Name: Herstellung eines modifizierten autologen konditionierten Serums und ex vivo Beurteilung des Heilungspotentials im murinen Hornhautepithel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von modifiziertem autologem konditioniertem Serum (mACS) zur Förderung der Wundheilung im murinen Hornhautepithel. Diese kostengünstige Methode verbessert die Patientenzugänglichkeit erheblich.

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Die Autoren bedanken sich bei Ya-Lan Chien und Chia-Ying Lee für die hervorragende technische Unterstützung und bei der Firma OnLine English für die sprachliche Ausgabe. Diese Studie wurde zum Teil durch das Chang Gung Medical Research Project finanziert (Grant No. CMRPG3L1491).

Die Recherche wurde in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien zu Beginn des Protokollabschnitts durchgeführt. Alle Protokolle und Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board der Chang Gung Medical Foundation geprüft und genehmigt. Alle Probanden wurden über die Art dieser Studie informiert und unterschrieben vor der Aufnahme eine Einverständniserklärung. Die für den gesamten Versuchsablauf benötigten Verbrauchsmaterialien sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 sowie in der Materialtabelle dargestellt.
1. Vorbereitung der Materialien, die für die Herstellung von mACS-Augentropfen benötigt werden
<ol><li>Bereiten Sie 250 ml 10%ige Glycerinlösung vor und halten Sie ein 21-g-Infusionsset mit Schmetterlingsflügeln, eine 3-ml-Spritze ohne Nadel und sechs 10-ml-Vacutainer-Röhrchen mit Heparin 158 USP-Einheiten bereit (Abbildung 1).</li>
	<li>Verbinden Sie die 21 g Blutentnahmenadel mit der 3-ml-Spritze und entnehmen Sie 3 ml 10%ige Glycerinlösung in die vorbereitete Spritze. Anmerkungen: Alle Materialien müssen sterilisiert werden, bevor die Nadel eingeführt wird.</li>
	<li>Verteilen Sie die 10%ige Glycerinlösung nacheinander in den Vacutainer-Röhrchen, wobei jeweils ca. 0,5 ml 10%ige Glycerinlösung enthalten sind (Abbildung 3A). Anmerkungen: Aufgrund des Unterdrucks im Reagenzglas muss die Nadel sofort nach dem Einstecken herauskommen, um 3 ml Glycerinlösung gleichmäßig auf die sechs Reagenzgläser zu verteilen.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Haut des Patienten mit sterilen Wattestäbchen mit 75% Alkohol. Punktieren Sie die oberflächliche Vene der oberen Gliedmaßen des Patienten mit der 18-G-Blutentnahmenadel. Entnahme von insgesamt 60-70 ml venösem Blut aus der oberflächlichen Vene.</li>
</ol>2. Vorbereitung für mACS Augentropfen
<ol><li>Injizieren Sie nacheinander 10 ml des entnommenen venösen Blutes in jedes der sechs Vacutainer-Röhrchen (Abbildung 3B). Anmerkungen: Dieser Schritt beruht auf dem Unterdruck des Vakuums, um die Röhrchen zu füllen. Um eine Zerstörung der Blutzellen und eine Hämolyse zu vermeiden, üben Sie keinen Überdruck aus.</li>
	<li>Legen Sie die sechs Vacutainer-Röhrchen mit einer konstanten Temperatur von 37 °C für 4 h in den Inkubator (Abbildung 3C). Anmerkungen: Der hypoxische Status wird durch den verbleibenden Unterdruck in einem verschlossenen Röhrchen, das Glycerin aufgenommen hat, aufrechterhalten und stabilisiert.</li>
	<li>Nehmen Sie die Röhrchen nach 4 h aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie sie bei 3.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt die Materialien für die mACS-Extraktion vor, einschließlich der sterilisierten Augentropfenflaschen, einer 3-ml-Spritze mit der Nadel, eines 0,22-μm-Filters, einer 18-g-Nadel und eines Paares steriler Handschuhe (Abbildung 2). Anmerkungen: Der Operationstisch sollte mit 75%igem Alkohol abgewischt werden, um eine aseptische Umgebung zu gewährleisten. Der Überstand ist nach der Zentrifugation bereits ein Halbzeug von mACS.</li>
	<li>Legen Sie die sechs Röhrchen auf das Röhrchengestell und öffnen Sie die Kappen nach vollständiger Zentrifugation (Abbildung 3D). Anmerkungen: Sterilität ist in diesem Schritt nicht erforderlich.</li>
