Name: Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 57 s
Description: Lernen Sie eine FeCl3-induzierte arterielle Thrombose-Methode zur 3D-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Studien zur Thrombusarchitektur und zellulären Mechanismen.

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Die Autoren danken den Mitgliedern des Whiteheart Laboratory für die sorgfältige Durchsicht dieses Manuskripts. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH, des NHLBI (HL56652, HL138179 und HL150818) sowie durch einen Verdienstpreis des Department of Veterans Affairs an S.W.W., R01 HL 155519 an BS und einen Zuschuss des NIBIB intramuralen Programms an R.D.L. unterstützt.

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<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Palta, S., Saroa, R., Palta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+coagulation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Overview of the coagulation system.</a> Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).</li>
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<li>Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+action+of+platelets+and+crucial+blood+coagulation+pathways+in+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology-Oncology+and+Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis.</a> International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).</li>
<li>Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+antiplatelet+treatment+in+coronary+artery+disease+patients%3A+A+necessary+evil+or+an+overzealous+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice.</a> Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).</li>
<li>Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+arterial+thrombosis+induced+by+ferric+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride.</a> Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).</li>
<li>Denis, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+standardization+of+in+vivo+thrombosis+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).</li>
<li>Marsh Lyle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thrombin+inhibitor+efficacy+in+a+novel+rabbit+model+of+simultaneous+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis.</a> Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+arterial+thrombosis+by+a+protease-activated+receptor+1+antagonist%2C+FR171113%2C+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig.</a> European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).</li>
<li>Huttinger, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+canine+carotid+artery+thrombosis%3A+a+large+animal+model+of+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury.</a> Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithrombotic+therapy+by+regulating+the+ROS-mediated+thrombosis+microenvironment+and+specific+nonpharmaceutical+thrombolysis+Using+Prussian+blue+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets.</a> Small. 18 (15), 2106252(2022).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+membrane+cloaked+nanotubes+to+accelerate+thrombolysis+by+thrombus+clot-targeting+and+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration.</a> Small. , 2205260(2022).</li>
<li>Refaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+light-responsive+liposomes+for+protein+delivery%3A+Towards+bleeding-free+photothermally-assisted+thrombolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis.</a> Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+nanoplatelets+to+target+delivery+hirudin+for+site-specific+photothermal%2Fphotodynamic+thrombolysis+and+preventing+venous+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation.</a> Small. 18 (51), 2203184(2022).</li>
<li>Subramaniam, S., Kanse, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).</li>
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<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric-estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">Nonparametric-estimation from incomplete observations.</a> Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).</li>
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<li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40L+stabilizes+arterial+thrombi+by+a+beta3+integrin--dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism.</a> Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).</li>
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<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rabbit+model+of+cerebral+microembolic+signals+for+translational+research%3A+preclinical+validation+for+aspirin+and+clopidogrel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).</li>
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<li>Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+murine+thrombosis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced murine thrombosis models.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).</li>
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<li>Bird, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+therapeutic+index+of+marketed+anti-coagulants+and+anti-platelet+agents+by+guinea+pig+models+of+thrombosis+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis.</a> Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.
ORCID-Profile: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Die topische Anwendung von FeCl3 auf das Gefäßsystem zur Induktion von Thrombosen ist eine weit verbreitete Technik und hat maßgeblich dazu beigetragen, Rollen für verschiedene Thrombozytenrezeptoren, Ligandensignalwege und ihre Inhibitorenzu etablieren 20,21,22,23. Der Mechanismus, durch den FeCl3 eine Thrombose verursacht, ist vielfältig; Früher wurde die endotheliale De...

