Mikrodissektion und Whole-Mount-Rasterelektronenmikroskopie Visualisierung des Aderhautplexus der Maus
December 16th, 2022
Der Plexus choroideus (CP), ein in den Neurowissenschaften wenig erforschtes Gewebe, spielt eine Schlüsselrolle bei der Gesundheit und Erkrankung des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt eine Mikrodissektionstechnik zur Isolierung des CP und die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, um einen Gesamtüberblick über seine zelluläre Struktur zu erhalten.
Um einen besseren Einblick in die Zusammensetzung und Struktur des Plexus choroideus zu erhalten, ist eine effiziente Methode zur Isolierung des Plexus choroideus aus den Hirnventrikeln ein erster unschätzbarer Schritt. Mit dieser Mikrodissektionstechnik ist es möglich, den Plexus choroideus aus den Hirnventrikeln zu sezieren und gleichzeitig seine Funktion, Lebensfähigkeit und Struktur einzudämmen, ohne den Plexus choroideus mit dem umgebenden Gewebe zu kontaminieren. Eine wesentliche Hürde bei der Isolierung des Plexus choroideus ist die Identifizierung der Struktur, da sie noch in den Hirnventrikeln schwimmt.
Die Färbung des Plexus choroideus mit Bromphenolblau erleichtert die Isolierung. Elien Van Wonterghem, unser Laborleiter, wird das Verfahren vorführen. Beginnen Sie mit der Herstellung eines terminalen Anästhetikums, einer transkardialen Perfusionslösung und einer Lösung, die für die Rasterelektronenmikroskopie (REM) erforderlich ist, und anderen Lösungen, wie im Text erwähnt.
Um das Mäusegehirn zu isolieren, bringen Sie das unheilbar betäubte Tier in die dorsale Dekubitusposition und fixieren Sie die Maus, indem Sie die Gliedmaßen auf eine Platte nageln. Desinfizieren Sie den Brustkorb, indem Sie 70%iges Ethanol aufsprühen, bevor Sie mit einer chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl einen Schnitt von etwa vier Zentimetern direkt unter dem Zwerchfell machen. Öffnen Sie die Haut und legen Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere frei.
Schneiden Sie das Zwerchfell vollständig auf und trennen Sie den Brustkorb, um die Lunge und das schlagende Herz freizulegen. Mit einer Perfusionspumpe wird die Maus mit 10 Millilitern der Perfusionslösung mit einer Rate von 4,5 Millilitern pro Minute transkardial. Führen Sie eine 26-Gauge-Nadel in die linke Herzkammer ein, um die Lösung in den Systemkreislauf zu pumpen.
Schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere den rechten Vorhof ab, damit das Blut aus dem Kreislauf entweichen kann. Nach der Enthauptung der Maus schneiden Sie die Kopfhaut auf, indem Sie einen Schnitt machen, der zwischen den Ohren beginnt und über den Augen liegt. Ziehe die Haut seitlich heraus, um den Schädel freizulegen.
Schneiden Sie dann den Schädel auf, indem Sie den Plattenepithelnähten in Richtung des Nasenteils folgen. Wenn Sie fertig sind, legen Sie das Gehirn in eine eiskalte Petrischale und geben Sie einen Milliliter eiskaltes PBS in das Gehirngewebe. Um den im vierten Ventrikel schwimmenden Aderhautplexus zu isolieren, schneiden Sie das Kleinhirn mit einem Skalpell vorsichtig vom Großhirn ab.
Entfernen Sie die verbleibenden Teile des Hirnstammgewebes aus dem Kleinhirn. Drehen Sie das Gehirn so, dass die Schnittlinie nach oben zeigt, und achten Sie darauf, dass die vierte Ventrikelhöhle in der Mitte des Schnitts sichtbar ist und der Plexus choroideus an der dorsalen Stelle liegt. Öffnen Sie bei Bedarf die Herzkammer, indem Sie mit einer scharfen Pinzette am Bindegewebe ziehen.
