Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

Diese Methode hilft bei der Beantwortung von Fragen darüber, ob eine Erkrankung die Integrität der Darmbarriere verändert oder ob eine mögliche Behandlung die Integrität der Darmbarriere aufrechterhalten kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine nicht-invasive, belastende Technik zur Bewertung und Quantifizierung der Darmpermeabilität in vivo bietet. Um zu beginnen, fasten Sie die Mäuse für vier Stunden und verabreichen Sie dann 200 Mikroliter der FITC-Dextran-Suspension über eine orale Sonde an jede Maus mit einer sterilisierten 38-Millimeter-22-Gauge-Sondennadel.

Starten Sie einen Timer nach der ersten Sonde und warten Sie fünf bis 10 Minuten zwischen den einzelnen Sonden, um In-vivo-Messungen zu ermöglichen, wobei Sie eine Stunde nach der Sonde beibehalten werden. Behalten Sie die verbleibende FITC-Dextran-Aufhängung für die Standardkurve bei. Starten Sie das Gerät und die Software, indem Sie auf die Starttaste klicken und diese gedrückt halten, und lassen Sie das System aufwärmen.

Klicken Sie auf Gerätestatus und stellen Sie sicher, dass alle konfigurierten Geräte OK anzeigen, bevor Sie fortfahren. Klicken Sie dann auf Neue Studie und speichern Sie die Datei unter dem gewünschten Namen. Klicken Sie anschließend auf Studienoptionen.

Geben Sie die Proben-ID ein und wählen Sie den richtigen Laser und das richtige Experiment aus. Entfernen Sie dann das Fell mit einem Elektrorasierer aus dem Bauchbereich und tragen Sie eine Veterinärsalbe großzügig auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Öffnen Sie die Bildgebungskammer und legen Sie das Tier dorsal auf die Scanplatte.

Befestigen Sie dann die Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband. Wählen Sie als Nächstes den zu scannenden Bereich mit dem Zeichenwerkzeug aus. Stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Breite des Abdomens von knapp über der Leber bis zum Rektum umfassen.

Klicken Sie dann auf das Werkzeug Ändern, um den gezeichneten Bereich anzupassen. Stellen Sie die Scanauflösung auf 2,0 Millimeter ein und klicken Sie auf Start, um den Scan zu starten. Öffnen Sie als Nächstes die Bilddateien, indem Sie sie unter dem gewählten Dateinamen suchen, und öffnen Sie gleichzeitig alle Dateien mit synchronisierten Einstellungen.

Verwenden Sie in der Symbolleiste für Bildeinstellungen die Schaltflächen Bild synchronisieren und Skalierung synchronisieren, um die Bildeinstellungen für einen genauen Vergleich zu synchronisieren. Speichern Sie dann die Bilder mit den angepassten Maßstäben. Vergleichen Sie die abdominale Fluoreszenz jedes Tieres und der Kontrollmaus auf gleichmäßig skalierten Bildern mit einer Software, die dem Bildgebungssystem zugeordnet ist.

Sammeln Sie vier Stunden nach der Sonde ein Kotpellet von jeder Maus in einem sterilen Röhrchen. Halten Sie die Röhrchen dann auf Eis und stellen Sie sie in die Dunkelheit. Als nächstes zentrifugieren Sie die Blutproben bei 9.390 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Übertragen Sie dann das Plasma in ein neues steriles Röhrchen und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf. Verdünnen Sie 50 Milligramm Stuhlproben in 200 Mikrolitern PBS und verdünnen Sie das Plasma mit PBS im Verhältnis eins zu zwei. Platte 100 Mikroliter Proben und Standards in einer undurchsichtigen schwarzen 96-Well-Platte.

Lesen Sie die Fluoreszenz auf einem Fluoreszenzplatten-Reader mit Anregung bei 485 Nanometern und Absorption bei 530 Nanometern. Bestimmen Sie schließlich die Konzentration von FITC-Dextran pro Probe, indem Sie die Fluoreszenz mit den bekannten Konzentrationen der Standardkurve vergleichen. Die Analyse der In-vivo-Fluoreszenz zeigte, dass Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten, eine höhere Leberaufnahme von FITC-Dextran und höhere Restfluoreszenzwerte in der Bauchhöhle aufwiesen als die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten.

Die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten, hatten signifikant niedrigere FITC-Dextran-Spiegel in ihrem Plasma im Vergleich zu den Mäusen, die nur die Kontrolldiät erhielten. Übereinstimmend hatten die Mäuse, die die Inulin-Diät erhielten, signifikant höhere FITC-Dextran-Spiegel in ihrem Kot als die Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten. Die niedrigeren Konzentrationen von FITC-Dextran im Kot der kontrollierten Mäuse deuten darauf hin, dass es durch die Darmbarriere in den Kreislauf gelangt ist, anstatt angemessen ausgeschieden zu werden.

Die hohen Konzentrationen von FITC-Dextran im Plasma bestätigten diesen Befund. Das Timing ist wichtig, wenn Sie dieses Verfahren versuchen. Die Fluoreszenzmessung und Probenentnahme sollte für jede einzelne Maus so nah wie möglich an einer Stunde und vier Stunden nach der Sonde erfolgen.