Thrombose ist die Bildung eines Blutgerinnsels, das ein Blutgefäß teilweise oder vollständig blockiert und den natürlichen Blutfluss behindert. Dies führt zu schweren und tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfällen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und verursachen weltweit jeden vierten Todesfall 1,2,3. Obwohl sich eine Thrombose als Fehlfunktion des Gefäßsystems manifestiert, kann sie auf eine zugrunde liegende mikrobielle oder virale Infektion, eine Immunstörung, eine Malignität oder einen Stoffwechselzustand zurückzuführen sein. Der Blutfluss wird durch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen Komponenten des Gefäßsystems aufrechterhalten, einschließlich Endothelzellen, roten/weißen Blutkörperchen, Blutplättchen und Gerinnungsfaktoren4. Bei einer Gefäßverletzung interagieren Blutplättchen mit adhäsiven Proteinen auf der subendothelialen Matrix und setzen ihren körnigen Inhalt frei, der mehr Blutplättchen rekrutiert5. Gleichzeitig wird die Gerinnungskaskade aktiviert, was zur Fibrinbildung und -ablagerung führt. Letztendlich wird ein Gerinnsel gebildet, das Blutplättchen und rote Blutkörperchen enthält, die in einem Fibrinnetzeingeschlossen sind 6. Obwohl Thrombozytenaggregationshemmer und Antikoagulanzien zur Modulation von Thrombosen zur Verfügung stehen, bleiben unechte Blutungen bei diesen Therapien ein großes Problem, das eine Feinabstimmung der Dosierungen und Kombinationen dieser Medikamente erfordert. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf, neue antithrombotische Medikamente zu entdecken7.
Thrombosen werden mit mehreren Methoden untersucht, um Gefäßverletzungen zuzufügen: mechanisch (Gefäßligatur), thermisch (Laserverletzung) und chemisch (FeCl3 / Rose Bengal-Anwendung). Die Art der Thrombose variiert je nach Lokalisation (arteriell vs. venös), Methode oder Ausmaß der Verletzung. Unter all diesen Typen ist die FeCl 3-induzierte Gefäßverletzung die am weitesten verbreitete Methode. Es wurde bei Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Hundeneingesetzt 8,9,10,11,12. Die Methode ist relativ einfach, leicht anzuwenden, und wenn die wichtigsten Parameter standardisiert sind, ist sie in verschiedenen Gefäßsystemen (z. B. Arterien [Halsschlagader und Femur], Venen [Jugular] und Arteriolen [Kremaster und Mesenterium]) empfindlich und reproduzierbar (Ergänzungstabelle 1).
Dieses Modell kann auch verwendet werden, um unser Verständnis der Mechanik und Morphologie der Gerinnselbildung zu erweitern. Diese Technik bietet auf einzigartige Weise den Vorteil, die Thrombose an verschiedenen Flussratenpunkten zu stoppen, um die Zwischenstadien des Prozesses zu untersuchen, bevor er okklusiv wird. Jüngste Fortschritte in der Thromboseforschung haben dieses Modell verwendet, um die Aufmerksamkeit auf nicht-pharmakologische Methoden der Thrombolyse13 oder die nicht-invasive Verabreichung von antithrombotischen und/oder fibrinolytischen Wirkstoffen14,15 zu lenken. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass, wenn Thrombozytenmembranen mit diesen Therapeutika beschichtet sind, die Medikamente bei thermischer Stimulation aktiviert werden können, um auf Gerinnsel16 abzuzielen. Die hier beschriebenen Techniken können für Studien wie die Validierung ihrer Ergebnisse auf der Ebene einzelner Blutplättchen nützlich sein. In diesem Manuskript beschreibt Protokoll 1 das grundlegende FeCl 3-vermittelte Gefäßverletzungsverfahren, während Protokoll 2 die Methode zum Sammeln und Fixieren der Gefäßverletzungsprobe für die weitere Analyse durch Elektronenmikroskopie beschreibt.