	<li>Ziehen Sie sterile Handschuhe an und ziehen Sie das mACS nacheinander mit einer 3-ml-Spritze und einer 18-G-Nadel heraus. Anmerkungen: Achten Sie darauf, während dieses Schritts nicht die untere Blutkörperchenschicht zu zeichnen (Abbildung 3E).</li>
	<li>Ziehen Sie die Nadel heraus, schließen Sie sie an den 0,22-μm-Filter an und verbinden Sie die 23-G-, 1,5-Zoll-Blutentnahmenadel mit der ursprünglichen 3-ml-Spritze mit dem Auslass unten (Abbildung 3F).</li>
	<li>Schieben Sie die Nadel vorsichtig durch den 0,22 μm Filter in die vorbereiteten sterilen Augentropfenflaschen (Abbildung 3G).</li>
	<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte, bis alle mACS gefiltert und in Augentropfenflaschen aufbewahrt wurden (Abbildung 3H).</li>
	<li>Lagern Sie die mACS-Augentropfen bei 4 °C zur sofortigen Anwendung. Zur Langzeitkonservierung bei -20 °C lagern. HINWEIS: Nicht länger als 2 Wochen bei 4 °C oder länger als 3 Monate bei -20 °Caufbewahren 9,19.</li>
</ol>3. Ex vivo Wundheilungsmodell des murinen Hornhautepithels
HINWEIS: Das folgende ex vivo Tiermodell basiert auf früheren Erfahrungen von Hung et al. zu mechanischen Verletzungen des Hornhautepithels20. Die folgenden Schritte sollten unter dem Mikroskop durchgeführt werden, um eine gut umschriebene und konsistente Hornhautepithelwunde zu erzeugen.
<ol><li>Betäuben Sie die C57BL/6-Mäuse mit 3%-4% Isofluran. Drücke die Hautbiopsie-Stanze über die zentrale Hornhaut der Maus und lasse einen flachen Kreis auf dem Epithel als gleichmäßigen Wundrand zurück. Anmerkungen: Seien Sie vorsichtig, um einen Riss des Augapfels zu vermeiden.</li>
	<li>Debride des Hornhautepithels innerhalb des bestätigten Bereichs bis zur Bowman-Schicht mit einem Hornhautrostentferner, der mit einem 0,5-mm-Grat ausgestattet ist.</li>
	<li>Um das ex vivo Tiermodell der mechanischen Hornhautwunde zu erstellen, entnehmen Sie den Augapfel und bereiten Sie die Kultur gut vor.<ol><li>Schläfern Sie die Mäuse zuerst ein; Drücken Sie dann sanft auf die oberen und unteren Augenhöhlenränder der Mäuse, führen Sie die Spitze der Pinzette über den retrobulbären Raum und den Augapfel heraus und halten Sie ihn an der Pinzette fest.</li>
		<li>Schneiden Sie den Sehnerv und das periorbitale Weichgewebe mit einer Hornhautschere durch, um den Augapfel perfekt zu isolieren.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit geschmolzenem Wachs vor. Erzeugen Sie schnell ein rundes Loch mit den Spitzen der Pinzette und warten Sie dann, bis es erstarrt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die zu testenden Medien vor: 0,5 % mACS, 0,5 % AS zum Vergleich, normale Kochsalzlösung als Negativkontrolle und modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco. HINWEIS: mACS wird mit dem oben genannten Protokoll erhalten.</li>
	<li>Für die Ex-vivo-Kultur legen Sie den geernteten Augapfel auf die vorbereitete 96-Well-Platte. Geben Sie 200 μl jedes Mediums in die 96-Well-Platte.</li>
	<li>Legen Sie die 96-Well-Kulturplatte bei 37 °C mit 5 % CO2 in den Inkubator. Stellen Sie sicher, dass das Nährmedium alle 24 Stunden gewechselt wird.</li>
	<li>Um den sequentiellen Wundheilungseffekt zu bestätigen, wird der epitheliale Wundbereich alle 8 h durch Fluoresceinfärbung unter dem Mikroskop überwacht.<ol><li>Lösen Sie das Fluorescein auf dem Fluoresceinpapier mit normaler Kochsalzlösung auf.</li>
		<li>Lassen Sie den Fluoresceinfarbstoff auf die zentrale Hornhaut der Maus tropfen und beobachten und dokumentieren Sie ihn unter dem Mikroskop. Ein typisches Ergebnis ist in Abbildung 4 dargestellt. HINWEIS: Ein Tropfen (ca. 0,05 ml) Fluoresceinfarbstoff reicht für die Beobachtung aus.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Herstellung von mACS beschrieben und der Nutzen von mACS-Augentropfen bei der Wundheilung von Tiermodellen weiter aufgezeigt. Die entscheidende Modifikation dieses mACS-Protokolls ist die Zugabe von ca. 0,5 ml 10%iger Glycerinlösung in jedes Reagenzglas, wodurch während der 4-stündigen Inkubation bei 37 °C geeignete hypoxische Bedingungen geschaffen werden. Diese Einstellung versorgt den AS mit angemessenem Stress und veranlasst die Zellen, die notwendigen Wachstumsfaktoren abzuso...

