Name: Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Lernen Sie eine L-012-basierte Chemilumineszenz-Methode zur Echtzeit-Detektion reaktiver Sauerstoffspezies in Reisgeweben während der Immunantwort. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare ROS-Messungen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Shanghai Natural Science Foundation (Fördernummer: 21ZR1429300/BS1500016), der Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-Programm, Fördernummer: AF1500088/002), des Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Fördernummer: ZXWH2150201/001) an Jiangbo Fan und durch das Medical-Engineering Collaboration Project der Shanghai Jiao Tong University (Fördernummer: 21X010301734) an Can Li unterstützt.

HINWEIS: Das Protokoll gilt für verschiedene Pflanzengewebe. Reisscheide und Blattscheiben wurden in diesem Protokoll für die ROS-Detektion bei PAMP-Erhebung verwendet. Da sich Unterschiede hauptsächlich aus der Probenahmemethode ergeben, werden im Folgenden nur die üblichen Verfahren beschrieben, wobei gegebenenfalls spezifische Schritte erwähnt werden.
1. Pflanzenkultur
<ol><li>Sterilisieren Sie die entspelzten Reissamen mit 70% Ethanol für 1 min, dann mit 40% Natriumhypochlorit (NaClO) für 1 h. Spülen Sie die Samen dann 5x mit sterilem Wasser ab, um restliches Chlor zu entfernen.</li>
	<li>Die Samen werden aseptisch auf 1/2 MS-Medium (2,37 g/L Murashige und Skoog (MS) Medium, 30 g/L Saccharose, 2,1 g/L Phytagel, pH 5,7, autoklaviert) aufgetragen.<ol><li>Bei der Reisscheidenmethode werden die Samen im sterilen Glasgefäß direkt mit MS-Medium beschichtet.</li>
		<li>Bei der Blattscheibenmethode werden die Samen 5-7 Tage lang auf MS-Platten gelegt und in die Wachstumsmatrix oder den Boden umgepflanzt (Abbildung 1A).</li>
	</ol></li>
	<li>Züchten Sie die Sämlinge in einem Wachstumsraum mit einer 12 h hellen/12 h dunklen Photoperiode.</li>
</ol>2. Gewebevorbereitung und Vorbehandlung
<ol><li>Reisscheide<ol><li>Schneiden Sie die Hülle von 10 Tage alten Reissämlingen 1 Tag vor dem ROS-Test mit einer scharfen Rasierklinge oder einer chirurgischen Klinge zur Vorbehandlung in 3-mm-Segmente (Abbildung 1B).</li>
		<li>Platzieren Sie fünf Mantelsegmente in einer einzelnen Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 100 μl ddH2 O für 10-12 h im Dunkeln bei 25 °C, wodurch wundverletzungsbedingte Ionenleckagen und Abwehrreaktionen nachlassen können (Abbildung 2). HINWEIS: Es ist ein wichtiger Schritt, darauf zu achten, dass die Schnitte vertikal gehalten werden, um eine gleichmäßige Schnittfläche zu gewährleisten, die der Erhebungslösung ausgesetzt ist, um hochreproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Bewegen Sie die Segmente vorsichtig. Machen Sie keine zusätzlichen Schnitte oder Wunden an den Segmenten, die eine Quelle für Datenvariationen sein könnten. Grundsätzlich muss jeder Test mindestens fünf Replikate enthalten, da die Variation des ROS-Wertes groß ist. Je mehr Replikate gesetzt werden, desto zuverlässiger sind die Daten.</li>
	</ol></li>
	<li>Blattscheibe<ol><li>Schneiden Sie die Blattscheiben (4 mm Durchmesser) von 4-6 Wochen alten Reispflanzen mit einem Biopsienstanz mit einem Kolben ab. Schneiden Sie die Blattscheiben immer aus dem mittleren Drittel des zweiten Blattes (von oben nummeriert) der Hauptdeichsel ab, um die Datenvariation zu verringern (Abbildung 1C).</li>
