Name: Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-18T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Erfahren Sie die Beurteilung der Darmbarriereintegrität bei Mäusen mittels FITC-Dextran per Schlundsonde. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die quantitative Analyse der intestinalen Permeabilität in vivo.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada finanziert (Zuschuss RGPIN-2018-06442 an MMS). Wir danken der Tiereinrichtung im CRCHUM und Dr. Junzheng Peng von der Cardiovascular Phenotyping Platform.

Alle Verfahren wurden nach Genehmigung durch das Institutional Animal Care Committee des CRCHUM nach den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet, die aus einer kommerziellen Quelle stammen (siehe Materialtabelle). Die Tiere erhielten 2 Wochen lang eine Nahrungsergänzung mit 10 % Inulin Gew.-%. Eine Kontrollgruppe erhielt eine ähnliche Diät, der das Inulinpräparat fehlte. Mäuse hatten ad libitum Zugang zur Nahrung. Eine Übersicht über den Assay ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Diagramm der FITC-Dextran-Absorptionsstudie; Ratte, orale Sonde, Fluoreszenzmessung, Analyseaufbau." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des FITC-Dextran-Assays. T-4-4 h vor der Sonde wurde der Zugang zu Nahrungsmitteln entfernt. T0-FITC-Dextran wurde über eine orale Sonde verabreicht. T1 - 1 h nach der Sonde wurde die in vivo Fluoreszenz ausgewertet. T4-4 h nach der Sonde wurden die Stuhl- und Plasmaproben entnommen und die Fluoreszenz gemessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
1. Verabreichung von FITC-Dextran
<ol><li>Fasten Sie die Mäuse vor der Verabreichung von FITC-Dextran 4 Stunden lang, während Sie ad libitum Zugang zu Wasser haben. HINWEIS: Das Fasten muss vorzugsweise zu Beginn des Lichtzyklus (morgens) begonnen werden. Die Mäuse können während des Fastens ohne Einstreu in einen neuen Käfig gebracht werden, um die Koprophagie zu begrenzen.</li>
	<li>Es werden 200 μl 80 mg·ml−1 4 kDa FITC-Dextran (siehe Materialtabelle) in steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pro Maus) verdünnt. Bereiten Sie die Proben unmittelbar vor der Verabreichung frisch vor und bewahren Sie sie vor Licht geschützt auf.</li>
	<li>Verabreichen Sie jeder Maus 200 μl der FITC-Dextran-Suspension über eine orale Sonde mit einer sterilisierten, gebogenen 38-mm-22-G-Sondennadel mit einer kugel- oder birnenförmigen Spitze (siehe Materialtabelle). Starten Sie einen Timer nach der ersten Songage und warten Sie 5-10 Minuten, bevor Sie die nächste Maus gavieren, um In-vivo-Messungen zu ermöglichen (Schritt 2), wobei Sie immer 1 h nach der Sondierung beibehalten. Behalten Sie die verbleibende FITC-Dextran-Aufhängung für die Standardkurve bei. HINWEIS: Unmittelbar nach der Sonde kann das Futter ausgetauscht werden, um die Bildung von Kot zu gewährleisten.</li>
</ol>2. In-vivo-Fluoreszenzmessung
<ol><li>Anästhesieren Sie die Mäuse 1 h nach der Sonde mit 2,5% Isofluran oder einem alternativen Anästhetikum. Vergewissern Sie sich, dass das Tier angemessen betäubt ist, indem Sie den Zeh oder den Schwanz einklemmen und sicherstellen, dass das Tier nicht reagiert.<ol><li>Entfernen Sie das Fell mit einem Elektrorasierer aus dem Bauchbereich und tragen Sie großzügig eine ophthalmologische Gleitsalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Platzieren Sie dann die Mäuse einzeln in der dorsal liegenden Bildgebungskammer. HINWEIS: Es muss eine Kontrollmaus enthalten sein, die PBS oder Kochsalzlösung anstelle von FITC-Dextran empfängt, um den Hintergrund während der In-vivo-Bildgebung zu berücksichtigen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie die Mäuse mit einer Fluoreszenz-Bildgebungskammer dar (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie Bilder der Bauchregion auf, indem Sie die Laserlänge auf 470 nm und die Auflösung auf 2,0 mm einstellen.<ol><li>Starten Sie das Gerät und die Software, indem Sie auf die Starttaste klicken und diese gedrückt halten. Lassen Sie das System aufwärmen. HINWEIS: Das System kann 20 Minuten oder länger zum Aufwärmen benötigen, daher muss das Gerät frühzeitig gestartet werden, um die Bildgebung der Mäuse 1 Stunde nach dem Zahnfleisch nicht zu beeinträchtigen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Gerätestatus und stellen Sie sicher, dass alle konfigurierten Geräte "OK" anzeigen, bevor Sie fortfahren.</li>
		<li>Wärmen Sie bei Bedarf den entsprechenden Laser auf, indem Sie auf Lasersteuerung klicken und dann auf die Schaltfläche Lasername des gewünschten Lasers klicken.</li>
		<li>Starten Sie eine neue Studie, indem Sie auf Neue Studie klicken. Speichern Sie unter der entsprechenden Datei mit dem gewünschten Namen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Studienoptionen, geben Sie dann die Proben-ID ein und wählen Sie den richtigen Laser und das richtige Experiment aus.</li>
