-Kojić et al.13 inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g bei Raumtemperatur und ersetzen Sie PBS/BSA durch Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird.</li>
	<li>Züchten Sie die Zellen in 15-ml-Polystyrolröhrchen in einem 5%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C für 8-10 Tage, wie in Becker-Kojić et al.13 beschrieben. Geben Sie an Tag 5 (D5) 1-2 ml Iscove-Medium, ergänzt mit 10% FBS, in jedes 15-ml-Röhrchen.</li>
</ol>3. Sortierung neu erzeugter dedifferenzierter Zellen
<ol><li>Zentrifugieren Sie die kultivierte Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 300 x g und aspirieren Sie mit einer sterilen Pipette den resultierenden Überstand nach Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das durch Zentrifugation in 90 μl kaltem PBS-Puffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA und 2 mM EDTA) erhaltene Pellet und fügen Sie 10 μl CD45-positive Magnetkügelchen in Nanogröße hinzu und inkubieren Sie es 15 Minuten lang auf Eis.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellsuspension mit 2 ml PBS-Puffer, zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur und geben Sie 500 μl PBS-Puffer in die Zellen und resuspendieren Sie sie gründlich.</li>
	<li>Pipettieren Sie 500 μl vorgekühlten PBS-Puffer zum Waschen in die Säule und legen Sie ihn mit einem Magnetständer in das Magnetfeld.</li>
	<li>Waschen Sie die auf der Säule platzierten Zellen zweimal mit 500 μl PBS-Puffer und sammeln Sie Durchflusszellen, die CD45-negative Zellen enthalten, in Iscoves Medium, das mit 10% FBS ergänzt wird.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Zählkammer, um die Anzahl der umprogrammierten Zellen zu bestimmen.</li>
</ol>4. Herstellung von Glasdeckgläsern für die Erzeugung menschlicher Hepatozyten
<ol><li>Glasdeckgläser (14 mm) trennen und 10 min in nichtionischem Reinigungsmittel inkubieren. Waschen Sie Glasdeckgläser in deionisiertem Wasser, bis keine Blasen mehr vorhanden sind, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in 1M HCl (nach Marchenko et al.14).</li>
	<li>Waschen Sie Glasdeckgläser mindestens 3x mit deionisiertem Wasser und trocknen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur. Autoklavieren Sie getrocknete Glasdeckgläser in einem geeigneten Behälter.</li>
</ol>5. Beschichtung von Zellkulturplatten mit Biolaminin zur 2D-hepatischen Differenzierung von BD-PSCs
<ol><li>Legen Sie autoklavierte Glasdeckgläser mit einer sterilen Pinzette in 4-Well-Platten und schalten Sie das UV-Licht 30 Minuten lang ein, um sterile Bedingungen zu gewährleisten.</li>
	<li>Tauen Sie Aliquots von Biolaminin auf und geben Sie 120 μl 5 μg/ml Biolaminin in jedes Glasdeckglas. Lassen Sie die beschichteten Glasdeckgläser über Nacht bei 4 °C stehen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überschuss an Biolaminin und fügen Sie 200 μl Hepatozyten-Differenzierungsmedium hinzu, wie unten beschrieben.</li>
</ol>6. Herstellung von Hepatozyten-Differenzierungsmedien
<ol><li>Stellen Sie 500 ml Hepatoblast-Knockout-Serumersatz (KSR)/Dimethylsulfoxid (DMSO)-Medium her, bestehend aus 76,4 % Knockout-DMEM (KO-DMEM), 20 % KSR, 0,5 % L-Glutamin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 0,1 % β-Mercaptoethanol, 1 % DMSO und 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptokokken).</li>
	<li>Bereiten Sie 500 ml Hepatozyten-Reifungsmedium vor, das 1 % L-Glutamin, 10 μM Hydrocortison-21-Hemisuccinat-Natriumsalz (HCC) und 1 % Pen/Streptokokken enthält.</li>