		<li>Legen Sie eine Blattscheibe für 10-12 h zur Vorbehandlung in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, die 100 μl ddH 2 O enthält, wodurch die wundungsbedingten Reaktionen nachlassen können, da diese die Induktion von ROS durch PAMPs beeinträchtigen könnten (Abbildung 2). HINWEIS: Bedienen Sie die Blattscheiben vorsichtig. Machen Sie im Experiment keine zusätzlichen Schnitte oder Wunden an den Bandscheiben, die zu Datenabweichungen führen könnten. Die Induktion von ROS erfolgt meist aus den Zellen der Schnittkante, da die Oberflächen von Reisgewebe (Blätter oder Scheiden) mit hydrophoben Schichten bedeckt sind. Nur die Zellen der Schnittkanten kommen mit der Erhebungslösung in Kontakt (siehe Abschnitt Diskussion).</li>
		<li>Lassen Sie alle Blattscheiben mit der abaxialen Oberfläche nach oben in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Wasservorbehandlung schwimmen, um blattseitige Variationen zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Wachstumsbedingungen und Stadien der Reissämlinge für die Scheidenprobenahme und Teile der Reisscheide und der Reisblätter, die im Assay verwendet wurden. (A) Reissämlinge, die 10 Tage lang unter sterilen Bedingungen auf 1/2 MS-Medium gezüchtet wurden, können für den ROS-Test entnommen werden. Sterilisierte Reissamen wurden auf 1/2 MS-Medium kultiviert und in einer 12 h hellen/12 h dunklen Photoperiode in einem Klarglasfläschchen mit einem Durchmesser von 8,5 cm und einer Höhe von 15 cm gezüchtet. (B) Schematische Darstellung der Probenahmeteile der Blattscheiden. Blattscheiden wurden von 10 Tage alten Reissämlingen geschnitten. Die Positionen der Blattscheiden befanden sich über den Wurzeln und unter dem ersten Blatt. (C) Schematische Darstellung der Probenahmeposition der Blattscheiben. Die Blattscheiben können in jedem Wachstumsstadium aus dem mittleren Drittel des zweiten Blattes (Zählung von oben) der Hauptfräse gesunder Reispflanzen geschnitten werden. Abkürzungen: ROS = reaktive Sauerstoffspezies; MS = Murashige und Skoog. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64776/64776fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung des Plattenaufbaus zur Messung der ROS-Produktion mit verschiedenen Linien von Oryza sativa. Vorbehandlung und Test von Reisgewebe mit einer 96-Well-Platte. Linie 1, Linie 2 und Linie 3 (bis zu acht Linien auf einer Platte) können beliebiges Material von Interesse, verschiedene Sorten, Mutanten oder transgene Linien sein. Die Gewebe wurden mit Eilitierlösungen mit PAMP (PAMP, weiß) oder ohne PAMP (ddH2O, grau) stimuliert, um die ROS-Reaktion zu messen. Es ist zu beachten, dass das Zeitintervall zwischen den Messwerten umso länger ist, je mehr Proben getestet werden sollen. Abkürzungen: ROS = reaktive Sauerstoffspezies; PAMP = Pathogen-assoziiertes molekulares Muster; ddH2O = doppelt destilliertes Wasser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64776/64776fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
3. Vorbereiten der Erhebungslösung
<ol><li>L-012-Pulver wird in 20 mM (6,23 mg/ml) wässriger Lösung mitddH2Ogelöst, um die Stammlösung herzustellen. Anschließend wird die Stammlösung mit 50 mM Tris HCl-Puffer (pH 7,5) verdünnt, um die Arbeitslösung in der Endkonzentration von 500 μM L-012 herzustellen. Halten Sie die Stammlösung gefroren und verdünnen Sie sie vor Gebrauch auf die Arbeitslösung.</li>