<table><tbody><tr><td>0,9% Salzlösung</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td>NaCl zur Herstellung einer Lösung von 0,9 % Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>1 mL Spritze&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson und Co.</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>190 Proof Ethanol&nbsp;</td><td>KOPTEC</td><td>V1101&nbsp;</td><td>Wird verwendet, um eine 70%ige Ethanollösung herzustellen, die zur Vorbereitung der Maus für die Operation verwendet wird&nbsp;</td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48402</td><td></td></tr><tr><td>25 Yard Schwarz Geflochtenes Seidennaht (5-0)</td><td>DEKNATEL</td><td>136082-1204</td><td></td></tr><tr><td>26G x 3/8 Nadel&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson und Co.</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td></td></tr><tr><td>7,5 mL Transferpipette, graduiert auf 3 mL</td><td>Globe Scientific Inc.</td><td>135010</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol-Vorbereitungspads (70% Isopropylalkohol)</td><td>Medline</td><td>MDS090735</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502&nbsp;</td><td>Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale 35 mm x 10 mm</td><td>Corning Incorporated&nbsp;</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Kompakte Waage&nbsp;</td><td>Wards Wissenschaft&nbsp;</td><td>470314-390</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, 12,5 cm lang</td><td>World Precision Instrument</td><td>15922-G</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30 Aktivator&nbsp;</td><td>Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Dodenyl Bernsteinsäureanhydrid / DDSA</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen&nbsp;</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Doggy Poo Bags/Tierkadaver Entsorgungsbeutel</td><td>Crown Products&nbsp;</td><td>PP-RB-200</td><td></td></tr><tr><td>Doppler-Durchflusssonde</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>MA0.5PSB</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 Harz&nbsp;</td><td>Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Ethylalkohol, wasserfrei 200 Proof</td><td>Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Augenzange, 4" voll gebogen, Standard, 0,8 mm breite Spitzen</td><td>Integra Miltex</td><td>18-784</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>VWR</td><td>28310-106</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere - Scharf-stumpfe</td><td>feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fingerschlaufe Ohrlocher&nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>24212-01</td><td></td></tr><tr><td>Mullschwämme 2" x 2" &ndash; 12-lagig</td><td>Dukal Corporation</td><td>2128</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd (10%ige Lösung)</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen&nbsp;</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Integra Miltex Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10</td><td>Integra&reg; Miltex&reg;</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-chlorid&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Messergriff Miltex&reg; Extra feiner Edelstahl Größe 3</td><td>Integra Lifesciences</td><td>157510</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma&nbsp; Fischer</td><td>&nbsp; A93100</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Bleinitrat&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>LEICA S8AP0 Mikroskop</td><td>LEICA</td><td>Nicht mehr</td><td>lieferbar Nicht mehr lieferbar bei der Firma</td></tr><tr><td>LEICA S8AP0 Mikroskop Ständer&nbsp;</td><td>LEICA</td><td>10447255</td><td>bei der Firma</td></tr><tr><td>Light-Duty Tissue-Wischtücher nicht mehr erhältlich&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Präparierzange; 1x2 Zähne, volle Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge</td><td>Roboz Surgical Instrument Company</td><td>RS-5157</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid 4%ige wässrige Lösung&nbsp;</td><td>Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (16%ige Lösung)</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen&nbsp;</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumferricyanid</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Propylenoxid, ACS-Reagenz</td><td>Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie&nbsp;</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic Pipette PR-10</td><td>Rainin</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>Forschung Durchflussmesser&nbsp;</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>T402B01481</td><td>Modell: T402</td></tr><tr><td>Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear</td><td>Scotch&nbsp;</td><td></td><td></td>305289</tr><tr><td>Heizkissen für Kleintiere</td><td>K& H Manufacturing Inc.</td><td>Modell: HM10</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacodylat-Puffer 0,2 m, pH7,4</td><td>Elektronenmikroskopie Dienstleistungen&nbsp;</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Applikatoren mit Baumwollspitze&nbsp;</td><td>Puritanische Medizinprodukte&nbsp;</td><td>25-806 1WC</td><td></td></tr><tr><td>Steromaster Beleuchtung&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>12-562-21</td><td>Nicht mehr lieferbar bei der Firma</td></tr><tr><td>Surgical Dumont #7 Pinzette&nbsp;</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge&nbsp;</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazid (TCH)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Universal-Pipettenspitzen-Nachlader mit geringer Retention (0,1-10 &; Mikro; L)</td><td>VWR</td><td>76323-394</td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat-Elektronenmikroskopie-Dienstleistungen</td><td>&nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Veet Gel Cream Haarentferner</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>3116875</td><td></td></tr><tr><td>Weiß Antistatisch Sechseckige Waage, Mittel, 64 x 15 x 19 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S38975</td><td></td></tr><tr><td>WinDAQ/100 Software für Windows</td><td>DATAQ Instruments, Inc.</td><td>Version 3.38</td><td>Kostenlos zum Download verfügbar. https://www.dataq.com/products/windaq/</td></tr> <tr><td>ZEISS AxioCam Icc 1</td><td>ZEISS</td><td>57615</td><td></td></tr></tbody></table>

eisenchlorid-induzierte arterielle thrombose und probenentnahme für die 3d-elektronenmikroskopie-analyse

Ferric Chloride-Induced Arterial Thrombosis and Sample Collection for 3D Electron Microscopy Analysis