	<li>Aliquotes Medium aus dem Stamm und Zugabe von frischem Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Oncostatin M (OSM) in Endkonzentrationen von 10 ng/ml und/oder 20 ng/ml für jeden Mediumwechsel. HINWEIS: Oncostatin M ist ein Zytokin aus der Interleukin-6-Gruppe von Zytokinen, das sowohl für die Hämatopoese als auch für die Leberentwicklung wichtig ist.</li>
</ol>7. Kultivierung von Leberzellen, die sich von BD-PSCs unterscheiden
<ol><li>Geben Sie 3 x 105 BD-PSCS-Zellen in jede Vertiefung einer mit Biolaminin beschichteten 4-Well-Platte.</li>
	<li>Stellen Sie die 4-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator. Kultivieren Sie die Zellen für 5 Tage in KSR/DMSO-Hepatoblast-Medium, das die endodermale Differenzierung unterstützt, und wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.</li>
	<li>Wechseln Sie am 5. Tag auf Hepatozyten-Reifungsmedium und kultivieren Sie die Zellen für weitere 7-10 Tage im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 . Wechseln Sie das Medium alle 48 h.</li>
</ol>8.3D sphäroide hepatische Differenzierung
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.</li>
	<li>BD-dedifferenzierte Zellsuspension bei 300 x g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie BD-dedifferenzierte Zellen in KSR/DMSO-Medium bei 2 x 106 Zellen/ml.</li>
	<li>Führen Sie die Zellen durch ein 40-μm-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten und zusätzliche Ablagerungen zu entfernen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer und bereiten Sie für jede Zellaussaatdichte ein ausreichendes Volumen vor, um das erforderliche Volumen pro Vertiefung abzugeben. Bereiten Sie einen Gradienten mit Top-Seeding von 1 x 106 Zellen bis zu einer niedrigen Seeding-Dichte von 4000 Zellen vor.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl KSR/DMSO-Medium in 96 gut niedrige Aufsatzplatten ab und fügen Sie 100 μl Zellaussaatverdünnung hinzu.</li>
	<li>Legen Sie die niedrige Aufsatzplatte bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator und kultivieren Sie sie 5 Tage lang.</li>
	<li>Wechseln Sie 50% des Mediums von den Tagen 3-4 nach der Aussaat, wenn die Sphäroide ausreichend kompakt sind.</li>
	<li>Ändern Sie am 5. Tag das Medium in das Reifungsmedium der Hepatozyten und kultivieren Sie die Zellen für weitere 7-10 Tage zur weiteren Reifung. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag.</li>
</ol>9. Immunfluoreszenzanalyse von neu erzeugten 2D-Leberzellkulturen
<ol><li>Kultivieren Sie die Zellen nach der oben beschriebenen Differenzierungsmethode für 4, 8, 15 und 24 Tage und entfernen Sie Medien.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen mit einem vorgewärmten Fixiermittel, das aus 4% Paraformaldehyd in PBS besteht, für 10 Minuten. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen 2x mit PBS für jeweils 5 Minuten. Fügen Sie sofort 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen für 5 Minuten. 2x mit PBS waschen.</li>
	<li>Blockierende Lösung aus PBS und 5% BSA zugeben und 1 h bei Raumtemperatur auf die Kippplatte legen.</li>
	<li>Verdünnen Sie primäre Antikörper in Verdünnungspuffer 1% BSA/PBS wie folgt: Albumin (ALB) 1:50, Alpha-1-Fetoprotein (AFP) 1:250, Zytokeratin 18 (CK18) 1:50, Hepatozytenkernfaktor 4 alpha (HNF4α) 1:1000 und Transthyretin (TTR) 1:50. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen 1 h bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann die Antikörperlösung, waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang und wiederholen Sie den Waschschritt 3x.</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden sekundären Antikörper im Verdünnungspuffer vor: Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (Texas-Rot) 1:1000, Ziegen-Anti-Maus-IgG (488) 1:1000 und Ziegen-Anti-Kaninchen (488) 1:500. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS für jeweils 5 min und montieren Sie die Deckgläser mit DAPI-haltigen Einpackmedien für die mikroskopische Analyse.</li>