	<li>Bereiten Sie die Auslöselösung vor, die PAMP, L-012 und Meerrettichperoxidase (HRP; 10 mg/ml in ddH2O) enthält. Für eine 10-ml-Auslöserlösung mischen Sie 9,4 ml 50 mM Tris HCl-Lösung (pH 7,5), 400 μl der L-012-Lösung, 100 μl HRP und 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Für die Negativkontrolle werden anstelle von PAMP 100 μl ddH2O zugegeben. HINWEIS: Bewahren Sie die vorbereiteten Auslöserlösungen bei Raumtemperatur auf, um Kältestress für Reisgewebe zu vermeiden. Bei Bedarf können auch andere PAMPs zur Behandlung verwendet werden, wie z. B. Chitin (20 ng/ml in der Endkonzentration). Da L-012 lichtempfindlich ist, decken Sie alle Röhrchen mit L-012-Lösung mit Aluminiumfolie ab.</li>
</ol>4. Starten der Software und Einrichten des Protokolls mit dem referenzierten Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle)
HINWEIS: Es dauert einige Zeit, die Parameter der Mikroplatten-Reader-Software einzurichten. Es wird empfohlen, die Maschine und das Protokoll vorzubereiten (ein Klick, um fortzufahren), bevor Sie die Erhebungslösung hinzufügen.
<ol><li>Starten Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experimente , um ein neues Protokoll zu erstellen oder ein vorhandenes Protokoll zu verwenden.</li>
	<li>Klicken Sie im Popup-Fenster auf Prozedur , um die Platte einzurichten. Wählen Sie die zu überwachenden Vertiefungen aus der Platte aus.</li>
	<li>Klicken Sie auf Kinetic starten , um die Gesamtlaufzeit und das Leseintervall festzulegen. Stellen Sie die Laufzeit auf 35 Minuten oder länger ein, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Um die Messwerte so oft wie möglich zu erhalten, wählen Sie Minimales Intervall aus. Wählen Sie für die Integrationszeit je nach Signalintensität 1 s oder länger. HINWEIS: Das Leseintervall hängt von der Anzahl der Abtastungen und der Dauer der Signalintegration ab.</li>
	<li>Klicken Sie auf Validieren | OK , um die Einstellungen zu bestätigen.</li>
	<li>Klicken Sie im Popup-Fenster auf Neue Platte erkennen und warten Sie, bis die Software das Dialogfeld mit der Ladeplatte auffordert. Legen Sie die zu prüfende Platte auf den Träger.</li>
	<li>Halten Sie hier an, um zu warten, bis das Erhebungssystem eingerichtet wurde (im nächsten Abschnitt). Sobald das Erhebungssystem bereit ist, klicken Sie auf Ausführen , um den Messwert zu starten.</li>
</ol>5. Etablierung des Erhebungssystems und Messung der ROS-Produktion in Echtzeit
<ol><li>Entfernen Sie das ddH2O vorsichtig aus den Vertiefungen, die das vorbehandelte Gewebe enthalten, und vermeiden Sie Gewebeschäden oder Austrocknung.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μl der Auslöselösung in die Vertiefungen mit den Geweben zu geben.</li>
	<li>Zum Mischen vorsichtig schütteln. Klicken Sie auf Ausführen , um mit der Erkennung zu beginnen. HINWEIS: Bei der PAMP-Behandlung reagiert das Pflanzengewebe sehr schnell und produziert ROS. Daher wird empfohlen, zuerst die Negativkontrolle ohne PAMP zu behandeln, um die Operationszeit zu verkürzen, wenn mehrere Behandlungen durchgeführt werden. Arbeiten Sie so schnell wie möglich, um die Verzögerung zwischen den Behandlungen zu reduzieren. Je kürzer die Zeit zwischen der Zugabe der Erhebungslösung und dem Beginn der Detektion ist, desto besser ist die Erfassung wichtiger experimenteller Daten.</li>
</ol>