		<li>Öffnen Sie die Bildgebungskammer und legen Sie das Tier dorsal auf die Scanplatte. Sichern Sie die Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband und stellen Sie sicher, dass Nase und Mund genau in die Anästhesieröhre passen, wobei 2,5% Isofluran erhalten bleiben.</li>
		<li>Stellen Sie die Höhe der Scanplatte so ein, dass der Scanbereich leicht ventral von der Mittellinie des Tieres entfernt ist. Stellen Sie die Platte ein, indem Sie den Einstellknopf in der Bildgebungskammer drehen. Schließen und verriegeln Sie die Tür der Bildgebungskammer.</li>
		<li>Wählen Sie den zu scannenden Bereich mit dem Zeichenwerkzeug aus. Schließen Sie die gesamte Breite des Abdomens von knapp über der Leber bis zum Rektum ein. Klicken Sie auf das Werkzeug Ändern , um den gezeichneten Bereich anzupassen.</li>
		<li>Stellen Sie die Scanauflösung auf 2,0 mm ein und klicken Sie dann auf Weiter. Sobald die Energieautomatisierung abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Einstellungen korrekt sind, und nehmen Sie alle erforderlichen Anpassungen vor. Klicken Sie auf Start , um den Scan zu starten.</li>
		<li>Sobald der Scan abgeschlossen ist, nehmen Sie das Tier aus der Bildgebungskammer und legen Sie es in einen Inkubator, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, während Sie sich von der Anästhesie erholen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Studie fortsetzen , um die Einstellungen beizubehalten, und wiederholen Sie dann die Schritte 2.2.5-2.2.10, bis alle Mäuse gescannt wurden.</li>
		<li>Klicken Sie auf den Netzschalter und halten Sie ihn 3 Sekunden lang gedrückt, um die Bildgebungskammer auszuschalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewerten Sie die Fluoreszenz, indem Sie die abdominale Fluoreszenz jedes Tieres und der Kontrollmaus auf gleichmäßig skalierten Bildern mit einer Software vergleichen, die dem verwendeten Bildgebungssystem zugeordnet ist (siehe Materialtabelle).<ol><li>Öffnen Sie die Bilddateien, indem Sie sie unter dem gewählten Dateinamen suchen. Öffnen Sie alle Dateien, für die gleichzeitig Einstellungen synchronisiert wurden.</li>
		<li>Verwenden Sie in der Symbolleiste für Bildeinstellungen die Schaltflächen Bild synchronisieren und Skalierung synchronisieren, um die Einstellungen für die Bilder zu synchronisieren, um einen genauen Vergleich zu ermöglichen.</li>
		<li>Speichern Sie die Bilder mit ihren angepassten Maßstäben.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fluoreszenzmessung in Stuhlproben und Plasma
<ol><li>Sammeln Sie 4 Stunden nach der Sonde ein Kotpellet von jeder Maus in einem sterilen Röhrchen. Bewahren Sie die Röhren im Dunkeln auf Eis auf.</li>
	<li>Anästhesie der Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 240 mg/ml Pentobarbital-Natrium (Verdünnung, 1:100; siehe Materialtabelle). In einer Dosis von 0,03 ml / g Körpergewicht verabreichen.<ol><li>Blutproben von mindestens 700 μl werden in einem Röhrchen entnommen, das für die Plasmaentnahme mit Heparin oder EDTA ausgelegt ist, um die Gerinnung zu verhindern (siehe Materialtabelle), indem ein Glaskapillarröhrchen in den Plexus retroorbitalis14 eingeführt wird. HINWEIS: Alternative Methoden zur Blutentnahme sind Herzpunktion oder Rückzug aus der Schwanzvene. Da es sich um ein terminales Verfahren handelt, müssen die Mäuse durch eine Zervixluxation oder eine alternative humane Methode eingeschläfert werden. Befolgen Sie die Empfehlungen der örtlichen Tierethikkommission für Euthanasie.</li>
	</ol></li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 9.390 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Plasma in ein neues steriles Röhrchen und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf.</li>
	<li>Verdünnen Sie 50 mg Stuhlproben in 200 μl 1x PBS und verdünnen Sie das Plasma 1:2 mit 1x PBS. Das Verdünnungsverhältnis kann basierend auf der Intensität des Fluoreszenzsignals geändert werden.</li>
	<li>Erzeugen Sie eine Standardkurve mit seriellen Verdünnungen von FITC-Dextran in 1x PBS. Beginnend mit der höchsten Konzentration von 20 mg·ml−1 FITC-Dextran nacheinander 7-10 mal um den Faktor 1:1 verdünnen. ANMERKUNG: Die Konzentrationen müssen daher 20 mg·mL−1, 10 mg·mL−1, 5 mg·mL−1, 2,5 mg·mL−1, 1,25 mg·mL−1, 0,625 mg·mL−1, 0,3125 mg·mL−1 usw. betragen.</li>
	<li>Platte 100 μL Proben und Standards in einer undurchsichtigen schwarzen 96-Well-Platte. Fügen Sie ein PBS-Leerzeichen hinzu. Lesen Sie die Fluoreszenz auf einem Fluoreszenzplatten-Reader (siehe Materialtabelle) mit der Absorption bei 530 nm und der Anregung bei 485 nm ab. HINWEIS: Die Proben und Standards können doppelt oder dreifach plattiert werden, und dann werden ihre Fluoreszenzwerte gemittelt.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration von FITC-Dextran pro Probe, indem Sie die Fluoreszenz mit den bekannten Konzentrationen der Standardkurve vergleichen. In den Proben wird die Konzentration mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert (Schritt 3.5).</li>
</ol>