</ol>10. Lebendfärbung neu gebildeter Lebersphäroide
<ol><li>Entsorgen Sie die Nährmedien vorsichtig, ohne die Sphäroide zu berühren, fügen Sie frisch hergestelltes PBS mit 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang, um die Zellen zu permeabilisieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Sphäroide mit dem Medium durch langsames Pipettieren für 5 min, wiederholen Sie den Vorgang 2x.</li>
	<li>Die Sphäroide werden mit den Primärantikörpern ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) und CYP3A4 (1:200) inkubiert, die in PBS mit 1% BSA für 1 h in einem 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C hergestellt wurden. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Antikörperlösung und waschen Sie die Sphäroide 3x mit medium.</li>
	<li>Bereiten Sie die entsprechenden sekundären Antikörper Ziegen-Anti-Maus-IgG (Cy3), Ziegen-Anti-Maus-IgG (488) und Kaninchen-Anti-Huhn-IgG (Texas-Rot) in einer Verdünnung von 1:1000 und 1:500 für Ziegen-Anti-Kaninchen (488) in PBS in 1% BSA vor. Verwenden Sie 50 μl Antikörperverdünnung pro Vertiefung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte vorsichtig 3x mit Medium und lassen Sie die Platte 30 Minuten im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 , bevor Sie eine Fluoreszenzmikroskopie durchführen.</li>
</ol>11. Untersuchung von Sphäroiden mit einem Fluoreszenzmikroskop
<ol><li>Schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle 10 Minuten vor Gebrauch ein, schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Objektiv mit 4-facher Vergrößerung, klicken Sie auf die Schaltfläche 4x in der Symbolleiste, um die richtige Maßstabsleiste auszuwählen, und legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die Tischmittelplatte.</li>
	<li>Schalten Sie die LED-Lichtquelle ein, verwenden Sie den Hellfeldfilter und positionieren Sie die Platte mit dem Einstellknopf für die x-y-Achse an der gewünschten Vertiefung.</li>
	<li>Wechseln Sie zum Lichtweg der Kamera, klicken Sie auf die Schaltfläche Live in der Bildbearbeitungssoftware, um das Bild auf dem Bildschirm zu visualisieren, und stellen Sie sicher, dass das Sphäroid mit den Knöpfen der X-Y-Achse zentriert und mit dem Grob-/Feinfokusknopf fokussiert ist. HINWEIS: Die Form der Sphäroide bleibt nach dem Auftragen der Lebendfärbung konstant.</li>
	<li>Wählen Sie in der Symbolleiste die Hellfeld-Beobachtungsmethode , stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf "Automatisch" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss " in der Kamerasteuerung, um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie dann das Bild als VSI-Datei unter dem entsprechenden Namen im gewünschten Ordner.</li>
	<li>Platzieren Sie die Umgebungslichtabschirmplatte, um das LED-Licht auszuschalten, wechseln Sie zum Filter für die B-Anregung, wählen Sie 488 Beobachtungsmethode in der Symbolleiste, öffnen Sie den Verschluss, nehmen Sie ein Bild auf, indem Sie auf die Schaltfläche Schnappschuss klicken, schließen Sie den Verschluss und speichern Sie die Datei wie oben beschrieben.</li>
	<li>Wiederholen Sie dies mit einem Filter für die G-Anregung mit der entsprechenden Beobachtungsmethode (Texas Red oder CY3). Wiederholen Sie dann das gesamte Verfahren für jede interessante Bohrung.</li>
	<li>Legen Sie die Platte bei 37 °C wieder in den 5 % CO2 -Inkubator und kultivieren Sie sie wie oben beschrieben.</li>
</ol>