Die therapeutische Wirkung von autologem Serum (AS) bei Erkrankungen des trockenen Auges wurde erstmals in den 1980er Jahren von Fox et al.1 beschrieben. Es wird angenommen, dass sowohl die schmierende Eigenschaft als auch die essentiellen epitheliotropen biochemischen Komponenten in AS, die natürliche Tränen nachahmen, die Proliferation von Hornhautepithelzellen begünstigen. Auf dieser Grundlage wurden in den letzten Jahrzehnten mehrere Studien durchgeführt. Zu den trophischen Komponenten gehören der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), Vitamin A, der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β) und andere Zytokine. Interessanterweise ist das Serum reich an TGF-β und Vitamin A, von denen angenommen wird, dass sie eine zentrale Rolle bei der epidermalen Proliferation spielen 2,3,4,5. Darüber hinaus haben mehrere Studien bei der Behandlung von Patienten mit Erkrankungen der Augenoberfläche einige Vorteile von AS-Augentropfen in Bezug auf die von den Patienten berichteten Ergebnisse, andere objektive Parameter des trockenen Auges 6,7 und mikroskopische Befunde wie die Zelldichte8 gezeigt. Metaanalysestudien zeigten, dass es einige Vorteile bei der Verbesserung der Patientensyndrome durch die Behandlung mit AS-Augentropfen geben könnte, aber es fehlen noch Langzeitergebnisse und Beobachtungen 9,10.
Im Gegensatz zu AS wird plättchenreiches Plasma (PRP) durch Zugabe eines Antikoagulans während der Präparation mit weiterer differentieller Zentrifugation und chemischer Aktivierung der Blutplättchen gewonnen. Im Vergleich zu AS sind in PRP zahlreiche Chemikalien und Wachstumsfaktoren wie TGF-β, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) und EGF enthalten. Es wurde auch bei Erkrankungen der Augenoberfläche mit klinischem Nutzen bei der Linderung von Symptomen angewendet11.
Die Querverknüpfung zwischen Epitheldefekten und Entzündungen ist komplex. Insbesondere die Immunpathophysiologie ist ein weiteres wichtiges Thema bei Erkrankungen der Augenoberfläche. Es wird angenommen, dass proinflammatorische Zytokine wie IL-1β und IFN-γ zentrale Mediatoren in Entzündungskaskaden sind12. Auf diese Weise eröffnen sich neue Behandlungswege, die auf dem Verständnis des Immunmechanismus basieren. Strategien zur Stoppung dieses Entzündungsprozesses, einschließlich der Produktion von Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1Ra) und anderen entzündungshemmenden Zytokinen, könnten auch bei Erkrankungen der Augenoberfläche eine wichtige Rolle spielen13,14,15.
Seit 1998 wird Orthokin, ein kommerzialisiertes autologes konditioniertes Serum (ACS), klinisch bei orthopädischen Patienten eingesetzt, die an Arthrose (OA), rheumatoider Arthritis (RA) und Wirbelsäulenerkrankungen leiden13. Im Vergleich zu AS und PRP sind die Behandlung mit chemisch beschichteten Glasperlen und die hypoxische Inkubation zur Aktivierung von Monozyten die Besonderheiten von ACS16. Theoretisch können mehr entzündungshemmende Faktoren ausgeschüttet werden, indem den Zellen Überlebensstress hinzugefügt wird, was zu einer höheren Konzentration essentieller immunmodulierender Komponenten, einschließlich IL-1Ra, führt. Der verbesserte therapeutische Nutzen von ACS bei Arthrose im Vergleich zu AS wurde ebenfalls berichtet17. Erkrankungen der Augenoberfläche haben in mancher Hinsicht einen ähnlichen Immunhintergrund wie orthopädische Entzündungserkrankungen. Aufgrund der erfolgreichen Ergebnisse der Therapie mit menschlichem Blut im orthopädischen Bereich könnte ACS daher Vorteile gegenüber konventionellen Behandlungen in der klinischen Praxis durch epitheliotrope und immunmodulierende Eigenschaften haben. Obwohl ACS bei orthopädisch-entzündlichen Erkrankungen weit verbreitet ist, müssen seine klinischen Anwendungen in der Augenheilkunde noch erforscht werden, was durch die hohen Kosten, die mangelnde Literaturunterstützung und die mangelnde Standardisierung des Präparationsprozesses behindert werden kann, was zu unterschiedlichen Leistungen führt.