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Aberrante Thrombosen sind ein häufiges Merkmal von systemischen Erkrankungen wie Diabetes und Fettleibigkeit sowie chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Bei einer Gefäßverletzung wirken in der Regel das Gerinnungssystem, die Blutplättchen und das Endothel orchestriert, um Blutungen zu verhindern, indem sie an der Stelle der Verletzung ein Gerinnsel bilden. Anomalien in diesem Prozess führen entweder zu übermäßigen Blutungen oder zu unkontrollierten Thrombosen/unzureichender antithrombotischer Aktivität, was sich in einem Gefäßverschluss und seinen Folgen niederschlägt. Das FeCl 3-induzierte Carotis-Verletzungsmodell ist ein wertvolles Werkzeug, um zu untersuchen, wie eine Thrombose in vivo beginnt und fortschreitet. Dieses Modell beinhaltet eine Endothelschädigung/Denudation und die anschließende Gerinnselbildung an der verletzten Stelle. Es bietet einen hochempfindlichen, quantitativen Assay zur Überwachung von Gefäßschäden und Gerinnselbildung als Reaktion auf unterschiedlich schwere Gefäßschäden. Nach der Optimierung kann diese Standardtechnik verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombose zugrunde liegen, sowie die ultrastrukturellen Veränderungen der Blutplättchen in einem wachsenden Thrombus. Dieser Assay ist auch nützlich, um die Wirksamkeit von Antithrombotika und Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen. In diesem Artikel wird erläutert, wie eine FeCl 3-induzierte arterielle Thrombose initiiert und überwacht wird und wie Proben für die elektronenmikroskopische Analyse entnommen werden.

Die Daten werden im Allgemeinen als Zeit bis zum Verschluss oder als Zeit dargestellt, die benötigt wird, um einen vollständig okklusiven Thrombus zu bilden. Diese Daten können als Kaplan-Meier-Überlebenskurve (Abbildung 4A)19, als Punktdiagramm mit Balken, die den terminalen Blutfluss zum Zeitpunkt der Beendigung des Blutflusses oder der Beendigung eines Experiments (Abbildung 4B) zeigen, oder als Liniendiagramm (Abbildung 4C) dargestell...

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.

Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse

Cardiovascular diseases are a leading cause of mortality and morbidity worldwide. Aberrant thrombosis is a common feature of systemic conditions like ...

Mit dieser Methode kann festgestellt werden, welche Bestandteile der Blutplättchen und des hämostatischen Systems für die Thrombose wichtig sind. Darüber hinaus kann mit dieser Methode bestimmt werden, wie das Wachstum und die Architektur des Thrombus auf zellulärer Ebene beeinflusst werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine reproduzierbare Methode zur Untersuchung vieler Thrombosestadien auf struktureller Ebene ermöglicht.Eine Person, die mit dieser Technik noch nicht vertraut ist, sollte eine übermäßige Handhabung des Gewebes im Operationsbereich vermeiden. Dies kann zu Blutungen führen und die Identifizierung der Halsschlagader übermäßig erschweren. Beginnen Sie mit der Markierung der Verletzungsstelle, nachdem Sie die Halsschlagader freigelegt haben, indem Sie den Bereich zwischen zwei chirurgischen Fäden mit einer Größe von 0,1 Millimetern locker umschließen.Platzieren Sie die Sonde distal vom unteren Gewinde unter die Arterie. Führen Sie das Plastikstück unter die Arterie zwischen den beiden Fäden, um die Stelle für eine Eisenchloridverletzung zu markieren. Führen Sie Durchflussmessungen durch, bevor Sie eine Verletzung durchführen, um den Basalfluss zu notieren.Führen Sie die Verletzung durch, indem Sie drei Minuten lang mit Eisenchlorid getränktes Filterpapier auf die Arterie legen. Entfernen Sie das Filterpapier nach drei Minuten, um das unterschiedliche Ausmaß der Verletzung zu verhindern und die Durchflusszählung durch die Sonde zu erleichtern. Fügen Sie Kochsalzlösung an der Verletzungsstelle hinzu, um überschüssiges restliches Eisenchlorid zu entfernen.Überwachen Sie den Durchflusswert. Wenn der Durchfluss unter 50 % des Ausgangswerts fällt, entfernen Sie die Sonde. Trocknen Sie den Bereich schnell ab und fügen Sie das Fixiermittel hinzu, um den Verletzungsbereich äußerlich zu fixieren.Halten Sie anschließend die Arterie sofort mit einer Pinzette in der Nähe des Verletzungsbereichs fest. Schneiden Sie stromabwärts des Unterfadens und stromaufwärts des Oberfadens. Legen Sie das Gewebe in der gleichen Ausrichtung, in der es gesammelt wurde, auf die Kunststoff-Gewebekulturschale und fügen Sie ein paar Tropfen des Fixiermittels hinzu.Reinigen Sie mit einem Skalpell das zusätzliche Gewebe um die Arterie. Stellen Sie sicher, dass Sie die Ausrichtung des Blutflusses aufzeichnen, indem Sie ein Ende horizontal und das andere Ende verjüngend oder schräg schneiden. Legen Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur in ein Fixiermittel und lagern Sie die Probe dann in 1% Paraformaldehyd bei 4 Grad Celsius, bis sie zur elektronenmikroskopischen Analyse auf nasses Eis geschickt wird.Die Daten wurden als Kaplan-Meier-Überlebenskurve, als Punktdiagramm mit Balken, die den terminalen Blutfluss zum Zeitpunkt der Beendigung des Blutflusses oder der Beendigung eines Experiments zeigen, oder als Liniendiagramm dargestellt. Der Blutfluss stieg in einigen Fällen plötzlich an, nachdem er einige Minuten lang allmählich abgenommen hatte, was auf eine teilweise Ablösung des wachsenden Thrombus hindeutete, und wurde als Embolisationsereignis angesehen. Auch die Morphologie des okklusiven Thrombus wurde mit dieser Methode untersucht.Die zeitnahe Entnahme der Probe während des Thromboseprozesses ist der wichtigste Schritt, da eine Verzögerung dieses Prozesses zu Fehlinterpretationen unserer Strukturanalyse führen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das FeCl3-induzierte Thrombosemodell bei Mäusen wird hierin beschrieben. Es wird eine Methode zur Überwachung des Thrombuswachstums durch intravitalmikroskopische Beobachtung an einem Mesenterialgefäß und durch Blutflussmessung in der Halsschlagader vorgestellt.