<ol><li>Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+as+signals+that+modulate+plant+stress+responses+and+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death.</a> Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).</li>
<li>Mittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+are+good%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS are good.</a> Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).</li>
<li>Gilroy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS%2C+calcium%2C+and+electric+signals%3A+key+mediators+of+rapid+systemic+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants.</a> Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).</li>
<li>Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+gene+network+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen gene network of plants.</a> Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).</li>
<li>Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+burst+of+plant+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A burst of plant NADPH oxidases.</a> Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).</li>
<li>Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+signalling+in+plant+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species signalling in plant stress responses.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).</li>
<li>Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+and+redox+signalling+in+the+response+of+plants+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress.</a> Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Suzuki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+oxidases%3A+the+engines+of+ROS+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).</li>
<li>Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NADPH+oxidase+RBOHD+during+plant+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity.</a> Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).</li>
<li>Segonzac, C., Zipfel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+plant+pattern-recognition+receptors+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria.</a> Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).</li>
<li>Roda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+chemical+luminescence-based+biosensors%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review.</a> Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).</li>
<li>Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attomolar+detection+of+cytokines+using+a+chemiluminescence+immunoassay+based+on+an+antibody-arrayed+CMOS+image+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).</li>
<li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+regulation+of+abiotic+stress+tolerance+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Ziel dieser Studie war es, eine hocheffiziente Methode zur Quantifizierung der frühen ROS-Produktion als Reaktion auf PAMP in Reisgeweben zu etablieren. Diese Methode bietet ein standardisiertes Verfahren zur Echtzeitbestimmung von Apoplasten-ROS, die aus behandeltem Reisgewebe hergestellt werden. Diese Methode ist einfach in der Bedienung, kostengünstig, klar in der Zusammensetzung und unabhängig von kommerziellen Kits. Mit dieser Methode können Forscher die Echtzeitproduktion von Apoplast-ROS untersuchen, wenn Pflanzen...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von chemisch aktiven Sauerstoffderivaten, einschließlich Superoxidanionenradikalen (O2-) und ihren Derivaten, Hydroxylradikalen (OH-), Wasserstoffperoxid und Produkten von Singulettsauerstoff oder Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die ständig in Plastiden und Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxisomen und anderen subzellulären Stellen produziert werden1 . ROS spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen und sind für alle Pflanzen essentiell 2,3,4. Das breite Spektrum der ROS-Funktionen reicht von der Regulation von Wachstum und Entwicklung bis hin zur Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen 5,6,7,8.
Im pflanzlichen Immunsystem nehmen die Plasmamembran-lokalisierten Rezeptoren der Pflanzenzellen – sogenannte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) – von Krankheitserregern abgeleitete Chemikalien-Erreger-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) wahr. Diese Erkennung löst eine Reihe schneller Immunreaktionen aus, darunter Kalziumeinstrom, ROS-Burst und MAPK-Kaskade; Daher wird diese Immunitätsschicht als PAMP-getriggerte Immunität (PTI) bezeichnet. ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, deren Bestimmung in PTI-bezogenen Studien weit verbreitet ist 9,10. Die durch PAMPs ausgelöste ROS-Produktion wird auf Plasmamembran-residente NADPH-Oxidase oder Proteine der Respiratory Burst Oxidase Homolog (RBOH)-Familie zurückgeführt, die Elektronen von zytosolischem NADPH oder NADH auf extrazellulären Sauerstoff übertragen, um Superoxid (O 2-) zu produzieren, das durch Superoxiddismutasespontan in Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) umgewandelt wird 8 . Der PAMP-getriggerte ROS-Burst ist ziemlich schnell, tritt nur wenige Minuten nach der PAMP-Behandlung auf und erreicht seinen Höhepunkt bei ~10-12 min. Die überwiegende Mehrheit der ROS-Moleküle besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das mit einem Chemilumineszenz-Assay leicht und stabil nachgewiesen werden kann.
Bei der Chemilumineszenz reagiert das Chemilumineszenz-Reagenz unter Einwirkung eines Katalysators mit aktivem Sauerstoff, um die Zwischenprodukte im angeregten Zustand zu erzeugen. Dann kehren die Elektronen im Produkt durch einen strahlungsfreien Übergang in den Grundzustand zurück und emittieren Photonen. Übliche Chemilumineszenz-Reagenzien umfassen Luminol und L-012, wobei Luminol die Anwendung dominiert11,12,13. Immer mehr Forscher entscheiden sich jedoch für L-012, um die ROS-Produktion nachzuweisen, da L-012 im Vergleich zu Luminol eine viel höhere Lichtemissionseffizienz unter neutralen oder nahezu neutralen pH-Bedingungen aufweist.
Diese Arbeit beschreibt eine optimierte Chemilumineszenzmethode, basierend auf L-012, für die Echtzeit-Detektion der ROS-Produktion nach der Induktion von PAMPs in Reisgewebe (Oryza sativa), Blattscheiben und Scheiden. Die hier bereitgestellte Methode ist einfach, stabil und standardisiert und kann in hohem Maße an unterschiedliche experimentelle Anforderungen angepasst werden. Die mit dieser Methode gewonnenen Daten sind unter fest kontrollierten Bedingungen sehr gut reproduzierbar.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte</td><td></td><td>WHB WHB-96-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Innochem</td><td>A43543</td><td></td></tr><tr><td>flg22</td><td>Sangon Biotech</td><td>p20973</td><td>PAMP</td></tr><tr><td>Gen5</td><td>BioTek</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>L-012</td><td>FUJIFILM</td><td>120-04891</td><td>8-Amino-5-chlor-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazin-1,4-dion, CAS #:143556-24-5</td></tr><tr><td>Mikroplatten-Reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>MS Medium</td><td>Solarbio</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCLO</td><td>Aladdin</td><td>S101636</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase aus Meerrettich (HRP)</td><td>Sigma</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Sampler</td><td>Miltex</td><td>15110-40</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610195</td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-detektion der produktion reaktiver sauerstoffspezies bei der immunantwort in reis mit einem chemilumineszenz-assay

