Name: Optimierung der Tubulinausbeute aus Schweinehirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Lernen Sie die hochertragreiche Isolierung von Tubulin aus Schweinehirngewebe für Neurobiologie und Zellbiologie. Diese Methode liefert über 99% reines Tubulin und unterstützt die Arzneimittelforschung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente Tubulin-Isolierung aus neuronalem Gewebe

<ol><li>Verhey, K. J., Gaertig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tubulin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The tubulin code.</a> Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Röhrchen</td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsames Material</td></tr><tr><td>10 mL Röhrchen</td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsames Material</td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsames Material</td></tr><tr><td>ATP</td><td>ROTH</td><td>HN35.2</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ROTH</td><td>A994.2</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Dounce Glashomogenisator</td><td>P-LAB</td><td>H244043</td><td>Homogenisator</td></tr><tr><td>DTT</td><td>ROTH</td><td>6908.1</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>PENTA</td><td>70390-11001</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>ROTH</td><td>6967.2</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Messbecher---</td><td></td><td>---Gemeinsame</td> <td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Messzilinder</td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsame Ausrüstung</td></tr><tr><td>GTP</td><td>MERCK</td><td>36051-31-7</td><td>Sehr hochwertige</td></tr><tr><td>HCl</td><td>PENTA</td><td>19360-11000</td><td>Analytische</td></tr><tr><td>Qualität Izolierte Box für den Gewebetransport</td><td>------</td><td></td><td>Gemeinsame Ausrüstung</td></tr><tr><td>Küchenmixer</td><td>Waring</td><td>7011HB</td><td>Glas- oder Kunststoffgefäß</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsames Material</td></tr><tr><td>MES&nbsp;</td><td>ROTH</td><td>6066.4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERCK</td><td>814733&nbsp;</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PENTA</td><td>43180-31000</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>PENTA</td><td>15650-11000</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Optima XPN100</td><td>Beckman Schar &</td><td>A94469</td><td>Ultrazentrifuge</td></tr><tr><td>Phosphozellulosesäule</td><td>VWR</td><td>GENO786-1291</td><td>Leere Säule</td></tr><tr><td>Phosphozelluloseharz</td><td>Creative - Biomart, inc</td><td>Phosphat-001C</td><td>Ionenaustauscherharz</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>ROTH</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td> in analytischer Qualität <td>PENTA</td><td>24970-31000</td> Waage in <td>analytischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>---</td><td>--- </td><td>Gemeinsame Ausrüstung</td></tr><tr><td>Schere</td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsame Ausrüstung</td></tr><tr><td>Löffel&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>Kunststoff oder Glas</td></tr><tr><td>Ti45 Rotor</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>339160</td><td>Rotor für Ultrazentrifugenpinzette</td></tr><tr><td></td><td>---</td><td>---</td><td>Gemeinsame Ausrüstung</td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 basic</td><td>IKA</td><td>356 1000</td><td>Laborspender</td></tr><tr><td>Wasserbad 37 > C</td><td>---</td><td>---</td><td>Gerührt</td></tr></tbody></table>