Eisenchlorid-induzierte Thrombose Mausmodell für Halsschlagader und Mesentery Vessel

Unser Ziel war es, entwickeln, produzieren und testen ferro Stents für Endothelzellen-Capture. Zehn Stents wurden zur Fraktur getestet und 10 weitere Stents wurden für einbehaltene Magnetismus getestet. Schließlich wurden 10 Stents in vitro getestet und 8 weitere Stents wurden in 4 Schweinen implantiert, um die Zellaufnahme und Retention zu zeigen.

Ferromagnetische Bare Metal Stent für Endothelzellen-Abscheidung und Retention

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Wir berichten über ein raffiniertes Verfahren des Eisenchlorid (FeCl 3) induzierte Thrombose - Modelle auf carotis und A. mesenterica sowie Vene, dadurch effizient Intravitalmikroskopie unter Verwendung von Zeit zu überwachen Thrombenbildung zu okklusiv.

Ferric Chloride-induzierte Murine Thrombosis Models

Hier präsentieren wir Ihnen die Änderungen notwendig, ein gut charakterisierten und häufig verwendete kleine Eisenchlorid-induzierte (FeCl3) Halsschlagader Verletzungen Tiermodell für den Einsatz in einem großen Tier gefäßverletzung Modell. Das resultierende Modell sowohl präklinische Studie Bewertung der prophylaktischen und thrombolytischen pharmakologische und mechanische Eingriffe einsetzbar.

Eisenchlorid-induzierte eckzahn Halsschlagader Thrombosen: Eine große Tiermodell der Gefäßverletzung

Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

Diese Studie beschreibt eine schnelle und effektive Methode zur Zellkomponentenanalyse von zerebralen Blutgerinnseln durch Gerinnselauflösung, Zellfärbung und routinemäßige Blutuntersuchung.

Ein umfassender Ansatz zur Analyse der Zellbestandteile von zerebralen Blutgerinnseln

Hier wird ein Verfahren an einer Punktionswunde zur hämostatischen Thrombusbildung vorgestellt. Die gebildeten Thromben sind groß und haben einen Durchmesser von Hunderten von Mikrometern. Daher sind Volumenbildgebungsansätze geeignet. Wir empfehlen die montierte großflächige Transmissionselektronenmikroskopie als hochauflösenden Ansatz, der vielen zur Verfügung steht, und beschreiben ein präparatives Protokoll.

Blutstillung von Punktionswunden und Vorbereitung von Proben für die Montage der großflächigen elektronenmikroskopischen Analyse

Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Etablierung eines reproduzierbaren, minimalinvasiven Rattenmodells einer durch Eisenchlorid induzierten superioren sagittalen Sinusthrombosen, wobei eine Seidennahtmethode in Kombination mit Laser-Speckle-Kontrastbildgebung und hochauflösendem Ultraschall zur Untersuchung eingesetzt wird.

Entstehung einer modifizierten eisenchloridinduzierten superioren sagittalen Sinusthrombose

Wir beschreiben Verfahren zur Quantifizierung und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen in Mausmodellen durch Präzisionsschnitte der Aortenhöhle und der aufsteigenden Aorta in Kombination mit histochemischer und immunhistochemischer Analyse.

Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus

Lernen Sie eine FeCl3-induzierte arterielle Thrombose-Methode zur 3D-Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Studien zur Thrombusarchitektur und zellulären Mechanismen.

Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse

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