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen. Bei einer Infektion mit Krankheitserregern oder einer Herausforderung mit pathogen-assoziierten Chemikalien (Pathogen-assoziierte molekulare Muster [PAMPs]) wird in Pflanzen schnell eine Reihe von Immunantworten, einschließlich eines ROS-Bursts, induziert, was als PAMP-ausgelöste Immunität (PTI) bezeichnet wird. Ein ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, die durch eine Gruppe von Plasmamembran-lokalisierten NADPH-Oxidasen - den Proteinen der RBOH-Familie - katalysiert wird. Die überwiegende Mehrheit der ROS besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das durch eine Luminol-basierte Chemilumineszenzmethode leicht und stetig nachgewiesen werden kann. Chemilumineszenz ist eine photonenproduzierende Reaktion, bei der Luminol oder sein Derivat (wie L-012) unter Einwirkung eines Katalysators eine Redoxreaktion mit ROS durchläuft. In diesem Artikel wird eine optimierte L-012-basierte Chemilumineszenzmethode beschrieben, um die Produktion von Apoplast-ROS in Echtzeit bei PAMP-Auslösung in Reisgeweben zu erkennen. Die Methode ist einfach, stabil, standardisiert und unter fest kontrollierten Bedingungen hochgradig reproduzierbar.