In diesem Videoartikel wurde eine neuartige, kostengünstige und bequeme Methode zur Erzeugung des modifizierten ACS (mACS) oder wachstumsfaktorreichen Plasmas (PRGF) demonstriert, wodurch eine Augentropfenlösung mit einem vergleichbaren praktischen Wert wie kommerzialisierte ACS hergestellt wird. Die Schlüsselideen, Antikoagulanzien hinzuzufügen und die Blutzellen durch Stressinkubation zur Sekretion von entzündungshemmenden Zytokinen anzuregen, wurden beibehalten, aber im Gegensatz zu den chemisch induzierten Methoden, wie z. B. solchen, die auf CrSO 4-beschichteten Glasperlen und kommerziellen Kits basieren, wird der kritische Stressstatus bei dieser Methode physikalisch durch hypoxische Inkubation induziert. Darüber hinaus wurde Glycerin hinzugefügt, um zusätzliche Vorteile zu bieten, darunter eine Erhöhung der Stabilität der Membran der Blutzellen, die Aufrechterhaltung eines angemessenen osmotischen extrazellulären Flüssigkeitsdrucks18 und eine geeignete Nährstoffquelle unter hypoxischen Bedingungen, die eine Überlastung der Zellen vermeiden.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 96-Well-Kulturplatte</td><td>Merck KGaA, Deutschland</td><td>CLS3997</td><td></td></tr><tr><td>Barraquer Deckel Spekulum</td><td>Katena</td><td>K1-5355</td><td>15 mm</td></tr><tr><td>Barraquer Nadelhalter</td><td>Katena</td><td>K6-3310</td><td>ohne Lock&nbsp;</td></tr><tr><td>Barron Vacuum Punch 8,0 mm</td><td>Katena</td><td>K20-2108</td><td>zum Schneiden von Filterpapier</td></tr><tr><td>BD 10,0 mL Vacutainer-Röhrchen mit Heparin 158 USP Einheiten</td><td>Becton,Dickinson and Company, US</td><td>367880</td><td>Mindestens 6 Röhrchen, notwendig zur Blutentnahme für nachfolgende Experimente und zur Vermeidung von Blutverklebung</td></tr><tr><td>BD 21 G Schmetterlingsflügel-Infusionsset</td><td>Becton,Dickinson and Company, US</td><td>367281</td><td>Für eine gleichmäßige Verteilung der Glycerinlösung</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäuse&nbsp;</td><td>National Laboratory Animal Center</td><td>RMRC11005</td><td>für Mausmodell</td></tr><tr><td>Castroviejo Pinzette 0,12 mm</td><td>Katena&nbsp;</td><td>K5-2500</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf, Deutschland</td><td>5811000428</td><td>3.500 x g für 10 min</td></tr><tr><td>Cheng Yi 10,0 mL sterilisierte Tropfflasche</td><td>Cheng Yi Chemical,</td><td>Taiwan CP405141</td><td>Muss steril sein und als Aufbewahrungsbehälter für das Endprodukt</td></tr><tr><td>Hornhautrost-Ring-Entferner mit 0,5 mm Grat</td><td>Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td><td>CHI-675</td><td>für das Debridement des Hornhautepithels</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes minimales essentielles Medium</td><td>Merck KGaA, Deutschland</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Toyo Roshi Kaisha, Ltd.</td><td>1.11</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-Natrium-Ophthalmikstreifen U.S.P</td><td>OPTITECH OPTFL100</td><td></td><td>Färbung bei Hornhautepitheldefekten&nbsp;</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Firstek, Taiwan</td><td>S300S</td><td>37 &deg; C für 4 h</td></tr><tr><td>Kanam sterile Handschuhe</td><td>Kanam Latex Industries, Indien</td><td>EN455</td><td>Für den aseptischen Betrieb</td></tr><tr><td>Merck 0,22 &micro; m Filter</td><td>Merck KGaA, Deutschland</td><td>PR05359</td><td>Mindestens 2 Filter für die mACS-Filtration</td></tr><tr><td>Nang Kuang 250 mL 10% Glycerinlösung</td><td>Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan</td><td>19496</td><td>Um einen geeigneten Membranstabilisierungseffekt und extrazellulären osmotischen Druck für Blutzellen anzubieten</td></tr><tr><td>Normale Kochsalzlösung</td><td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td><td>100-120-1101</td><td></td></tr><tr><td>Hautbiopsie-Stanze 2mm</td><td>STIEFEL</td><td>22650</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td><td>SV11</td><td>Mikroskop für die Chirurgie</td></tr><tr><td>Terumo 18 G Nadel</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>SMACF0120-18BX</td><td>3,0 mL Spritze mit 18 G Nadel zur Extraktion des Überstands nach der Zentrifugation</td></tr><tr><td>Terumo 20,0 mL Spritze</td><td>Terumo,</td><td>Taiwan MDSS20ES</td><td>Kann verwendet werden, um Serum nach der ersten Zentrifugation zu sammeln und für die Sekundärzentrifugation zu verwenden.</td></tr><tr><td>Terumo 3,0 mL Spritze mit der 23 G Nadel</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>MDSS03S2325</td><td>3,0 mL Spritze wird verwendet, um den Überstand nach der Zentrifugation zu extrahieren. Verbinden Sie dann den Filter und die 23 G Nadel zur Injektion in die Augentropfenflaschen.</td></tr><tr><td>Westcott Tenotomieschere Medium</td><td>katena</td><td>K4-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung eines modifizierten autologen konditionierten serums und ex vivo beurteilung des heilungspotentials im murinen hornhautepithel