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</ol>

Die korrespondierende Autorin erklärt, dass sie Patentinhaberin im Zusammenhang mit dem neuartigen humanen GPI-verknüpften Protein ist. Sie ist Mitbegründerin und Mitarbeiterin der ACA CELL Biotech GmbH. Die anderen Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die Leber ist ein wichtiges Organ im menschlichen Körper mit vielen wesentlichen biologischen Funktionen, wie z.B. der Entgiftung von Metaboliten. Aufgrund schwerer Leberversagen wie Leberzirrhose und/oder Virushepatitis gibt es weltweit fast 2 Millionen Todesfälle pro Jahr. Lebertransplantationen stehen weltweit an zweiter Stelle bei Transplantationen solider Organe, aber nur etwa 10% des derzeitigen Bedarfs werden gedeckt22.
Primäre humane Hepatozyten (PHH) werden häu...

In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Sphäroidkultursysteme zu einem wichtigen Werkzeug entwickelt, um verschiedene Bereiche der Krebsforschung, Wirkstoffforschung und Toxikologie zu untersuchen. Solche Kulturen stoßen auf großes Interesse, da sie die Lücke zwischen zweidimensionalen (2D) Zellkultur-Monoschichten und komplexen Organen schließen1.
In Ermangelung einer adhäsiven Oberfläche beruht die Bildung von Sphäroiden im Vergleich zur 2D-Zellkultur auf der natürlichen Affinität dieser Zellen zu Clustern in 3D-Form. Diese Zellen organisieren sich in Gruppen, die aus einer oder mehreren Arten reifer Zellen bestehen. Frei von Fremdstoffen interagieren diese Zellen miteinander wie in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung. Die Zellen in der 3D-Kultur sind viel näher beieinander und haben eine richtige Ausrichtung zueinander, mit einer höheren extrazellulären Matrixproduktion als 2D-Kulturen, und bilden eine nahe an der natürlichen Umgebung 2.
Tiermodelle werden seit langem verwendet, um die menschliche Biologie und Krankheiten zu untersuchen3. In dieser Hinsicht gibt es intrinsische Unterschiede zwischen Mensch und Tier, was diese Modelle für extrapolative Studien nicht vollständig geeignet macht. 3D-Kultursphäroide und -Organoide stellen ein vielversprechendes Werkzeug dar, um gewebeähnliche Architektur, Interaktion und Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen, die in vivo auftreten, und können dazu beitragen, Tiermodelle zu reduzieren oder sogar zu ersetzen. Sie sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Pathogenese von Lebererkrankungen sowie für Wirkstoff-Screening-Plattformen4.
Die 3D-Sphäroidkultur ist für die Krebsforschung von besonderer Bedeutung, da sie die Diskontinuität zwischen den Zellen und ihrer Umgebung beseitigen kann, indem sie den Bedarf an Trypsinisierung oder Kollagenasebehandlung reduziert, der für die Vorbereitung der Tumorzellmonoschichten für 2D-Kulturen erforderlich ist. Tumorsphäroide ermöglichen die Untersuchung, wie normale und bösartige Zellen Signale aus ihrer Umgebung empfangen und darauf reagieren5 und sind ein wichtiger Bestandteil tumorbiologischer Studien.
Im Vergleich zur Monoschicht ähneln 3D-Kulturen, die aus verschiedenen Zelltypen bestehen, in ihren strukturellen und funktionellen Eigenschaften Tumorgeweben und eignen sich daher für die Untersuchung von Metastasen und Invasionen von Tumorzellen. Deshalb tragen solche Sphäroidmodelle dazu bei, die Krebsforschung zu beschleunigen6.
Sphäroide tragen auch dazu bei, die Technologie zur Herstellung menschlicher Organoide zu entwickeln, da die Gewebe- und Organbiologie insbesondere beim Menschen sehr schwierig zu untersuchen ist. Fortschritte in der Stammzellkultur ermöglichen die Entwicklung von 3D-Kulturen wie Organoiden, die aus Stammzellen und Gewebevorläufern bestehen, sowie verschiedene Arten von reifen (Gewebe-)Zellen aus einem Organ mit einigen funktionellen Eigenschaften wie einem echten Organ, das zur Modellierung der Organentwicklung und von Krankheiten verwendet werden kann, aber auch in der regenerativen Medizin als nützlich angesehen werdenkann 7.
Primäre menschliche Hepatozyten werden normalerweise für die Untersuchung der In-vitro-Biologie menschlicher Hepatozyten, der Leberfunktion und der arzneimittelinduzierten Toxizität verwendet. Kulturen menschlicher Hepatozyten haben zwei Hauptnachteile, erstens die begrenzte Verfügbarkeit von primärem Gewebe wie menschlichen Hepatozyten und zweitens die Tendenz von Hepatozyten, sich in 2D-Kulturen schnell zu dedifferenzieren, wodurch ihre spezifische Hepatozytenfunktion verlorengeht 8. 3D-Leberkulturen sind in dieser Hinsicht überlegen und wurden kürzlich aus differenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) hergestellt9. Biotechnologisch hergestellte hepatische 3D-Sphäroide sind von besonderem Interesse für die Untersuchung der Entwicklung, Toxizität, genetischen und infektiösen Erkrankungen der Leber sowie für die Wirkstoffforschung zur Behandlung von Lebererkrankungen10. Schließlich haben sie auch das Potenzial, klinisch eingesetzt zu werden, da sie wissen, dass akute Lebererkrankungen eine Sterblichkeitsrate von fast 80 % aufweisen, biokünstliche Leber- und/oder Lebersphäroide diese Patienten möglicherweise retten könnten, indem sie eine partielle Leberfunktion bereitstellen, bis ein geeigneter Spender gefunden werden kann11.
Wir haben ein Protokoll für die Erzeugung von humanen hepatischen Sphäroiden unter Verwendung von pluripotenten Stammzellen aus Blut (BD-PSCs) zur Herstellung unterschiedlich großer Sphäroide mit 4000 bis 1 x 106 Zellen erstellt und mittels Lichtmikroskopie und Immunfluoreszenz analysiert. Wir testeten auch die Fähigkeit der Hepatozyten-spezifischen Funktion und bewerteten die Expression von Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) und 2E1 (CYP2E1) Enzymen, die zur Cytochrom-P450-Familie gehören und eine wichtige Rolle im Zell- und Arzneimittelstoffwechsel während des Entgiftungsprozesses spielen12.