Hier nehmen wir Reismaterial als Beispiel, um die ROS zu bestimmen, die mit der flg22-Behandlung produziert werden. Die Erzeugung von ROS nach der Erhebung ist vorübergehend. Bei Reis wurde der Anstieg der ROS-Produktion erstmals in 1-2 Minuten festgestellt, erreichte seinen Höhepunkt bei 10-12 Minuten und kehrte in ~30-35 Minuten zum Ausgangswert zurück (Abbildung 3). Im Vergleich zum Kontrolltest, bei dem PAMP in der Auslöselösung fehlte, was zu keiner offensichtlichen ROS-Induktion führte...

Hier beschreiben wir eine Methode zur Echtzeit-Detektion der Produktion von apoplastischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Reisgeweben in einer pathogen-assoziierten molekularmuster-ausgelösten Immunantwort. Diese Methode ist einfach, standardisiert und erzeugt unter kontrollierten Bedingungen hochreproduzierbare Ergebnisse.

Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte L-012-basierte Chemilumineszenzmethode zum Nachweis der ROS-Produktion in Echtzeit bei PAMP-Auslösung in Reisgeweben. Diese Methode ist einfach, standardisiert und unter fest kontrollierten Bedingungen hochgradig reproduzierbar. Dieses Verfahren wird von On Ying, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert.Sterilisieren Sie zunächst die entspelzten Reissamen eine Minute lang mit 70% Ethanol und dann eine Stunde lang mit 40% Natriumhypochlorit. Spülen Sie die Samen fünfmal mit sterilem Wasser ab, um das restliche Chlor zu entfernen. Bei der Reisscheidenmethode werden die Samen direkt in das sterile Glasgefäß mit Murashige und Skoog oder MS-Medium gefüllt.Um die Samen in der Blattscheibenmethode zu plattieren, plattieren Sie sie fünf bis sieben Tage lang auf MS-Platten und verpflanzen Sie sie dann in die Wachstumsmatrix oder den Boden. Züchten Sie die Sämlinge in einem Wachstumsraum mit einer Fotoperiode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit. Schneiden Sie die Hülle von 10 Tage alten Reissämlingen einen Tag vor dem ROS-Test mit einer scharfen Rasierklinge oder einer chirurgischen Klinge zur Vorbehandlung in drei Millimeter große Segmente.Legen Sie fünf Mantelsegmente für 10 bis 12 Stunden in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, die 100 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser enthält. Schneiden Sie die Blattscheiben von vier bis sechs Wochen alten Reispflanzen mit einem Biopsiestempel mit einem Kolben ab. Schneiden Sie die Blattscheiben immer aus dem mittleren Drittel des zweiten Flügels der Hauptdeichsel ab, um die Datenvariation zu reduzieren.Als nächstes legen Sie eine Blattscheibe für 10 bis 12 Stunden zur Vorbehandlung in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, die 100 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser enthält. Halten Sie alle Blattscheiben schwimmend und nach oben gerichtet in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Wasservorbehandlung, um blattseitige Variationen zu vermeiden. Bereiten Sie die Auslöselösung vor, indem Sie 9,4 Milliliter 50 mikromolare Tris Hcl, 400 Mikroliter L012-Lösung, 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase und 100 Mikroliter Flg22 kombinieren.Geben Sie 200 Mikroliter Auslöselösung in die Vertiefungen. Starten Sie die Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Experimente, um ein neues Protokoll zu erstellen oder ein vorhandenes Protokoll zu verwenden. Klicken Sie im Popup-Fenster auf Prozedur, um die Platte einzurichten, und wählen Sie die zu überwachenden Vertiefungen aus der Platte aus.Klicken Sie auf Start kinetic und stellen Sie die Laufzeit auf 30 Minuten oder länger ein, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Wählen Sie das minimale Intervall, um die Messwerte so oft wie möglich zu erhalten. Wählen Sie für die Integrationszeit je nach Signalintensität eine Sekunde oder länger.Klicken Sie auf Validieren, gefolgt von Okay, um die Einstellungen zu bestätigen, klicken Sie dann im Popup auf Neue Platte erkennen und warten Sie, bis die Software das Dialogfeld für die Ladeplatte auffordert. Entfernen Sie vorsichtig das doppelt destillierte Wasser aus den Vertiefungen, die das vorbehandelte Gewebe enthalten, und vermeiden Sie Gewebeschäden oder Austrocknung. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 Mikroliter der Auslöselösung in die Vertiefungen zu geben, die das Gewebe enthalten.Legen Sie die zu testende Platte auf den Träger und beginnen Sie mit der Erkennung. Um ROS durch Flg22 zu induzieren, wurden Blattscheiben und drei Millimeter lange Hüllen verwendet. Die ROS-Erzeugung wird 35 Minuten lang überwacht.Die Balken zeigen die Mittelwerte der Standardabweichungen an, die aus fünf technischen Wiederholungen berechnet werden. Bei Reis wurde der Anstieg der ROS-Produktion erstmals in ein bis zwei Minuten festgestellt, erreichte seinen Höhepunkt nach 10 bis 12 Minuten und kehrte in etwa 30 bis 35 Minuten zum Ausgangswert zurück. Die Gesamtmenge der ROS wurde aus der Kurve berechnet.Um die Gesamtmenge der ROS-Werte zu erhalten, wenden Sie die Formel auf die entsprechenden Datensätze an, um den ROS zu berechnen, der in jedem Zeitintervall generiert wird, der kombiniert werden kann, indem die Formelsumme angewendet wird, um den generierten Gesamtbetrag zu berechnen. Ein einzelnes Loch oder zwei Hälften einer Blattscheibe wurden in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben, die 10 bis 12 Stunden lang mit 100 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser vorbehandelt und dann mit Flg22 für die ROS-Induktion behandelt wurde. Die Messwerte der beiden Halbscheibenproben sind viel höher als die der gesamten Blattscheibe.Im Durchschnitt sind die Gesamtwerte der beiden Halbscheibenproben fast 1,6-mal so hoch wie die der gesamten Blattscheibe, was proportional zur Kantenlänge und nicht zur Fläche der Proben ist. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass ROS hauptsächlich in Zellen an der Wundstelle erzeugt werden. Wenn Sie mit diesem Verfahren versuchen, arbeiten Sie vorsichtig mit Geweben und machen Sie keine zusätzlichen Ausschnitte, die eine Quelle für eine Datenvariation sein könnten.Diese Methode kann auf alle anderen ROS-produzierenden physiologischen Prozesse in Pflanzengeweben angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier schlagen wir einfache Methoden zu testen und auszuwerten Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen.