Production of Modified Autologous Conditioned Serum and Ex Vivo Assessment of Its Healing Potential in Murine Corneal Epithelium

Topische Therapien aus menschlichem Blut waren in den letzten Jahrzehnten ein Segen für Kliniker. Autologes Serum (AS) und plättchenreiches Plasma (PRP) sind mit epitheliotropen Wachstumsfaktoren angereichert, die für die Wundheilung der Hornhaut unerlässlich sind. Im Gegensatz zu AS basiert PRP auf einem differentiellen Zentrifugationssystem, das mehr Wachstumsfaktoren aus Thrombozyten liefert. Autologes konditioniertes Serum (ACS) konserviert nicht nur die Herstellung von AS und PRP, sondern konzentriert sich auch auf immunmodulierende Eigenschaften, die bei entzündlichen Erkrankungen wichtig sind.
Das Fehlen standardisierter Protokolle und hohe Präparationskosten sind Einschränkungen für die klinische Anwendung von ACS. Dieses Videoexperiment demonstriert ein Standardverfahren zur Herstellung von modifizierten autologen konditionierten Serums (mACS) Augentropfen. Zunächst wurde Glycerin als Stabilisator der Blutzellen während der hypoxischen Inkubation in Heparinspritzen gegeben. Um die Blutzellen zu aktivieren, wurde eine 4-stündige Inkubation bei 37 °C eingeleitet. Anschließend wurden die Blutproben bei 3.500 × g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Filtration des Überstandes durch einen 0,22 μm Filter waren die mACS-Augentropfen vollständig aufbereitet.
Eine vorläufige Erprobung der therapeutischen Wirkung von mACS zeigte, dass es bei der Wundheilung der Hornhaut in ex vivo Mäuseaugen Wettbewerbsvorteile gegenüber konventionellem AS haben könnte. Das in dieser Studie verwendete AS wurde nach veröffentlichten Studien und der klinischen Praxis in unserem Krankenhaus erstellt. Daher könnte die Wirksamkeit von mACS bei Erkrankungen der Augenoberfläche in zukünftigen Forschungen durch in vivo Tierstudien und klinische Studien evaluiert werden.

Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen die für das Experiment benötigten Materialien, und Abbildung 3 zeigt die aufeinanderfolgenden Schritte und die erfolgreichen Zwischenprodukte während der Herstellung von mACS. Zunächst wurden 0,5 ml 10%ige Glycerinlösung in jedes sterile 10-ml-Reagenzglas gegeben (Abbildung 3A). Dann wurden dem Patienten 60-70 ml venöses Blut entnommen und 10 ml Blut in jedes Röhrchen ...

In diesem Artikel wird ein Protokoll beschrieben, um den Prozess zu vereinfachen und die Herstellung von autologem konditioniertem Serum (ACS) kostengünstiger zu machen. Es werden keine speziellen Spritzen oder oberflächenbeschichteten Glasperlen benötigt. Darüber hinaus hat das modifizierte ACS (mACS) bei der Hornhautwundheilung von murinen Augen ex vivo Wettbewerbsvorteile gegenüber herkömmlichem autologem Serum.

Herstellung eines modifizierten autologen konditionierten Serums und ex vivo Beurteilung des Heilungspotentials im murinen Hornhautepithel

Human blood-derived topical therapies have been a boon to clinicians in recent decades. Autologous serum (AS) and platelet-rich plasma (PRP) are enriched ...

Bei diesem Verfahren handelt es sich um ein innovatives Produkt aus Blut namens mACS, das keine komplexe technische Verarbeitung erfordert. Außerdem beschleunigt es die Wundheilung stärker als herkömmliches Eigenserum. Diese Technik bietet nicht nur einen standardisierten Zubereitungsprozess, sondern kann auch die Kosten für Serumaugentropfen senken und den Zugang der Patienten zu einer kostengünstigeren Behandlungsoption verbessern.Diese Technik kann in Bereichen angewendet werden, in denen die Regeneration, Reparatur und Entzündungshemmung von Wunden oder Gewebe gefördert werden muss. Diese Technik ist ein großer Vorteil bei schwer heilenden Wunden und chronisch entzündlichen Erkrankungen wie schweren Erkrankungen der Augenoberfläche. Injizieren Sie zunächst 10 Milliliter des zuvor entnommenen menschlichen Venenblutes in jedes der sechs Vacutainer-Röhrchen.Legen Sie die Röhrchen für vier Stunden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und zentrifugieren Sie die Röhrchen dann bei 3.500 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entkappen Sie die Röhrchen, nachdem Sie sie auf das Gestell gelegt haben. Verwenden Sie nach dem Anziehen steriler Handschuhe eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 18-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um das mACS aus jedem Röhrchen herauszuziehen.Ziehen Sie die Nadel heraus und bringen Sie einen 0,22-Mikrometer-Filter an. Verbinden Sie die 23-Gauge-1,5-Zoll-Blutentnahmenadel mit der Original-Drei-Milliliter-Spritze mit dem Auslass des Filters. Schieben Sie die Nadel vorsichtig durch den Filter in die vorbereiteten sterilen Augentropfenflaschen zur sofortigen Anwendung, lagern Sie die Augentropfen bei vier Grad Celsius.Im Ex-vivo-Oberflächenheilungsmodell zeigten Probanden, die mit den mACS-Augentropfen behandelt wurden, eine bessere Hornhautheilung im Vergleich zu denen, die mit den autologen Serumtropfen behandelt wurden. Nach 16 Stunden heilten die Hornhautwunden aller Gruppen langsamer als die mit 0,5 % mACS behandelte. Die murine Hornhaut der DMEM-Gruppen und das autologe Serum nach 24 Stunden zeigten eine vergleichbare Heilung mit mACSS nach 32 Stunden, mit Ausnahme der normalen Kochsalzlösungsgruppe.Alle anderen Gruppen zeigten eine nahezu vollständige Genesung. Der wichtigste Schritt besteht darin, während des Prozesses aseptische Verfahren zu befolgen. Serumprodukte sind reich an Nährstoffen, so dass die Verwendung von kontaminierten Produkten auf der Hornhaut schwere Hornhautgeschwüre verursachen kann.Dieses Produkt kann verwendet werden, um die Wundheilung und die Verbesserung der Symptome von Augenoberflächenerkrankungen zu beurteilen. Die Analyse der Zytokinkomponente und die Durchführung größerer randomisierter kontrollierter Studien zu mACS sind für die weitere Forschung unerlässlich.