optimierung der tubulinausbeute aus schweinehirngewebe

Optimizing Tubulin Yield from Porcine Brain Tissue

Während der Trenn- und Reinigungsschritte wurden Proben für die SDS-PAGE-Elektrophorese entnommen und anschließend mit Coomassie-Blau-Färbung analysiert (Abbildung 2). 20 μl jeder Probe wurden mit 10 μl Laemmli Probenpuffer (188 mM Tris-HCl pH 6,8, 3 % SDS (w/w), 30 % Glycerin (v/v), 0,01 Bromphenolblau (w/w), 15 % β-Mercaptoethanol) gemischt und 15 min lang bei 95 °C inkubiert. 4 μl jeder Probe wurden auf 12,5 % Acrylamid SDS-Gel geladen und unter einem konstanten Strom von 30 mA pro Gel unter reduzierenden und denaturierenden Bedingungen getrennt.
Die Ergebnisse bestätigten einen inkrementellen Anstieg der relativen Tubulinkonzentration, begleitet von einer Verringerung der kontaminierenden Proteine. Darüber hinaus gab es bei der ersten Zentrifugation (Schritt 3.2.7) keinen signifikanten Verlust von Tubulin im geklärten Lysat im Vergleich zum Weglassen dieses Schritts (Abbildung 2A,B).
Die Proteinkonzentration wurde mit drei unabhängigen Methoden bestimmt: BCA-Assay, Bradford-Protein-Assay und SDS-PAGE-Gel-Densitometrie-Analyse19 (Abbildung 3). Die Gesamtausbeute an Tubulin unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens betrug 123 mg gereinigtes Tubulin aus 250 g Nervengewebe. Bei den Messungen ist zu berücksichtigen, dass die hohe DTT-Konzentration im Lagerpuffer einen signifikanten Einfluss auf den BCA-Assay hat. Sowohl der PEM-Puffer als auch der PBS-Puffer erhöhen mit der Zugabe von DTT die Hintergrundabsorption um etwa 0,900 A595, was die Kapazität des BCA-Assays erheblich reduziert (Abbildung 3A). Die negative Wirkung von DTT ist auch nach zehnfacher Verdünnung mit reinem Wasser nachweisbar (Daten nicht gezeigt). Der Bradford-Assay schien durch den Speicherpuffer nicht beeinflusst zu werden (Abbildung 3B), was durch die Densitometrie-Analyse bestätigt wurde.
Die Reinheit des Tubulinpräparats wurde durch massenspektrometrische Analysen an zwei unabhängigen Einrichtungen (VRI Brno, Tschechische Republik; CEITEC MU Brno, Tschechische Republik) mit Elektrospray-Ionisation und MALDI-TOF. Beide Analysen bestätigten das Vorhandensein von Schweinetubulinen alpha und beta in mehreren Isoformen. Die Gesamtreinheit betrug mehr als 97,07 % (PSMs 1065), wobei die häufigsten Verunreinigungen von Homo sapiens Keratin Typ II (PSMs 246, 2,24 % der Verunreinigungen) stammten, die höchstwahrscheinlich während der Tubulinisolierung und Probenvorbereitung für die MS/MS-Analyse eingebracht wurden. Andere Verunreinigungen, die aus 322 PSMs und nur Serumalbumin, Aktin-gamma und Trypsinogen aus Sus scrofa bestehen, wurden mit einer Peptidauflösung (0,0069%) identifiziert.
In nachfolgenden Experimenten wurde der Erhalt der Polymerisationskapazität nach dem Schockfrosten und der Lagerung in flüssigem Stickstoff nachgewiesen. Das 10 mg/ml-Aliquot wurde aus flüssigem Stickstoff entfernt und langsam auf Eis aufgetaut. Proben unterschiedlicher Konzentrationen (10 mg/ml, 8 mg/ml, 6 mg/ml, 4 mg/mL und 2 mg/mL) wurden durch Verdünnen der Aliquote in PEM-Puffer, der DTT, ATP und GTP enthält, für das Selbstorganisationsexperiment hergestellt. Eine Verdünnungsreihe wurde 60 min lang bei 37 °C inkubiert, die zweite wurde 60 min lang auf Eis inkubiert. Beide Serien wurden für 60 min bei 21.000 x g und der entsprechenden Temperatur (4 °C bzw. 37 °C) zentrifugiert. 30 μl Überstand wurden entfernt und für SDS-PAGE verwendet. Der verbleibende Überstand wurde vorsichtig mit einer Pipette entfernt und verworfen. Die Pellets wurden kurz durch Zugabe von 100 μM PEM-Puffer gewaschen und anschließend sofort mit einer Pipette entfernt. Anschließend wurden die Pellets in 50 μL 1x konzentriertem SDS-Ladepuffer resuspendiert, so dass die relative Konzentration von Pellet und Überstand erhalten bleibt. Jedem Überstand wurden 10 μl SDS-geladener Puffer zugesetzt. Alle Proben wurden mittels SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert (Abbildung 4). Das Volumen jeder Probe, die auf SDS-PAGE geladen wurde, wurde entsprechend der Ausgangskonzentration angepasst, so dass der Unterschied in der Ausfällung aufgrund der Konzentration deutlicher ist. Der Selbstorganisationstest von Tubulin in PEM-Puffer bestätigte die Fähigkeit, Tubulinfasern temperaturabhängig zu bilden.
