Erforschung von X-Chromosomen-Aberrationen in Ovarialzellen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Die FISH-Analyse von Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen ist eine einzigartige Technik, um Einblicke in den X-Chromosomengehalt von Eierstockzellen in dieser speziellen Gruppe zu erhalten. Diese Techniken könnten hilfreich sein, um mehr über das Fortpflanzungspotenzial von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erfahren. Es ist wichtig zu erwähnen, dass beide Methoden die zukünftige Forschung erleichtern sollen und nicht als diagnostisches Werkzeug in der klinischen Praxis konzipiert sind.

Das Verfahren wird von Ronald Peek, einem leitenden Forscher unseres Fruchtbarkeitslabors, und Milad Intezar, einem Analysten unserer Pathologieabteilung, demonstriert. Schneiden Sie zunächst das kryokonservierte oder aufgetaute Gewebe der Eierstockrinde mit einem Skalpell in kleine Stücke von einem Millimeter nach dem anderen. Die Gewebefragmente in vier Litern vorgewärmtem L15 75 Minuten bei 37 Grad Celsius enzymatisch verdauen.

Pipettieren Sie die Verdauungsmischung alle 15 Minuten auf und ab. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie vier Milliliter kaltes L15 hinzufügen, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) ergänzt wird. Waschen Sie das dissoziierte Gewebe einmal mit acht Millilitern kaltem L15-Medium durch Zentrifugation bei 500 g, bevor es in 500 Mikrolitern L15-Medium resuspendiert wird.

Die Zellsuspension, die größtenteils einzelne Stromazellen und kleine Follikel enthält, wird in eine Petrischale aus Kunststoff überführt und unter dem Stereomikroskop untersucht. Entnahme der Follikel mit einer Größe von weniger als 50 Mikrometern manuell mit einer 75-Mikrometer-Kunststoffpipette und übertragen Sie sie bei vier Grad Celsius in das Tröpfchen L15-Medium, das mit 10 % FBS angereichert ist. Übertragen Sie dann die gereinigten Follikel in eine Lösung mit 0,06 % Trypsin, einem Milligramm pro Milliliter EDTA und einem Milligramm pro Milliliter Glukose und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nach der Inkubation werden mit einer 75 Mikrometer langen Kunststoffpipette ovarielle Stromazellen aus der Suspension der Kortexzellen gewonnen. Für die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung oder FISH-Analyse einzelner Eierstockzellen werden die behandelten Eierstockfollikel mit Trypsin/EDTA/Glukose oder Stromazellen in Tröpfchen von fünf Mikrolitern 0,15 millimolarem Kaliumchlorid und 15 Mikrolitern DPBS auf einem Objektträger übertragen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Trocknen und fixieren Sie den Objektträger zwei Minuten lang in 300 Mikrolitern 0,05 millimolar Kaliumchlorid, 7,5 % Essigsäure und 22,5 % Methanol.

Decken Sie den Objektträger zwei Minuten lang mit drei zu eins Methanolessigsäure ab, um die Fixierung abzuschließen. Nach der Fixierung waschen Sie die Probe zweimal in frisch zubereitetem SSC bei 73 Grad Celsius. Decken Sie es mit 100 Mikrolitern 2%Proteinase K ab und verschließen Sie es mit einem Deckglas.

Inkubieren Sie den Objektträger für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Hybridisierungsstation. Entfernen Sie nach der Inkubation das Deckglas und waschen Sie den Objektträger fünf Minuten lang in DPBS bei Raumtemperatur unter Schütteln. Fixieren Sie die Probe fünf Minuten lang mit 1%igem Formaldehyd.

Waschen Sie dann den Objektträger in DPBS und dehydrieren Sie ihn seriell in steigenden Ethanolkonzentrationen für jeweils zwei Minuten. Trocknen Sie die Probe an der Luft, bevor Sie sie mit fluoreszenzmarkierten Sonden hybridisieren. Als nächstes geben Sie einen Mikroliter CEPX, einen Mikroliter CEP18 und 18 Mikroliter des Hybridisierungspuffers in die Probe und verschließen Sie sie mit einem Deckglas, das auf den Objektträger geklebt wird.

Überführen Sie den Objektträger zur Denaturierung bei 73 Grad Celsius für drei Minuten in die Hybridisierungsstation, gefolgt von der Hybridisierung während einer Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach der Hybridisierung das Deckglas und den restlichen Kleber vom Objektträger. Waschen Sie den Objektträger zwei Minuten lang in 0,4-fachem SSC, 0,3 % Tween-20 bei 72 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubationsminute für eine Minute in 2-fachem SSC und 0,1 % Tween-20.