Produktion und Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Cancers

Eine effiziente Methode, um Einblicke in die Visualisierung der parakrine-derived ROS-Induktion von endothelialen Ca2 + Signal-Verstärkung wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Messung parakrine abgeleitete ROS ausgelöst Ca2 +-Mobilisierung in vaskulären Endothelzellen in einer Co-Kultur-Modell.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung des oxidativen Ausbruchs in Arabidopsis-Blättern nach Immunauslösung. Blattscheiben, die aus Pflanzenblättern geschnitten werden, werden mit bakteriellen Peptiden inkubiert, die als mikrobenassoziierte molekulare Muster oder MAMPs fungieren. Nach dem Nachweis der MAMPs induzieren Pflanzenzellen die Produktion von extrazellulärem ROS, das mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Assays nachgewiesen wird.

Ein Assay zum Nachweis von oxidativen Bursts in Arabidopsis-Blattscheiben nach Immunauslösung

Dieses Video zeigt einen Assay für den Echtzeit-Nachweis der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Reisgeweben nach der Erhebung von Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMP). Geschnittene Scheidensegmente und Blattscheiben werden einem von bakteriellen Flagellen abgeleiteten Peptid ausgesetzt, das als PAMP fungiert. Bei der Erkennung des Peptids über Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) auf Pflanzenzellen kommt es zu einer schnellen und transienten Produktion von ROS, die...

Ein Assay zum Nachweis der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in Reisgeweben nach Immunauslösung

Wir geeignet einen Satz von Protokollen für die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in verschiedenen Amöben und Säugerzellmodellen für die qualitative und quantitative Untersuchungen angewendet werden können.

Erfassen, Visualisieren und Quantifizierung der Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies in einem Modellsystem Amoeba

Dieses Papier beschreibt zwei Methoden zur Quantifizierung von Abwehrreaktionen in Arabidopsis thaliana nach der Exposition gegenüber Immunentfernern: der vorübergehende oxidative Ausbruch und die Hemmung des Sämlingwachstums.

Muster-Triggered Oxidative Burst und Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis der gesamten ulzellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) mit 2',7'--Dichlordihydrofluorescein-Diaacetat (DCFH-DA) vor. Diese Methode kann die zelluläre ROS-Lokalisierung in anhaftenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop visualisieren und die ROS-Intensität mit einem Fluoreszenzplattenleser quantifizieren. Dieses Protokoll ist einfach, effizient und kostengünstig.

Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies insgesamt in anhaftenden Zellen durch 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat-Färbung

Detaillierte Anweisungen werden bereitgestellt, um ein modulares Open-Source-Fluorimeter zu bauen, das mit vielen kostengünstigen Heizgeräten kompatibel ist, um eine quantitative isotherme Nukleinsäureamplifikation in Echtzeit durchzuführen.

Open-Source-Miniaturfluorimeter zur Überwachung isothermer Nukleinsäureverstärkungsreaktionen in Echtzeit in ressourcenbegrenten Umgebungen

Escherichia coli ist die Hauptursache für neonatale Gram-negative bakterielle Meningitis. Während der bakteriellen Infektion spielen reaktive Sauerstoffspezies, die von Neutrophilen produziert werden, eine wichtige bakterizide Rolle. Hier führen wir eine Methode zum Nachweis der reaktiven Sauerstoffspezies in Neutrophilen als Reaktion auf Meningitis E. coliein.

Echtzeit-Quantifizierung von reaktiven Sauerstoffspezies bei Neutrophilen, die mit Meningitic Escherichia Coli infiziert sind

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Quantifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung von Dihydroethidium (DHE) als Fluoreszenzfarbstoffsonde unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Screening-Ansatzes. Das Protokoll beschreibt die Methoden zur quantitativen Beurteilung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den drei verschiedenen hepatozellulären Karzinomzelllinien.

Hochdurchsatz-Screening-Bewertung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) mit Dihydroethidium (DHE)-Fluoreszenzfarbstoff

Lernen Sie eine L-012-basierte Chemilumineszenz-Methode zur Echtzeit-Detektion reaktiver Sauerstoffspezies in Reisgeweben während der Immunantwort. Dieses standardisierte Protokoll ermöglicht reproduzierbare ROS-Messungen.

Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay

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