<table><tbody><tr><td>Albumin-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>hergestellt in</td></tr><tr><td>Hühner-Albumin-Fraktion V</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-1 Fetoprotein</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>Kaninchen polyklonales IgG</td></tr><tr><td>Biolaminin 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>humane rekombinante</td></tr><tr><td>CD45-Mikrobeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>magnetische Kügelchen in Nanogröße</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging-Software</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 well</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Olympus Handelsübliches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waschmittel</td><td>Procter & Gamble</td><td></td><td>nichtionischer Detergens</td></tr><tr><td>CYP2E1-spezifischer Antikörper</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>Kaninchen polyklonaler Antikörper IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-LG</td><td>Maus monoklonaler Antikörper IgG1</td></tr><tr><td>Cytokeratin 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>Maus monoklonaler Antikörper IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Eingestellt. Erhältlich unter: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-Glutamin</td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG Cy3</td><td>Antikörper online ABIN1673767</td><td></td><td>polyklonale</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG DyLight 488</td><td>Antikörper online</td><td>ABIN1889284</td><td>polyklonale</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>Hepatozyten-Reifemedium</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>humaner rekombinanter</td></tr><tr><td>HNF4&alpha-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL-Klon</td><td>4C19 ZooMAb Rbmonohydrocortison</td></tr><tr><td>21-Hemisuccinat (Natriumsalz)</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock-out-Serumersatz - Multispezies Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>eingestellt. Erhältlich unter Katalog-Nr. 10-828-010</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>Magnetständer</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>MiniMACS Säulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>4-Well-Platten</td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>humane rekombinante</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS steril</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PS 15ml Röhrchen steril</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Huhn IgG Texas rot</td><td>Antikörper online ABIN637943</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 human</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Transthyretin-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>hergestellt in Hühnchen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

humane lebersphäroide aus peripherem blut für studien zu lebererkrankungen

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Menschliche Leberzellen können eine dreidimensionale (3D) Struktur bilden, die in der Lage ist, einige Wochen lang in Kultur zu wachsen und ihre Funktionsfähigkeit zu erhalten. Aufgrund ihrer Beschaffenheit, sich in den Kulturschalen mit geringen oder keinen Hafteigenschaften zu sammeln, bilden sie Aggregate mehrerer Leberzellen, die als menschliche Lebersphäroide bezeichnet werden. Die Bildung von 3D-Lebersphäroiden beruht auf der natürlichen Tendenz von Leberzellen, in Abwesenheit eines adhäsiven Substrats zu aggregieren. Diese 3D-Strukturen besitzen bessere physiologische Reaktionen als Zellen, die näher an einer In-vivo-Umgebung liegen. Die Verwendung von 3D-Hepatozytenkulturen hat im Vergleich zu klassischen zweidimensionalen (2D) Kulturen zahlreiche Vorteile, darunter eine biologisch relevantere Mikroumgebung, eine architektonische Morphologie, die natürliche Organe wieder zusammensetzt, sowie eine bessere Vorhersage des Krankheitszustands und der In-vivo-ähnlichen Reaktionen auf Medikamente. Verschiedene Quellen können verwendet werden, um Sphäroide zu erzeugen, wie primäres Lebergewebe oder immortalisierte Zelllinien. Das 3D-Lebergewebe kann auch unter Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) zur Ableitung von Hepatozyten hergestellt werden. Wir haben humane Lebersphäroide unter Verwendung von aus Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) gewonnen, die aus unmanipuliertem peripherem Blut durch Aktivierung von humanem membrangebundenem GPI-verknüpftem Protein erzeugt und zu menschlichen Hepatozyten differenziert wurden. Die von BD-PSCs abgeleiteten menschlichen Leberzellen und menschlichen Lebersphäroide wurden durch Lichtmikroskopie und Immunphänotypisierung unter Verwendung humaner Hepatozytenmarker analysiert.

Wir haben humane BD-PSCs erfolgreich in Endoderm-/hepatische Vorläuferzellen und Hepatozyten differenziert, indem wir ein zweistufiges Protokoll angewendet haben. Morphologische Veränderungen während des hepatischen Differenzierungsprozesses sind in Abbildung 1 dargestellt. BD-PSCs differenzieren sich in Hepatozyten, die drei verschiedene Stadien durchlaufen. Die erste Stufe stellt die Differenzierung in endodermale Zellen L4 dar, die zweite die Differenzierung zu hepatischen Vorläuferzellen...