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<li>Lorenzo-Zuniga, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor+I+improves+intestinal+barrier+function+in+cirrhotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats.</a> Gut. 55 (9), 1306-1312 (2006).</li>
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<li>Schmitz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+tight+junction+structure+contributes+to+the+impaired+epithelial+barrier+function+in+ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered tight junction structure contributes to the impaired epithelial barrier function in ulcerative colitis.</a> Gastroenterology. 116 (2), 301-309 (1999).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Offenlegungen haben.

Die Darmbarrierefunktion ist ein integraler Bestandteil vieler verschiedener Krankheitsprozesse. Daher ist die Beurteilung der Darmpermeabilität auf nicht-invasive, kostengünstige und quantifizierbare Weise unerlässlich, um diese Krankheiten in Tiermodellen genau darzustellen. Der FITC-Dextran-Assay bietet die Möglichkeit für diese Darstellung. Dieses Protokoll umfasst jedoch mehrere kritische Schritte, die genau ausgeführt werden müssen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Erstens ist es wichtig, die Verwendung von FITC-Dextran in geeigneter Größe sicherzustellen. Für die Untersuchung der In-vivo-Permeabilität ist 4 kDa FITC-Dextran das optimale Molekulargewicht, und mit zunehmendem Molekulargewicht nimmt die Permeabilität ab15. Daher kann die Verwendung von FITC-Dextran mit einem anderen Molekulargewicht zu verwirrenden oder unzuverlässigen Ergebnissen führen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Zeit jeder Sonde zu notieren und die Zeitpunkte für die In-vivo-Datenerfassung und die Sammlung von Plasma und Kot entsprechend anzupassen. Wenn zum Beispiel zwei Mäuse im Abstand von 10 Minuten behandelt werden, müssen die In-vivo-Fluoreszenzmesswerte und die Sammlung von Kot und Plasma ebenfalls im Abstand von 10 Minuten erfolgen. Der Vergleich der Fluoreszenz zu den gleichen Zeitpunkten ermöglicht eine genauere Darstellung der Unterschiede in der Permeabilität. Darüber hinaus sollte die Reihenfolge, in der die Tiere aus verschiedenen Gruppen getestet werden, abgewechselt werden, um einen zeitlichen Clustereffekt zu vermeiden. Anstatt zuerst alle Tiere der Gruppe A und dann alle Tiere der Gruppe B (AAABBB) zu testen, wird empfohlen, die Gruppe nach jedem Tier (ABABAB) zu wechseln.
Dieser Assay kann so modifiziert werden, dass er nur die Auswertung von Plasma- und Stuhlproben umfasst, wenn kein Zugang zu einem Bildgebungsgerät besteht. Obwohl die direkte Fluoreszenzbildgebung in vivo die Visualisierung der Leberaufnahme und der verbleibenden abdominalen Fluoreszenz ermöglicht, liefert die Auswertung der Fluoreszenz in den Plasma- und Kotproben immer noch eine quantitative Messung der Darmpermeabilität. Darüber hinaus korrelieren, wie das beschriebene Experiment zeigt, die Fluoreszenzwerte im Plasma und im Kot gut mit der In-vivo-Bildgebung . Darüber hinaus kann dieser Assay so modifiziert werden, dass er nur die In-vivo-Bildgebung umfasst. Auf diese Weise können die Tiere am Leben erhalten werden, um andere Parameter weiter zu testen oder zu überwachen, wie sich die Darmpermeabilität im Laufe der Zeit verändert. Die Möglichkeit, diesen Assay zu modifizieren, macht ihn daher zugänglich und dennoch quantitativ. Schließlich wurde die Dosierung von 200 μl 80 mg·ml−1 FITC-Dextran, die jeder Maus verabreicht wurde, zuvor verwendet und hat sich bei Mäusen mit geringen Unterschieden im Körpergewicht als wirksam erwiesen16. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass alle Mäuse, die im Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse verwendet wurden, ungefähr 20 g wogen, so dass für jede Maus die gleiche Dosierung verwendet werden konnte. Um Unterschiede im Körpergewicht auszugleichen, kann FITC-Dextran jedoch in einer Dosierung von 0,6-0,8 mg/g Körpergewicht verabreicht werden, z. B.17. Unabhängig von der verwendeten Dosierung ist es wichtig, die Menge, die jeder Maus verabreicht wird, auf weniger als 10 ml·kg−1 zu begrenzen, um Komplikationen oder Beschwerden zu vermeiden18.
Obwohl der FITC-Dextran-Assay eine effektive Methode zur Bewertung der Darmbarrierefunktion bietet, weist er dennoch einige Einschränkungen auf. Eine Einschränkung dieses Modells besteht darin, dass die Mäuse mehrere Stunden lang gefastet werden müssen, was bedeutet, dass es unzuverlässig ist, diese Ergebnisse mit denen von Mäusen zu vergleichen, die nicht gefastet wurden. Darüber hinaus kann das Fasten die Ergebnisse in bestimmten Modellen beeinflussen, die strenge Fütterungspläne erfordern, z. B. bei der Messung des Blutzuckers in Tiermodellen für Diabetes.
Trotz dieser Einschränkungen bleibt der FITC-Dextran-Assay eine effektive Methode zur Analyse der Darmpermeabilität, da er quantitativ, vielseitig, kostengünstig und weniger invasiv ist als viele klassische Methoden. Gängige Sonden zur Messung der Darmpermeabilität sind beispielsweise kleine Saccharidsonden oder Cr-EDTA, die einige Vorteile haben19. Einige Saccharidsonden haben jedoch nur eine regionsspezifische Permeabilität. Da sie im distalen Teil des Dünndarms hydrolysiert werden, geben sie keinen Einblick in die Permeabilität des Dickdarms19. Auf der anderen Seite kann Cr-EDTA Informationen über die Dickdarmpermeabilität liefern, erfordert jedoch Messungen für 24 Stunden, wodurch der Zeitaufwand dieser Methode viel höher ist als der des FITC-Dextran-Assays20. Darüber hinaus bietet keine dieser Methoden die direkte In-vivo-Bildgebung dieses Assays. Daher bietet der FITC-Dextran-Assay eine relativ einfache, direkte und effektive Option im Vergleich zu alternativen Methoden zur Messung der Darmpermeabilität.
Schließlich ist bei Krankheitsprozessen wie IBDs4, Alzheimer21 und Lebererkrankung2 die intestinale Permeabilität ein wichtiger Parameter, der mit dem FITC-Dextran-Assay gemessen werden könnte, um Studien zu verbessern. Bei der Entwicklung neuartiger Behandlungen, wie z. B. Immuntherapien für IBDs, kann dieser Assay beispielsweise verwendet werden, um die Wirksamkeit des Therapeutikums zur Aufrechterhaltung der Integrität der Darmbarriere zu testen. In Anbetracht der Tatsache, dass eine beeinträchtigte Darmbarrierefunktion an der Aufrechterhaltung der chronischen Entzündung bei UC beteiligt sein kann, ist es beispielsweise wichtig zu untersuchen, wie gut ein Therapeutikum vor erhöhter Permeabilität schützt4. Dies ist nur ein Beispiel, aber der FITC-Dextran-Assay ist eine zugängliche und quantifizierbare Methode zur Messung der Darmpermeabilität in vielen verschiedenen Bereichen und Aspekten der Forschung.