Der MAP2c-getriebene Tubulin 20,21-Assemblierungsassay, der die Fähigkeit von Tubulin zur Interaktion mit anderen Proteinen überprüfte, wurde durchgeführt 22. Die seriellen Verdünnungen von MAP2c wurden hergestellt, wobei 100 μl 1 mg/ml Tubulin-Aliquots mit MAP2c bis zu einer Endkonzentration von 0 μM bis 8 μM gemischt wurden. Alle Proben wurden auf Eis durch Verdünnung in frisch aufbereitetem PEM-Puffer mit 1 mM DTT und 1 mM GTP aufbereitet. Das Tubulin wurde 15 min bei 37 °C mit unterschiedlichen Konzentrationen von MAP2c inkubugiert und 60 min bei 21.000 x g und 37 °C zentrifugiert. Die abschließende Wäsche des Pellets wurde zweimal mit 100 μl PEM-Puffer durchgeführt. Das Experiment bestätigte die Fähigkeit des präparierten Tubulins für eine MAP2c-getriebene Polymerisation, da nur die Probe ohne MAP2c kein Pellet bildete (Abbildung 5).
Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde außerdem verwendet, um das Vorhandensein von Tubulinfilamenten aus Copolymerisationsexperimenten zu bestätigen. Suspensionen von gereinigtem Tubulin, die mit MAP2c ausgefällt wurden, wurden für die Transmissionselektronenmikroskopie mittels Negativfärbung hergestellt. Die Proben wurden auf Formvar-beschichteten, kohlenstoffstabilisierten Kupfergittern adsorbiert. Anschließend wurden die Gitter mit 2% NH4MoO 4 negativ gefärbt und unter einem Elektronenmikroskop bei 18.000-facher Vergrößerung und einer Beschleunigungsspannung von 80 kV untersucht. Das Vorhandensein homogener Mikrotubuli mit einer klaren filamentösen Struktur und angemessener Größe zeigte die Fähigkeit, Mikrotubuli in nativer Konformation zu bilden (Abbildung 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig01.jpg"> Abbildung 1: Ein schematisches Diagramm der Tubulintrennung und -reinigung. Die Zahl in Klammern bezieht sich auf den Protokollschritt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig02.jpg"> Abbildung 2: Tubulintrennung und -reinigung. (A) Die SDS-PAGE-Analyse von Proben, die bei der Trennung von Tubulin mittels temperaturgesteuerter Polymerisation (3 μL pro Linie) entnommen wurden. Die Abnahme der Verunreinigungen mit einer stabilen Zunahme der relativen Tubulinhäufigkeit (ca. 50 kDa) ist sichtbar. Die Zahlen über jeder Zeile entsprechen der Schrittnummer im Protokoll. (B) Die SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen, die nach der Proteinchromatographie an Phosphocelluloseharz (4 μl pro Linie) erhalten wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig03.jpg"> Abbildung 3: Proteinkonzentration. Die Verdünnungsreihe von Rinderserumalbumin von bis zu 1 mg/ml in PEM-Puffer oder PBS wurde mit BSA-Verdünnungsreihen verglichen, die 0,1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT einzeln oder in Kombination (0,1 mM ATP, 1 mM GTP und 1 mM DTT) im PEM- oder PBS-Puffer enthielten. (A) Bei der Verwendung des BCA-Assays kam es zu einer signifikanten Verschiebung des Hintergrunds von Proben, die DTT (feste Symbole) enthielten. (B) Dieser Effekt wurde bei der Messung der Konzentrationen im Bradford-Assay nicht festgestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig04.jpg"> Abbildung 4: Tubulin-Selbstassemblierungsassay. Die SDS-PAGE-Analyse des Selbstorganisationsassays bestätigte die Fähigkeit von gelagertem Tubulin, das entweder bei (A) 4 °C oder (B) 37 °C inkubiert wurde, temperaturabhängig in einem breiten Konzentrationsspektrum zu polymerisieren. (P - Pellet, S - Überstand; die jeweilige Tubulinkonzentration ist über jedem Linienpaar angegeben; die Menge jeder geladenen Probe betrug 10 μg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig05.jpg"> Abbildung 5: Tubulin-Co-Sedimentations-Assay. Die SDS-PAGE-Analyse der MAP2c-unterstützten Tubulin-Assemblierung bestätigte die Fähigkeit des gelagerten Tubulins, eine Polymerisation durchzuführen, die durch die Interaktion mit dem Mikrotubuli-assoziierten Protein in einer konzentrationsabhängigen Weise angetrieben wird. Die molare Konzentration von MAP2c ist über jeder Linie angegeben. (P - Pellet, S - Überstand). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64925/64925fig06.jpg"> Abbildung 6: Transmissionselektronenmikroskopie. Die TEM-Mikrofotografien zeigten, dass Tubulin (A) zu Mikrotubuli mit entsprechendem Durchmesser (B) zusammenfügt, die aus homogenen Tubulinfilamenten bestehen, die mit MAP2c-Proteinen dekoriert sind. Der Balken entspricht 1000 nm (A) und 200 nm (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64925/64925fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Optimierung der Tubulinausbeute aus Schweinehirngewebe