Dörren Sie den Objektträger wie gezeigt und trocknen Sie ihn im Dunkeln an der Luft, bevor Sie ihn mit einem Eindeckmedium abdecken, das DAPI enthält. Legen Sie den Objektträger für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius ab, bevor Sie ihn fluoreszenzmikroskopisch analysieren. Um Paraffinschnitte zu hybridisieren, wählen Sie neue Schnitte vor oder nach dem Schnitt aus, der Follikel aus dem Paraffinband enthält.

Montieren Sie einen Abschnitt auf einem Objektträger und trocknen Sie ihn 45 Minuten lang auf einem Herd bei 56 Grad Celsius. Entparaffinieren Sie den Abschnitt 10 Minuten lang in Xylol, tauchen Sie den Objektträger dann in 99,5%iges Ethanol und spülen Sie ihn fünf Minuten lang in Leitungswasser ab. Behandeln Sie den Objektträger 10 Minuten lang bei 96 Grad Celsius mit der Zielrückhollösung vor.

Spülen Sie den Objektträger nach dem Abkühlen in destilliertem Wasser ab. Behandeln Sie den Objektträger fünf Minuten lang mit 0,01 molarer Salzsäure, gefolgt von einer Pepsinverdauung für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie den Objektträger erneut in Salzsäure und anschließend in PBS ab.

Fixieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in 1%igem Formaldehyd-PBS. Spülen Sie den Objektträger dann kurz in PBS und erneut in demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie ihn in 99,5%igem Ethanol dehydrieren. Tragen Sie fünf Mikroliter Sonde CEP18 und CEPX auf den vorbehandelten Objektträger auf.

Bringen Sie dann ein Deckglas an und versiegeln Sie die Stelle mit Fotokleber. Legen Sie den Objektträger zur Denaturierung bei 80 Grad Celsius für 10 Minuten und zur Hybridisierung über Nacht bei 37 Grad Celsius in einen Hybridisator. Spülen Sie den Objektträger am nächsten Tag zweimal für jeweils fünf Minuten in SSC bei 42 Grad Celsius, gefolgt von einer zweiminütigen und einer einminütigen Spülung in 0,3%Nonidet P-40 bei 73 Grad Celsius.

Spülen Sie den Objektträger erneut in 2X SSC und anschließend in destilliertem Wasser ab, bevor Sie ihn mit 99,5 % Ethanol dehydrieren. Trocknen Sie den Objektträger an der Luft und montieren Sie ihn in einem DAPI-haltigen Eindeckmedium. Kryokonserviertes Ovarialrindengewebe bei Patientin A zeigte 50 % der Lymphozyten, einen 45-X-Karyotyp und 50 % 46, XX.In Patientin B waren 38 % der Lymphozyten 45, X, 28 % waren 46, XX und 34 % waren 47, XXX.

Umliegende Stromazellen wurden ebenfalls auf ihren X-Chromosomengehalt untersucht. Die enzymatische Verdauung des Gewebes der Ovarialrinde führte zu einer Suspension weitgehend dissoziierter Zellen, wobei jedoch die primordialen Follikel übrig blieben, die aus einer intakten Eizelle bestanden, die von einer einzigen Schicht von Granulosezellen umgeben war. Kleine Follikel erschwerten die Interpretation von Signalen nach FISH, was auf die Verklumpung der Granulosezellen zurückzuführen war.

Eine zusätzliche Verdauung der Follikel mit Trypsin vor FISH führte dazu, dass sich einzelne Granulosezellen zu einer kugelförmigen Morphologie auf der Oberfläche der Follikel zusammenzogen. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte morphologisch normale sekundäre und antrale Follikel im Gewebe der Ovarialrinde nach fünfmonatiger Xenotransplantation. Der X-chromosomale Gehalt der Granulosezellen dieser Follikel wurde mittels FISH-Analyse bestimmt.

Die Fixierung von transplantiertem Gewebe der Eierstockrinde in Bouin-Lösung führte zu verschwommenen und weitgehend verdeckten Fluoreszenzsignalen in Follikelzellen aufgrund einer grünen Trübung. Im Gegensatz dazu lieferte das in Formaldehyd fixierte Gewebe der Eierstockrinde hervorragende Fluoreszenzsignale. Die größte Herausforderung dieses Protokolls liegt in der Isolierung von Eierstockzellen und der enzymatischen Verdauung des Gewebes.

Eine Abweichung von diesem Protokoll kann zu einem erheblichen Verlust von Eierstockzellen während des Prozesses führen, was insbesondere bei Frauen vermieden werden sollte, die bereits über eine geringe Eierstockreserve verfügen. Zusätzliche Genexpressionsprofile könnten hilfreich sein, um mehr über den Einfluss aneuploider Ovarialzellen auf die Follikulogenese und damit über den Prozess der vorzeitigen Ovarialinsuffizienz bei Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erfahren.