Hier stellen wir eine nicht-genetische Methode zur Erzeugung humaner autologer Lebersphäroide unter Verwendung mononukleärer Zellen vor, die aus peripherem Blut im stationären Zustand isoliert wurden.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Die Erzeugung von menschlichen Lebersphäroiden unter Verwendung autologer Quellen kann zu verschiedenen Forschungsbereichen wie Toxikologie, Krebs und Arzneimittelforschung beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, BDPC-abgeleitete menschliche Hepatozyten zu verwenden, um menschliche Lebersphäroide zu entwickeln, wodurch der Mangel an primären menschlichen Hepatozyten oder PHH umgangen wird. Autologe humane Sphäroide können auf die regenerative Medizin und Therapie ausgeweitet werden, insbesondere bei Patienten mit akutem Leberversagen.Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Anne-Katherin Schott, Projektleiterin in meinem Labor. Beginnen Sie mit der Herstellung von 500 Millilitern Hepatoblast KnockOut-Serumersatz-Dimethylsulfoxid oder KSR-DMSO-Medium und Hepatozyten-Reifungsmedium. Aliquotieren Sie das Medium aus dem Stamm und fügen Sie frischen Hepatozytenwachstumsfaktor oder HGF und Oncostatin M oder OCM in Endkonzentrationen von 10 oder 20 Nanogramm pro Milliliter für jeden Mediumwechsel hinzu.Übertragen Sie dreimal 10 auf die fünfte aus Blut gewonnene pluripotente Stammzellen oder BD-PSC-Zellen in eine mit Biolaminin beschichtete Vier-Well-Platte und inkubieren Sie die Platte fünf Tage lang in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Um die endodermale Differenzierung zu unterstützen, kultivieren Sie die Zellen fünf Tage lang in KSR DMSO-Hepatoblastmedium und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden. Fügen Sie am fünften Tag Hepatozyten-Reifungsmedium hinzu und kultivieren Sie die Zellen für weitere sieben bis 10 Tage im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, wobei sicherzustellen ist, dass das Medium alle 48 Stunden gewechselt wird.Die Zellen werden mit einer Zählkammer gezählt und die dedifferenzierte BD-Zellsuspension bei 300 G 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes resuspendieren BD-dedifferenzierte Zellen in KSR-DMSO-Medium bei zwei mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter-Konzentration. Nachdem Sie die Einzelzellsuspension sichergestellt haben, entfernen Sie alle zusätzlichen Rückstände, indem Sie die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb führen.Zählen Sie die Zellen erneut mit einer Zählkammer und bereiten Sie ein ausreichendes Volumen jeder Zellaussaatdichte vor, um das erforderliche Volumen pro Vertiefung abzugeben. Bereiten Sie einen Gradienten mit einer Top-Aussaat von einer Million Zellen bis zu einer niedrigen Aussaatdichte von 4.000 Zellen vor. Als nächstes geben Sie 100 Mikroliter KSR DMSO-Medium in 96-Well-Platten mit niedriger Befestigung ab und fügen 100 Mikroliter Zellaussaatverdünnung hinzu.Inkubieren Sie die niedrige Befestigungsplatte fünf Tage lang. Wechseln Sie 50% des Mediums am dritten oder vierten Tag nach der Aussaat, wenn die Sphäroide ausreichend kompakt sind. Wechseln Sie am fünften Tag das Medium in ein Hepatozyten-Reifungsmedium und kultivieren Sie die darin enthaltenen Zellen für weitere sieben bis 10 Tage, wobei Sie das Medium alle 48 Stunden wechseln.Nachdem Sie die Zellen 4, 8, 15 und 24 Tage lang mit der zuvor beschriebenen Differenzierungsmethode kultiviert haben, entfernen Sie das Medium. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit vorgewärmten Fixiermitteln, die 4% Paraformaldehyd in PBS enthalten. Als nächstes entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen zweimal für jeweils fünf Minuten mit PBS.Fügen Sie sofort 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen fünf Minuten lang, bevor Sie zweimal PBS waschen. Fügen Sie eine Blockierlösung aus PBS und 5% Rinderserumalbumin oder BSA hinzu, bevor Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf eine Wippplatte legen. Verdünnen Sie die Primärantikörper in einem Verdünnungspuffer von 1 % BSA PBS und fügen Sie 50 Mikroliter der Antikörperverdünnung pro Vertiefung hinzu.Verwerfen Sie die Antikörperlösung nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur und geben Sie drei Wäschen à fünf Minuten mit PBS. Fügen Sie 50 Mikroliter sekundäre Antikörper hinzu, die in Verdünnungspuffer in jeder Vertiefung verdünnt sind, und inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen dreimal fünf Minuten lang mit PBS gewaschen haben, montieren Sie die Deckgläser mit Eindeckmedien, die DAPI enthalten, für die mikroskopische Analyse.Entsorgen Sie die Nährmedien vorsichtig, ohne die Sphäroide zu berühren, und fügen Sie frisch zubereitetes PBS mit 0,1% Triton X-100-Lösung hinzu und inkubieren Sie es fünf Minuten lang, um die Zellen zu permeabilisieren. Waschen Sie die Sphäroide zweimal mit dem Medium, indem Sie das Medium langsam pipettieren. Anschließend inkubieren Sie die Sphäroide eine Stunde lang mit 50 Mikrolitern der Primärantikörper.Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Antikörperlösung und geben Sie drei Wäschen mit Medium. Bereiten Sie die entsprechenden sekundären Antikörper wie Ziegen-Anti-Maus-IgG Cy3, Ziegen-Anti-Maus-IgG 488 und Kaninchen-Anti-Huhn-IgG Texas Red in PBS mit 1% BSA vor und fügen Sie 50 Mikroliter Antikörperverdünnung pro Vertiefung vor 20 Minuten Inkubation im Kohlendioxid-Inkubator hinzu. Waschen Sie es erneut dreimal mit dem Medium vor 30 Minuten Inkubation im Inkubator.Schalten Sie die Fluoreszenzlichtquelle 10 Minuten vor Gebrauch ein. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware. Verwenden Sie das 4-fache Vergrößerungsobjektiv, indem Sie auf die 4-fache Schaltfläche in der Symbolleiste klicken, um die richtige Maßstabsleiste auszuwählen.Legen Sie dann die 96-Well-Platte auf die Bühnenmittelplatte. Schalten Sie die LED-Lichtquelle ein, verwenden Sie den Hellfeldfilter und positionieren Sie die Platte mit dem Einstellknopf für die XY-Achse an der gewünschten Vertiefung. Wechseln Sie zum Lichtweg der Kamera und klicken Sie in der Bildgebungssoftware auf die Live-Schaltfläche, um das Bild auf dem Bildschirm zu visualisieren.Stellen Sie sicher, dass das Sphäroid mit den Knöpfen der XY-Achse zentriert ist, und fokussieren Sie mit dem Grob- oder Feinfokusknopf. Wählen Sie als Nächstes die Hellfeld-Beobachtungsmethode in der Symbolleiste aus, stellen Sie die Belichtungseinstellungen auf "Automatisch" und klicken Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss" in der Kamerasteuerung, um ein Bild aufzunehmen. Speichern Sie dann das Bild als VSI-Datei mit dem entsprechenden Namen im gewünschten Ordner.Platzieren Sie eine Abschirmplatte für das Umgebungslicht, um das LED-Licht auszuschalten und den Filter für die B-Anregung zu wechseln. Wählen Sie dann die Beobachtungsmethode 488. Öffnen Sie den Verschluss, machen Sie ein Bild, indem Sie auf die Schaltfläche "Schnappschuss" klicken, schließen Sie den Verschluss und speichern Sie die Datei als VSI.Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Filter für die G-Anregung, um den Vorgang für jede interessierende Vertiefung zu wiederholen. Morphologische Veränderungen während des hepatischen Differenzierungsprozesses zeigten, dass sich die BD-PSCs in drei Stadien zu Hepatozyten differenzierten. Die erste Stufe stellte die Differenzierung in endodermale Zellen dar.Die zweite Differenzierung erfolgt in hepatische Vorläuferzellen, die eine typische polygonale Morphologie aufweisen. Und der dritte, die Reifung zu Hepatozyten. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte die starke Expression von Endoderm-Vorläufermarkern der menschlichen Leber wie dem Alpha-Fetoprotein oder APF und Transthyretin oder TTR in den Zellen in der ersten Phase des hepatischen Differenzierungsprozesses am Tag L4 bis L8.Ihre Expression nahm jedoch am Tag L15 ab. Die Expression von Albumin oder ALB und Hepatozyten-Kernfaktor vier alpha oder HNF4 alpha erschien zuerst an L4, nahm während der Differenzierungszeit L4 bis L15 zu und erreichte eine starke und stabile Expression während der Reifezeit L15 bis L24. Eine spontane Aggregation von Zellen wurde in Platten mit niedriger Bindung beobachtet, die die Induktion von Hepatozyten oder die durch das Reifungsmedium initiierte Sphäroidbildung enthielten.Es wurde eine konsistente Korrelation zwischen dem Steroidsphäroid und der variablen Anzahl von Zellen beobachtet. Die an L14 gebildeten und differenzierten und mit Antikörpern lebend gefärbten Sphäroide zeigten die potentielle hepatische funktionelle Aktivität von BD-PSCs-abgeleiteten Sphäroide. Die Vorbereitung mononukleärer Zellen für die Reprogrammierung ist der wichtigste Schritt in diesem Verfahren.Die Erzeugung menschlicher Lebersphäroide ist der erste Schritt zur Herstellung von Organoiden in vitro, einer vereinfachten Version des Organs in 3D mit einer Mikroanatomie, die der in vivo ähnelt. Im Labor hergestellte Organoide werden verwendet, um Organogenese, Krankheitsentwicklung und Nährstoffe zu untersuchen.