Reißen Sie den Plexus choroideus vorsichtig mit einer winzigen scharfen Pinzette aus der Ventrikelwand. Um den Plexus choroideus vom seitlichen Ventrikel zu isolieren, schneiden Sie das Gehirn mit einer winzigen scharfen Pinzette in zwei Hemisphären. Drehen Sie eine Gehirnhälfte so, dass die Schnittlinie nach oben zeigt.
Um den Seitenventrikel freizulegen, ziehen Sie die Hirnrinde sanft vom Thalamus weg. Ziehen Sie den Hippocampus bis zur mittleren sagittalen Schnittlinie zurück. Der laterale Ventrikel ist nun sichtbar, wobei der Plexus choroideus am unteren Ende des Ventrikels liegt.
Öffnen Sie bei Bedarf die Herzkammer, indem Sie das Bindegewebe mit einer scharfen Pinzette aufziehen. Verwenden Sie eine winzige scharfe Pinzette, um den Plexus choroideus vorsichtig aus der Ventrikelwand zu reißen. Um die Probenvorbereitung für das REM durchzuführen, wird der frisch isolierte Aderhautplexus in eine frisch hergestellte Fixationslösung überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert.
Danach waschen Sie die Probe dreimal mit drei bis fünf Millilitern 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer für jeweils fünf Minuten. Die Proben werden 30 Minuten lang in drei bis fünf Millilitern 2%Osmiumtetroxid in 0,1 molaren Natriumcacodylatpuffer fixiert. Anschließend waschen Sie die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten mit drei bis fünf Millilitern Reinstwasser.
Als nächstes werden die Proben in einer zunehmenden Reihe von eiskalten Ethylalkoholkonzentrationen mit 15 Minuten pro Ethylalkohollösung dehydriert. Verwenden Sie einen Trockner an kritischen Punkten, um die Probe richtig zu trocknen. Positionieren Sie die Probe sorgfältig auf einer Probenhalterung mit einem Kohleaufkleber und visualisieren Sie die Proben des Aderhautplexus mit REM.
Das vorliegende Protokoll ermöglichte die effiziente Isolierung des Plexus choroideus vom lateralen und vierten Ventrikel des Mausgehirns. Die Perfusion mit Bromphenolblau führte zur Visualisierung des Plexus choroideus. Wenn Bromphenolblau in den weiteren Verarbeitungsschritten nicht zugelassen war, wurde eine Perfusion mit PBS-Heparin oder keine Perfusion zur Verarbeitung durchgeführt.
Die morphologische REM-Analyse der Oberfläche von Zellen des Plexus choroidecleus (CPE) zeigt deutlich die zweiarmige Struktur des vierten Ventrikels und die typische C-förmige Form des Plexus choroideus lateralis, die aus dem lateralen Ventrikel isoliert ist. Eine höhere REM-Vergrößerung zeigte vesikelartige Strukturen auf der apikalen Seite von CPE-Zellen und Mikrovilli, was darauf hindeutet, dass morphologische Veränderungen der CPE-Zellen unter Krankheitsbedingungen mit Hilfe von REM untersucht werden können. Es ist wichtig, nur das Gewebe des Plexus choroideus zu berühren und herauszunehmen, um die Probe nicht mit dem umgebenden Gewebe zu kontaminieren.
Seien Sie vorsichtig, um die Struktur des Plexus choroideus zu erhalten. Eine Vielzahl von nachgeschalteten Techniken kann auf den isolierten Plexus choroideus angewendet werden, um seine Struktur und Funktion zu untersuchen, von der Mikroskopanalyse über die Transkriptomanalyse bis hin zur Durchflusszytometrie. Die Mikrodissektion des Plexus choroidoid aus dem Gehirn ermöglicht es uns, einen besseren Einblick in die Struktur und Funktion dieses winzigen Hirngewebes zu erhalten.