Die Darmbarriere spielt sowohl bei der Gesundheit als auch bei der Krankheit eine wichtige Rolle. Es erfordert ein komplexes Gleichgewicht zwischen dem Eindringen der benötigten Nährstoffe aus dem Darmlumen in den Kreislauf und der gleichzeitigen Verhinderung des Eindringens von entzündungsfördernden Molekülen wie Krankheitserregern oder Antigenen1. Eine erhöhte Durchlässigkeit kann durch viele Magen-Darm-Erkrankungen wie Lebererkrankungen oder entzündliche Darmerkrankungen (CEDs) verursacht werden2,3. Bei Colitis ulcerosa (UC), einer IBD, führt eine chronische Entzündung beispielsweise zum Abbau von Tight Junctions, zur anschließenden Störung der Darmbarriere und zur Translokation von Bakterien, wodurch möglicherweise die Schleimhaut und die systemische Entzündung aufrechterhaltenwerden 4.
Die Integrität der Darmbarriere ist daher ein wichtiger Marker für die Darmgesundheit. Die derzeitigen Methoden zur Messung der Darmpermeabilität haben jedoch viele Einschränkungen. Zum Beispiel sind Methoden zur Messung von Plasma-Entzündungsmarkern oder bakterieller Translokation in Milz und Lymphknoten indirekt 5,6. Andere Methoden können invasiv und zeitintensiv sein. Dieser Artikel beschreibt einen nicht-invasiven und kostengünstigen Assay, der die intestinale Permeabilität direkt und quantitativ misst. Dieser Assay verwendet Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes Dextran (FITC-Dextran), um die Darmpermeabilität in Echtzeit durch Messung der Fluoreszenz in vivo zu verfolgen. Darüber hinaus quantifiziert die Messung des FITC-Dextran-Spiegels im Plasma und Kot die intestinale Permeabilität (Abbildung 1).
Der FITC-Dextran-Permeabilitätstest wurde bereits in vielen verschiedenen Kontexten verwendet, unter anderem in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit7, Sepsis8, ischämischem Schlaganfall9 und Verbrennungsverletzungen10. Darüber hinaus wurde dieser Assay kürzlich verwendet, um zu verstehen, wie das Darmmikrobiom an verschiedenen Krankheitsprozessen beteiligt sein kann und wie es als potenzielles Therapeutikum gezielt eingesetzt oder manipuliert werden kann. Zum Beispiel wurde es verwendet, um das Mikrobiom und Mikrobiom-basierte Therapeutika im Alter 11, IBDs12, Darmkrebs 13 und Autismus-Spektrum-Störung11 zu untersuchen. Da die Darmbarrierefunktion an zahlreichen Aspekten von Gesundheit und Krankheit beteiligt ist, wurde dieser Assay häufig verwendet. Aufgrund seiner relativen Einfachheit und seines geringen Zeitaufwands eignet es sich ideal zum Testen der In-vivo-Bedingungen, bei denen der Verdacht besteht, dass sie die Integrität der Darmbarriere verändern. Seine quantitativen Ergebnisse sind nützlich, um die Wirksamkeit einer potenziellen Behandlung zu bestimmen.
In dieser Studie wurde die Wirkung der Ernährung auf die Darmbarrierefunktion mit dem FITC-Dextran-Assay bewertet. Die intestinale Permeabilität von Mäusen, die eine Kontrolldiät erhielten, und die intestinale Permeabilität von Mäusen, die eine mit Inulin ergänzte Diät erhielten, wurden verglichen. Inulin ist ein nützliches Oligosaccharid, von dem gezeigt wurde, dass es die Darmbarrierefunktion verbessert12,13. Für In-vivo-Fluoreszenzmessungen (Hintergrund) wurde eine zusätzliche unbehandelte Maus als Negativkontrolle verwendet und erhielt PBS anstelle von FITC-Dextran. Dieses Experiment zeigt, dass der FITC-Dextran-Assay ein wertvolles Werkzeug zur Bewertung der Darmpermeabilität ist.

<table><tbody><tr><td>50 ppm Fe-Diät (10% Inulin)</td><td>Envigo Teklad</td><td>TD.190651</td><td>Repräsentative Ergebnisse</td></tr><tr><td>50 ppm Fe-Diät (FeSO4)</td><td>Envigo Teklad</td><td>TD.190723</td><td>Repräsentative Ergebnisse</td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse 49-55 Tage, Weibchen</td><td>Charles River&nbsp;</td><td>028BALB/C</td><td>Repräsentative Ergebnisse</td></tr><tr><td>BD 1 mL Spritze Tuberkulin Slip Tip</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>Für Sonden-BD-Microtainer-Röhrchen</td></tr><tr><td>- mit LH (Lithium-Heparin)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>365965</td><td>Für die Plasmaentnahme</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5420</td><td>Eppendorf</td><td>S420KN605698</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Sondennadel (Sondenkanüle) 7,7,0 38 mm x 22 G</td><td>Harvard Apparatus Canada</td><td>34-024</td><td>Nicht mehr lieferbar - Eine potentielle Alternative ist bei Instech Labs erhältlich (FTP-22-38)&nbsp;</td></tr><tr><td>Euthanyl (Pentobarbital-Natrium) 240 mg/ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>141704</td><td>1/100 Verdünnung; Verabreichung über intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 0,03 ml/g Körpergewicht</td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4</td><td>TdB Labs</td><td>20550</td><td></td></tr><tr><td>Heparinisierte Kapillarröhrchen</td><td>Kimble Chase Life Science and Research</td><td>2501</td><td>Für die retroorbitale Blutentnahme</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte, PS, 96-Well, flacher Boden (Chimney Well), Schwarz, Flutrac, Med. Bindung</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>MiniARCO Clipper Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>CL8787-KIT</td><td>Für die Haarentfernung</td></tr><tr><td>Optix MX2 und Optix Optiview</td><td>Advanced Research Technologies</td><td>2.02.00.6</td><td>Fluoreszenzbildgebungsgerät und Software</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS)</td><td>Wisent Inc</td><td>311-010-LL</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Salbe</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td>Augensalbe zur Vermeidung von Augenschäden während der Anästhesie</td></tr><tr><td>Spark Multiplatten-Lesegerät</td><td>Tecan</td><td>30086376</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der integrität der darmbarriere bei mäusen unter verwendung von fluorescein-isothiocyanat-markiertem dextran