human-liver-spheroids-from-peripheral-blood-for-liver-disease-studies

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Generierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit einem menschlichen Immunsystem und Leberzellen. Dabei werden menschliche Leberzellen und hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen durch intrasplenische Injektion in eine transgene immundefiziente Maus transplantiert, was zur Transplantation von Leberzellen und zur Entwicklung menschlicher Immunzellen führt.

Entwicklung eines humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leberzellen und Immunzellen

Eine Technik zur Isolierung menschlicher Hepatozyten und nicht-parenchymaler Leberzellen vom selben Spender wird beschrieben. Die unterschiedlichen Leberzelltypen bilden die Grundlage für funktionelle Lebermodelle und Tissue Engineering. Diese neue Methode zielt darauf ab, Leberzellen in einer hohen Ausbeute und Lebensfähigkeit zu isolieren.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

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Serumfreie Produktion dreidimensionaler menschlicher Hepatosphären aus pluripotenten Stammzellen

Wir haben ein mikrophysiologisches System (MPS) mit Darm- und Leberorganoiden Acetaminophen (APAP) ausgesetzt. Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Organoidproduktion und APAP pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaftenbewertungen im MPS. Es beschreibt auch die Gewebefunktionsanalysen, die notwendig sind, um die Ergebnisse zu validieren.

Ein Mikrophysiologisches System für die pharmakokinetische und toxikologische Beurteilung von Arzneimitteln/Leber

Dieses Verfahren wurde für die Entwicklung fortgeschrittener 3D-Leberkulturen in vitro eingeführt, die eine physiologisch relevantere Bewertung der genotoxischen Gefahren im Zusammenhang mit Nanomaterial-Expositionen sowohl über ein akutes als auch ein langfristiges, wiederholtes Dosisregime ermöglichen können.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Es fehlen umfassende In-vitro-Modelle , die die relevante menschliche Krankheit getreu rekapitulieren. Die aktuelle Studie präsentiert die dreidimensionale (3D) Tumorsphäroidbildung und -kultur, ein zuverlässiges In-vitro-Werkzeug zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion beim menschlichen hepatozellulären Karzinom.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

Hier skizzieren und demonstrieren wir ein Protokoll für die Isolierung primärer Lebersinuszellen (LSEC) in der Mausleber. Das Protokoll basiert auf der Perfusion der Leberkollagenase, der nichtparenchymalen Zellreinigung durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit und der Auswahl magnetischer CD146-Perlen. Wir phänotypisieren und charakterisieren diese isolierten LSECs auch mittels Durchflusszytometrie und Rasterelektronenmikroskopie.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Arzneimittelinduzierte Leberschäden (DILI) sind eine Hauptursache für Arzneimittelversagen. Es wurde ein Protokoll entwickelt, um die DILI-Haftung einer Verbindung unter Verwendung eines mikrophysiologischen Lebersystems (MPS) genau vorherzusagen. Das Lebermodell nutzt die Kokultur von primären Leberzellen und translational relevanten Endpunkten, um das zelluläre Ansprechen auf die Behandlung zu bewerten.

Mikrophysiologisches System der menschlichen Leber zur Beurteilung der medikamenteninduzierten Lebertoxizität in vitro

Organoide revolutionieren die personalisierte Gewebemodellierung für die Organentwicklung, Wirkstoffforschung und Krankheitsforschung. Die Organoid-Technik schreitet voran und führt zur Herstellung komplizierter synthetischer Gewebe. Ziel ist es, Morphogenese, Assembloid-Technologie und Biomatrizen zu integrieren, um das Tissue Engineering voranzutreiben. Dieses Protokoll hilft bei der Modellierung der Leberorganogenese und der Festlegung von Richtlinien für den Aufbau synthetischer Gewebe.

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

Hier beschreiben wir eine Plattform, die die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden ermöglicht, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden. Der Arbeitsablauf reicht von der Erzeugung von Sphäroiden aus primären Leberzellen über die Transplantation in das Mausauge bis hin zur In-vivo-Bildgebung mit zellulärer Auflösung durch konfokale Mikroskopie.

In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden

Erfahren Sie die Herstellung humaner Lebersphäroide aus peripherem Blut für Toxikologie und Arzneimittelforschung. Diese nicht-genetische Methode nutzt BDPC-derivierte Hepatozyten und ermöglicht patientenspezifische Studien.

Humane Lebersphäroide aus peripherem Blut für Studien zu Lebererkrankungen

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