Dieses Wissen ist unerlässlich, um seine Rolle bei neurologischen Erkrankungen besser zu verstehen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Mikrodissektionstechnik zur Isolierung des Chorioidea (CP) aus den Hirnventrikeln von Mäusen sowie die Verwendung der Rasterelektronenmikroskopie (REM) zur Untersuchung seiner zellulären Struktur. Das Verständnis der Architektur und Funktion des CP ist in der Neurowissenschaft von wesentlicher Bedeutung, insbesondere im Hinblick auf seine Beteiligung an der Gesundheit und Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaft
- Neuroanatomie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Der Chorioidea ist ein wichtiges, aber noch wenig untersuchtes Gewebe.
- Er spielt eine entscheidende Rolle für die Gesundheit und Pathologie des zentralen Nervensystems.
- Die effiziente Isolierung und Charakterisierung des CP hat Auswirkungen auf das Verständnis neurologische Krankheiten.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung des Chorioidea aus den Hirnventrikeln von Mäusen zu entwickeln.
- Die zelluläre Struktur des Chorioidea mittels Rasterelektronenmikroskopie zu untersuchen.
- Die Lebensfähigkeit und Integrität des Chorioidea während der Isolierung zu bewahren.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendet Mikrodissektionstechniken zur Isolierung des Chorioidea.
- Mäusemodelle werden während des Isolierungsprozesses verwendet, mit besonderem Fokus auf den vierten und lateralen Ventrikel.
- Die Methodik umfasst terminale Anästhesie, chirurgische Verfahren und Fixierung für die REM-Analyse.
- Kritische Schritte beinhalten die Verwendung von Bromphenolblau-Färbung zur verbesserten Visualisierung und sorgfältiges Handling zur Vermeidung von Kontamination.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll isolierte effektiv den Chorioidea und ermöglichte eine morphologische Analyse durch REM.
- Beobachtungen offenbarten definitive strukturelle Merkmale der Chorioidea-Epithelzellen, einschließlich Mikrovilli und vesikelartige Strukturen.
- Diese Erkenntnisse ermöglichen nachfolgende Untersuchungen von krankheitsbedingten Veränderungen auf zellulärer Ebene.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert einen optimierten Ansatz zur Isolierung des Chorioidea für detaillierte strukturelle Analysen.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können das Verständnis der Rolle des CP in der neurologischen Gesundheit und Krankheit verbessern.
- Insgesamt ermöglicht die Methode einen bedeutenden Fortschritt in der Untersuchung dieser entscheidenden, aber oft übersehenen Hirnkomponente.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Efficient microdissection and SEM visualization of the mouse choroid plexus (CP) enable high-fidelity structural and functional analysis of this critical CNS interface. This workflow supports early discovery efforts by providing uncontaminated, viable CP tissue for downstream molecular and morphological studies, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in neurobiological research. Reliable CP isolation underpins translational continuity for CNS disease models and biomarker exploration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of CP structure and function for target validation in CNS research.
- Supports mechanistic de-risking by preserving tissue viability and minimizing contamination.
- Facilitates predictive confidence in early-stage neurobiological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides validated CP tissue for quantitative downstream assays, including transcriptomics and proteomics.
- Ensures reproducibility and standardization by maintaining structural integrity during isolation.
- Prepares samples suitable for high-resolution imaging and scalable analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables investigation of disease-relevant morphological changes in CP epithelial cells using SEM.
- Supports alignment of preclinical models with human CNS disease mechanisms.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural findings to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This microdissection and SEM protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing foundational tissue samples for molecular, cellular, and imaging analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating uncontaminated CP tissue.
- Screening: Delivers assay-ready samples for reproducible quantitative measurements.
- Analytics: Enables high-resolution morphological readouts and comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling disease-relevant structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, standardization, and scalability in tissue preparation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microdissection and SEM sample preparation.
- Needs access to perfusion equipment, fixation reagents, and electron microscopy infrastructure.
- Demands strict cross-team standardization to avoid tissue contamination.
- Adaptable to other species with protocol modifications as needed.
- Careful handling is essential to preserve CP structure and downstream analytical quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:59
Microdissection of the Choroid Plexus Out of the Lateral and Fourth Ventricle
3:47
Morphological Analysis of Choroid Plexus Tissue Using Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:48
Results: Isolation of Choroid Plexus and Analysis of Cellular Structure
5:49
Conclusion