Assessment of Gut Barrier Integrity in Mice Using Fluorescein-Isothiocyanate-Labeled Dextran

Die Integrität der Darmbarriere ist ein Kennzeichen der Darmgesundheit. Während die Integrität der Darmbarriere anhand indirekter Marker wie der Messung von Plasma-Entzündungsmarkern und der bakteriellen Translokation in Milz und Lymphknoten beurteilt werden kann, quantifiziert der Goldstandard direkt die Fähigkeit ausgewählter Moleküle, die Darmschleimhautschicht in Richtung des systemischen Kreislaufs zu durchqueren. Dieser Artikel verwendet eine nicht-invasive, kostengünstige und aufwandsarme Technik, um die Darmpermeabilität bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran (FITC-Dextran) in Echtzeit zu quantifizieren und zu verfolgen. Vor der oralen Supplementierung mit FITC-Dextran werden die Mäuse nüchtern. Anschließend werden sie mit FITC-Dextran verdünnt, das in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt ist. Eine Stunde nach der Sonde werden die Mäuse einer Vollnarkose mit Isofluran unterzogen und die In-vivo-Fluoreszenz in einer Bildgebungskammer sichtbar gemacht. Diese Technik zielt darauf ab, die Restfluoreszenz in der Bauchhöhle und die Leberaufnahme zu bewerten, was auf eine portale Migration der Fluoreszenzsonde hindeutet. Blut- und Stuhlproben werden 4 Stunden nach der oralen Sonde entnommen und die Mäuse werden getötet. Plasma- und Stuhlproben, die in PBS verdünnt sind, werden dann plattiert und die Fluoreszenz wird aufgezeichnet. Die Konzentration von FITC-Dextran wird dann anhand einer Standardkurve berechnet. In früheren Forschungen hat die In-vivo-Bildgebung gezeigt, dass sich die Fluoreszenz bei Mäusen mit einer schwächeren Darmbarriere, die durch eine ballaststoffarme Ernährung induziert wird, schnell auf die Leber ausbreitet, während bei Mäusen, die mit Ballaststoffen zur Stärkung der Darmbarriere ergänzt wurden, das Fluoreszenzsignal hauptsächlich im Magen-Darm-Trakt erhalten bleibt. Darüber hinaus hatten Kontrollmäuse in dieser Studie eine erhöhte Plasmafluoreszenz und eine reduzierte Fluoreszenz im Stuhl, während umgekehrt Inulin-ergänzte Mäuse höhere Fluoreszenzsignale im Darm und niedrige Spiegel im Plasma aufwiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll qualitative und quantitative Messungen der Darmpermeabilität als Marker für die Darmgesundheit liefert.

Die Analyse der In-vivo-Fluoreszenz zeigte, dass Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten, eine höhere Leberaufnahme von FITC-Dextran und höhere Restfluoreszenzwerte in der Bauchhöhle aufwiesen als die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten (Abbildung 2A). Eine gewisse Fluoreszenz war im Blinddarm der Mäuse sichtbar, die die Inulin-Diät erhielten, aber es gab wenig bis gar keine Leberaufnahme, was darauf hindeutet, dass diese Diäten vor einer erhöhten Darmpermeabilität schützten.
Die Fluoreszenzwerte in Plasma- und Stuhlproben verstärken und quantifizieren ihre In-vivo-Gegenstücke . Die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten, hatten signifikant niedrigere FITC-Dextran-Spiegel in ihrem Plasma im Vergleich zu den Mäusen, die nur die Kontrolldiät erhielten (Abbildung 2B). Dies deutet darauf hin, dass sie eine verbesserte Darmbarrierefunktion hatten, da weniger FITC-Dextran die Darmbarriere in den Kreislauf durchdringen konnte. Übereinstimmend hatten die Mäuse, die die Inulin-Diät erhielten, signifikant höhere Konzentrationen von FITC-Dextran in ihrem Kot als die Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten (Abbildung 2C). Dies bestätigt, dass sie eine intakte Darmbarrierefunktion hatten, da das FITC-Dextran bis zur Ausscheidung im Dickdarm verblieb, wie es als normal angesehen wird. Die niedrigeren Konzentrationen von FITC-Dextran im Kot der Kontrollmäuse deuten darauf hin, dass es durch die Darmbarriere in den Kreislauf gelangt ist, anstatt angemessen ausgeschieden zu werden. Die hohen Konzentrationen von FITC-Dextran im Plasma verstärken diesen Befund.
<img alt="In vivo Fluoreszenzanalyse bei 530 nm mit FITC-Dextran; Plasma- und Kotkonzentrationsdiagramme." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64710/64710fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Eine Nahrungsergänzung mit Inulin verringert die Translokation von FITC-Dextran durch die Darmbarriere. (A) Die Restfluoreszenz und hepatische Aufnahme von FITC-Dextran. Rot = höchste Intensität; dunkelviolett = niedrigste Intensität. Maximale Fluoreszenz von 2,15 x 103, minimale Fluoreszenz von 0,378. (B) Die plasmatische Konzentration von FITC-Dextran. P = 0,010. (C) Die Stuhlkonzentration von FITC-Dextran. P = 0,00003. N = 4 pro Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± REM dargestellt. Jeder Punkt steht für eine Maus. Ungepaarter Schüler-t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64710/64710fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