Neural tissue from any source is an excellent material for tubulin isolation, as the dendrites and axons of neurons are rich in microtubules. Here, we ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Das Video zeigt die Isolierung von tumorinfiltrierenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus einem Mäusegehirn durch mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung. Daran schließt sich eine Dichtegradientenzentrifugation an, um die Immunzellen für die weitere Analyse zu sammeln.

Isolierung tumorinfiltrierender Immunzellen aus einem Gehirn von Mäusen

Dieses Video zeigt die Isolierung von Kapillaren aus frischen Schweinegehirnen. Der Prozess umfasst die Entfernung der Hirnhäute, die Isolierung der grauen Substanz aus dem Gehirngewebe, die Homogenisierung und Filterung der grauen Substanz, um die Kapillaren zu isolieren, und schließlich die enzymatische Verdauung, um die Kapillaren weiter zu reinigen.

Reinigung der Kapillaren aus dem Schweinegehirn

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Gehirn-Mikrogefäßen von euthanasierten Ratten. Es umfasst die Dissektion des Gehirns, die Reinigung des Gewebes und die mechanische Verdauung, gefolgt von einer wiederholten Zentrifugation, um die reine Fraktion der Mikrogefäße zu isolieren.

Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

Obwohl die Ribosomenstruktur umfassend charakterisiert wurde, ist die Organisation von Polysomen noch wenig untersucht. Um diesen Wissensmangel zu überwinden, stellen wir Ihnen hier ein detailliertes Präparationsprotokoll für die genaue Abbildung von Säugetierpolysomen mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) in Luft und Flüssigkeit vor.

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

Ziel des Protokolls ist eine optimierte Verfahren für die Einrichtung eines in-vitro- Blut - Hirn-Schranke (BBB) Modells basierend auf primäre porcinen Gehirn endothelial Zellen (pBECs) zu präsentieren. Das Modell zeigt hohe Reproduzierbarkeit, hohe Dichtigkeit und eignet sich für Studien der Transport- und intrazellulären Menschenhandel in der Wirkstoffforschung.

Verbesserte Methode für die Einrichtung einer In-vitro- Blut - Hirn-Schranke Modell auf porcinen Endothelzellen Gehirnzellen basiert

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) in verschiedenen zellulären Kompartimenten des Nagetierhirns effizient zu quantifizieren. Anwender sind in der Lage, die USB-Funktion in nuklearen, zytoplasmatischen und synaptischen Fraktionen bei demselben Tier zu untersuchen, wodurch die Zeit und Anzahl der Tiere, die für die Durchführung dieser komplexen Analysen benötigt werden, reduziert wird.

Quantifizierung subzellulärer Ubiquitin-Proteasom-Aktivität im Nagetierhirn

Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Tubulinreinigung aus kleinen/mittleren Quellen wie kultivierten Zellen oder Gehirnen mit einer Maus unter Verwendung von Polymerisations- und Depolymerisationszyklen. Das gereinigte Tubulin ist in bestimmten Isotypen angereichert oder hat spezifische posttranslationale Modifikationen und kann in In-vitro-Rekonstitutions-Assays zur Untersuchung der Mikrotubuli-Dynamik und -Wechselwirkungen verwendet werden.

Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

Wir berichten über einen einfachen, zeiteffizienten und auf Fluoreszenzspektroskopie basierenden Hochdurchsatz-Assay zur Quantifizierung von Aktinfilamenten in ex vivo biologischen Proben aus Hirngeweben von Nagetieren und menschlichen Probanden.

Ein zeiteffizienter Fluoreszenzspektroskopie-basierter Assay zur Bewertung des Actin-Polymerisationsstatus in Nagetier- und menschlichem Hirngewebe

Mikrotubuli, bei denen es sich um Tubulin-Polymere handelt, spielen eine entscheidende Rolle als Bestandteil des Zytoskeletts in eukaryotischen Zellen und sind für ihre dynamische Instabilität bekannt. In dieser Studie wurde eine Methode zur Fraktionierung von Mikrotubuli entwickelt, um sie in stabile Mikrotubuli, labile Mikrotubuli und freies Tubulin zu trennen, um die Stabilität von Mikrotubuli in verschiedenen Mausgeweben zu bewerten.

Quantitative Mikrotubuli-Fraktionierungstechnik zur Trennung von stabilen Mikrotubuli, labilen Mikrotubuli und freiem Tubulin in Mausgewebe

Wir berichten über eine Technik, die eine Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen (GBM) ermöglicht, die in ein Hirngewebe von Wirbeltieren eindringen. Die Kopplung der orthotopischen Injektion von fluoreszenzmarkierten GBM-Zellen in ein transparentes Zebrafischgehirn mit hochauflösender intravitaler Bildgebung ermöglicht die Messung der Dynamik des Zytoskeletts während der in situ Krebsinvasion.

Live-Bildgebung der Mikrotubulidynamik in Glioblastomzellen, die in das Zebrafischgehirn eindringen

Lernen Sie die hochertragreiche Isolierung von Tubulin aus Schweinehirngewebe für Neurobiologie und Zellbiologie. Diese Methode liefert über 99% reines Tubulin und unterstützt die Arzneimittelforschung.

Optimierung der Tubulinausbeute aus Schweinehirngewebe

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