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Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet.

Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

Ein Beispiel für eine adenovirale Gentherapie bei menschlichen diabetischen Organkulturen wird vorgestellt, um die verzögerte Wundheilung und die deutlich reduzierte Expression von epithelialen Stammzellmarkern in diesen Hornhäuten zu normalisieren. Es wird auch die Optimierung dieses Prozesses in stammzellangereicherten limbalen Epithelkulturen beschrieben.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

Eine Primärkultur von Rinder Endothelzellen wurde verwendet, um den Mechanismus der Cornea-Endothelzellen-mesenchymale Transition zu untersuchen. Weiterhin wurde eine Ratte Hornhautendothel cryoinjury Modell kornealen Endothel-mesenchymale Transition in vivo zu demonstrieren.

In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.

Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes

Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte, die erforderlich sind, um hornhaut-Endothelzellkulturen aus Expflanzen von menschlichem oder Schafgewebe zu etablieren und zu züchten. Ein Verfahren zur Subkulierung von kornealen Endothelzellen auf membranösen Biomaterialien wird ebenfalls vorgestellt.

Wachstum von Human- und Schafhornhaut-Endothelzellschichten auf Biomaterialmembranen

Hier werden Tiermodelle auf der Basis von Maus und Kaninchen für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels entwickelt, um neue Therapeutika und den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen.

Ex vivo und in vivo Tiermodelle für mechanische und chemische Verletzungen des Hornhautepithels

Descemet's Stripping Only ist ein experimentelles Verfahren, bei dem Patienten mit zentralen Hornhautguttae, die aus Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy resultieren, Descemets Membran für periphere Zellen abgestreift haben, um die Endothelschicht zu regenerieren. Wir stellen eine neuartige Methodik vor, die DSO in dystrophischen menschlichen Hornhäuten ex vivo mit beschleunigter Heilung simuliert, die durch eFGF1 (NM141) stimuliert wird.

Ein menschliches Hornhautorgan-Kulturmodell des Descemet-Strippings nur mit beschleunigter Heilung, stimuliert durch den künstlichen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1

Wir haben ein Rattenmodell für schwere Hornhautentzündungen durch Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten entwickelt. Die Studie untersuchte Entzündungsmuster der Hornhaut, die epitheliale Proliferation und Veränderungen der limbalen Stammzellen unter entzündlichen Bedingungen.

Etablierung eines Modells für schwere Hornhautentzündungen bei Ratten auf der Grundlage einer Hornhautepithelkürettage in Kombination mit Hornhautnähten

Die ex vivo-Organkultur der Schweinehornhaut und die epitheliale Wundheilung bieten ein wirtschaftliches, ethisches, reproduzierbares und quantitatives Mittel zur Prüfung der Augentoxizität von Chemikalien. Sie helfen auch bei der Aufklärung von Mechanismen, die der Regulation der Epithelisierung und Gewebereparatur zugrunde liegen, sowie bei der Bewertung von Therapeutika zur Behandlung von diabetischer Keratopathie und verzögerter Wundheilung.

Bewertung der therapeutischen und chemischen Toxizität anhand von organgezüchteten Schweinehornhäuten und der Heilung von Epithelwunden

Ein reproduzierbares Protokoll wird für die Herstellung, Anreicherung und Anwendung eines in situ blaulicht-kreuzvernetzbaren Gelatine-Ribollavin-Hydrogels zur Reparatur von hornhautstromaler Wunden bei Kaninchen vorgestellt, einschließlich prozeduraler Schritte für chirurgische Handhaben, partielle Tarsorrhaphie und postoperative Betreuung.

Herstellung und chirurgische Anwendung von angereicherten, fotovernetzten Gelatine-Riboflavin-Hydrogelen zur Reparatur von Hornhautwunden bei Kaninchen

Erfahren Sie die Herstellung von modifiziertem autologem konditioniertem Serum (mACS) zur Förderung der Wundheilung im murinen Hornhautepithel. Diese kostengünstige Methode verbessert die Patientenzugänglichkeit erheblich.

Herstellung eines modifizierten autologen konditionierten Serums und ex vivo Beurteilung des Heilungspotentials im murinen Hornhautepithel (Video) | JoVE Journal

Herstellung eines modifizierten autologen konditionierten Serums und ex vivo Beurteilung des Heilungspotentials im murinen Hornhautepithel

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