In der vorliegenden Studie wird Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC) Dextran Mäusen über eine orale Sonde verabreicht, um die Darmpermeabilität sowohl in vivo als auch in Plasma- und Kotproben zu bewerten. Da die Barrierefunktion des Darms bei vielen Krankheitsprozessen beeinträchtigt ist, kann dieser direkte und quantitative Assay in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

Gut barrier integrity is a hallmark of intestinal health. While gut barrier integrity can be assessed using indirect markers such as the measurement of ...

Diese Methode hilft bei der Beantwortung von Fragen darüber, ob eine Erkrankung die Integrität der Darmbarriere verändert oder ob eine mögliche Behandlung die Integrität der Darmbarriere aufrechterhalten kann. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine nicht-invasive, belastende Technik zur Bewertung und Quantifizierung der Darmpermeabilität in vivo bietet. Um zu beginnen, fasten Sie die Mäuse für vier Stunden und verabreichen Sie dann 200 Mikroliter der FITC-Dextran-Suspension über eine orale Sonde an jede Maus mit einer sterilisierten 38-Millimeter-22-Gauge-Sondennadel.Starten Sie einen Timer nach der ersten Sonde und warten Sie fünf bis 10 Minuten zwischen den einzelnen Sonden, um In-vivo-Messungen zu ermöglichen, wobei Sie eine Stunde nach der Sonde beibehalten werden. Behalten Sie die verbleibende FITC-Dextran-Aufhängung für die Standardkurve bei. Starten Sie das Gerät und die Software, indem Sie auf die Starttaste klicken und diese gedrückt halten, und lassen Sie das System aufwärmen.Klicken Sie auf Gerätestatus und stellen Sie sicher, dass alle konfigurierten Geräte OK anzeigen, bevor Sie fortfahren. Klicken Sie dann auf Neue Studie und speichern Sie die Datei unter dem gewünschten Namen. Klicken Sie anschließend auf Studienoptionen.Geben Sie die Proben-ID ein und wählen Sie den richtigen Laser und das richtige Experiment aus. Entfernen Sie dann das Fell mit einem Elektrorasierer aus dem Bauchbereich und tragen Sie eine Veterinärsalbe großzügig auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Öffnen Sie die Bildgebungskammer und legen Sie das Tier dorsal auf die Scanplatte.Befestigen Sie dann die Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband. Wählen Sie als Nächstes den zu scannenden Bereich mit dem Zeichenwerkzeug aus. Stellen Sie sicher, dass Sie die gesamte Breite des Abdomens von knapp über der Leber bis zum Rektum umfassen.Klicken Sie dann auf das Werkzeug Ändern, um den gezeichneten Bereich anzupassen. Stellen Sie die Scanauflösung auf 2,0 Millimeter ein und klicken Sie auf Start, um den Scan zu starten. Öffnen Sie als Nächstes die Bilddateien, indem Sie sie unter dem gewählten Dateinamen suchen, und öffnen Sie gleichzeitig alle Dateien mit synchronisierten Einstellungen.Verwenden Sie in der Symbolleiste für Bildeinstellungen die Schaltflächen Bild synchronisieren und Skalierung synchronisieren, um die Bildeinstellungen für einen genauen Vergleich zu synchronisieren. Speichern Sie dann die Bilder mit den angepassten Maßstäben. Vergleichen Sie die abdominale Fluoreszenz jedes Tieres und der Kontrollmaus auf gleichmäßig skalierten Bildern mit einer Software, die dem Bildgebungssystem zugeordnet ist.Sammeln Sie vier Stunden nach der Sonde ein Kotpellet von jeder Maus in einem sterilen Röhrchen. Halten Sie die Röhrchen dann auf Eis und stellen Sie sie in die Dunkelheit. Als nächstes zentrifugieren Sie die Blutproben bei 9.390 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Übertragen Sie dann das Plasma in ein neues steriles Röhrchen und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf. Verdünnen Sie 50 Milligramm Stuhlproben in 200 Mikrolitern PBS und verdünnen Sie das Plasma mit PBS im Verhältnis eins zu zwei. Platte 100 Mikroliter Proben und Standards in einer undurchsichtigen schwarzen 96-Well-Platte.Lesen Sie die Fluoreszenz auf einem Fluoreszenzplatten-Reader mit Anregung bei 485 Nanometern und Absorption bei 530 Nanometern. Bestimmen Sie schließlich die Konzentration von FITC-Dextran pro Probe, indem Sie die Fluoreszenz mit den bekannten Konzentrationen der Standardkurve vergleichen. Die Analyse der In-vivo-Fluoreszenz zeigte, dass Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten, eine höhere Leberaufnahme von FITC-Dextran und höhere Restfluoreszenzwerte in der Bauchhöhle aufwiesen als die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten.Die Mäuse, die die mit Inulin ergänzte Diät erhielten, hatten signifikant niedrigere FITC-Dextran-Spiegel in ihrem Plasma im Vergleich zu den Mäusen, die nur die Kontrolldiät erhielten. Übereinstimmend hatten die Mäuse, die die Inulin-Diät erhielten, signifikant höhere FITC-Dextran-Spiegel in ihrem Kot als die Mäuse, die nur die Kontrolldiät erhielten. Die niedrigeren Konzentrationen von FITC-Dextran im Kot der kontrollierten Mäuse deuten darauf hin, dass es durch die Darmbarriere in den Kreislauf gelangt ist, anstatt angemessen ausgeschieden zu werden.Die hohen Konzentrationen von FITC-Dextran im Plasma bestätigten diesen Befund. Das Timing ist wichtig, wenn Sie dieses Verfahren versuchen. Die Fluoreszenzmessung und Probenentnahme sollte für jede einzelne Maus so nah wie möglich an einer Stunde und vier Stunden nach der Sonde erfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video stellt eine Methode vor, mit der die Integrität des Darmlumens von C. elegans durch die Fütterung von Würmern mit FITC-markiertem Dextran visualisiert und gemessen werden kann. Das Beispielprotokoll zeigt den Assay, der mit 3,3'-Diindolylmethan (DIM)-behandelten und mit Krankheitserregern gefütterten Würmern durchgeführt wurde.

FITC-Dextran-Fütterung: Eine Methode zur Quantifizierung der Darmpermeabilität bei C. elegans

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von exzidierten Darmgewebepräparaten oder "Darmsäcken" als ex vivo Modell der Darmbarrierefunktion. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Integrität sowohl der Epithelbarriere als auch der Schleimhautgelschicht an spezifischen Darmstellen in Tiermodellen für Verdauungserkrankungen zu beurteilen.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

Aktuelle Behandlungen von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zielen darauf ab, die Krankheitssymptome zu lindern, kann aber schwere Nebenwirkungen verursachen. Somit sind alternative Strategien in Tier Colitis-Modellen untersucht. Hier erklären wir, wie die positiven Wirkungen von Nahrungsergänzungsmitteln auf die klinische IBD Zeichen sind in einer solchen ulcerosa Modell analysiert.

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Dieses Protokoll beschreibt die Messung der epitheliale Barriere Permeabilität in Echtzeit folgende pharmakologische Behandlung im menschlichen Darm Organellen mit Fluoreszenz-Mikroskopie und live-Cell-Mikroskopie.

Echtzeitmessung der epitheliale Barriere Permeabilität im menschlichen Darm Organellen

Zwei Methoden werden hier vorgestellt, um intestinale Barrierefunktion zu bestimmen. Eine epitheliale Meter (Volt/Ohm) dient zur Messung des elektrischen Widerstands berührt der kultivierten Epithelien direkt in Gewebekultur Brunnen. Bei Mäusen ist die FITC-Dextran-Magensonde-Methode zur Ermittlung der intestinalen Permeabilität in Vivo.

In Vitro und In Vivo Ansätze Darm Epithelzelle Durchlässigkeit zu bestimmen

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten Ansatz zur quantitativen Bewertung der Integrität der murinen gingivalen Epithelbarriere zu bieten, indem fluoreszenzmarkierte Dextrans unterschiedlicher Molekülgröße in vivo auf die Gingivaloberfläche topisch aufgetragen werden, gefolgt von einer ex-vivo-Bildgebung mit einem Einzelphotonenmikroskopiesystem.

Funktionelle Beurteilung der Maus-Gingival-Epithelbarriere mit fluoreszierenden Traceren

Dieses Video zeigt die Technik zur Gewinnung von DNA aus den Arten von Mikroben mit Wohnsitz in der Termite Enddarm. Die Herstellung eines Nasspräparat Rutsche, die nützlich für die Visualisierung der gut mikrobiellen Gemeinschaft ist, ist auch dargestellt, und eine Tour durch die artenreiche gut Umfeld gegeben ist.

Extrahieren von DNA aus dem Gut Mikroben der Termite (Zootermopsis Angusticollis) und visualisieren Gut Mikroben

Erfahren Sie die Beurteilung der Darmbarriereintegrität bei Mäusen mittels FITC-Dextran per Schlundsonde. Diese nicht-invasive Methode ermöglicht die quantitative Analyse der intestinalen Permeabilität in vivo.

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

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