Name: Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Lernen Sie die LC3-Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Autophagie in Pankreaskrebs- und Azinuszellen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen zur Erforschung molekularer Mechanismen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Universität Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), des Nationalen Rates für wissenschaftliche Forschung und Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; und PUE 22920170100033) und der Nationalen Agentur für wissenschaftliche und technologische Förderung (PICT 2019-01664) unterstützt.

1. Zellvorbereitung
<ol><li>Tränken Sie 12 mm runde Deckgläser in absolutem Ethanol und legen Sie sie senkrecht in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Entfernen Sie die Abdeckung und setzen Sie die Multi-Well-Platte 15 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus.</li>
	<li>Positionieren Sie die Deckgläser horizontal und waschen Sie sie mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM).</li>
	<li>Säen Sie eine geringe Anzahl von Pankreaszellen. Die Menge sollte so angepasst werden, dass am Tag der Fixierung eine Konfluenz von 50%-75% erreicht wird16. HINWEIS: Es wird empfohlen, 2,5 × 10 4 PANC-1 oder 4 × 104 AR42J-Zellen pro Vertiefung zu säen, um die Zellen nach 3 Tagen zu fixieren.</li>
	<li>Kultur der Zellen in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem Inkubator bei 37 °C unter befeuchteter Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid (CO2). HINWEIS: Für PANC-1-Zellen wird empfohlen, die Zellen zwischen der Zellaussaat und den folgenden Schritten 2 Tage lang zu inkubieren. Nach dieser Zeit können die Zellen transfiziert, behandelt oder fixiert werden. Dieses Protokoll veranschaulicht beispielhaft die Behandlung mit Gemcitabin in nicht-transfizierten PANC-1-Zellen und die Differenzierung und PP242-Behandlung bei nicht-transfizierten AR42J-Zellen.</li>
</ol>2. Behandlung der Zellen
<ol><li>Gemcitabin-Behandlung für PANC-1-Zellen<ol><li>Bereiten Sie 2 Tage nach der Aussaat eine Lösung von 1 μg/μl Gemcitabin in DMEM vor. Behandeln Sie jede Vertiefung mit 2,6 μl der 1 μg/μl Gemcitabinlösung, um eine endgültige Verdünnung von 20 μM zu erreichen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden im Inkubator.</li>
	</ol></li>
	<li>AR42J-Differenzierung und PP242-Behandlung<ol><li>Bereiten Sie eine Lösung von 4 μg/ml Dexamethason in DMEM vor.</li>
		<li>Behandeln Sie jede Vertiefung mit 4,9 μl 4 μg/ml Dexamethasonlösung, um eine endgültige Verdünnung von 100 nM zu erhalten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für 48 Stunden im Inkubator.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium und behandeln Sie jede Vertiefung mit 0,5 μl 1 mM PP242, um eine endgültige Verdünnung von 1 μM zu erhalten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Zellen für 2 Stunden im Inkubator.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Fixierung und Permeabilisierung der Zellen
<ol><li>Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit kaltem Methanol und eine 6-Well-Platte mit kaltphosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mMKH2PO4) vor. Halte sie auf Eis.</li>
	<li>Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette, waschen Sie es zweimal in PBS und inkubieren Sie es 6 Minuten lang in Methanol.</li>
</ol>4. Blockieren der Zellen
<ol><li>Waschen Sie jedes Deckglas zweimal in PBS und inkubieren Sie es 1 h lang in 10%igem fötalem Kälberserum in PBS (Blockierlösung). HINWEIS: In diesem Schritt kann das Protokoll angehalten werden. Die Deckgläser können über Nacht im Kühlschrank in der Blockierlösung aufbewahrt werden, und das Protokoll kann am nächsten Tag fortgesetzt werden.</li>
</ol>5. Inkubation der Deckgläser mit dem Primärantikörper
<ol><li>Bereiten Sie eine 1:1.000-Lösung von Anti-LC3 in der Blockierlösung vor und halten Sie sie auf Eis.</li>
	<li>Legen Sie ein Stück Laborversiegelungsfolie über den Multiwell-Deckel.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (25 μl) pro Deckglas der Anti-LC3-Lösung auf die Versiegelungsfolie.</li>
	<li>Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette und legen Sie es über den primären Antikörpertropfen, wobei Sie darauf achten sollten, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt.</li>
	<li>Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor, indem Sie ein feuchtes Stück Papier in eine Plastikbox mit flachem Boden legen.</li>
	<li>Legen Sie die Multiwell-Platte in die Feuchtigkeitskammer, decken Sie sie mit Folie ab und inkubieren Sie sie über Nacht im Kühlschrank.</li>
</ol>6. Inkubation der Deckgläser mit dem Sekundärantikörper
<ol><li>Nehmen Sie die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer und legen Sie die Deckgläser wieder in die Multi-Well-Platte.</li>
	<li>Führen Sie drei Wäschen mit PBS durch.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung aus fluoreszenzmarkiertem Anti-Kaninchen mit einer Verdünnung von 1:800 in der Blockierlösung vor und bewahren Sie sie lichtgeschützt auf Eis auf.</li>
	<li>Legen Sie ein Stück Siegelfolie über den Multiwell-Deckel.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (25 μl) pro Deckglas der Anti-Kaninchen-Lösung auf die Versiegelungsfolie.</li>
	<li>Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette und legen Sie es über den primären Antikörpertropfen, wobei Sie darauf achten sollten, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Multiwell-Platte in der Feuchtekammer für 2 h bei Raumtemperatur (RT) lichtgeschützt.</li>
</ol>7. Färbung der Zellen mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)
<ol><li>Nehmen Sie die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer und legen Sie die Deckgläser wieder in die Multi-Well-Platte.</li>
	<li>Führen Sie drei Wäschen mit PBS durch.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 300-nM-DAPI-Lösung in PBS (lichtgeschützt) vor.</li>
	<li>Inkubieren Sie jedes Deckglas 10 Minuten lang mit der DAPI-Lösung.</li>
	<li>Führen Sie drei Wäschen mit PBS durch. Bewahren Sie die Multi-Well-Platte vor Licht geschützt auf.</li>
</ol>8. Montage
<ol><li>Bereiten Sie zwei Becher mit Wasser und einem Blatt Papier vor.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (10 μl) pro Deckglas einer Polyvinylalkohol-Bis(trimethylalumin)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octan-Addukt-Lösung (PVA-DABCO) auf einen Objektträger. HINWEIS: PVA-DABCO wird durch die Kombination von 0,25 M DABCO, 10 % W/V PVA, 20 % Glycerin und 50 % Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) in Reinstwasser hergestellt.</li>
	<li>Nehmen Sie jedes Deckglas mit einer Pinzette, waschen Sie es in jedem Wasserbecher, trocknen Sie es im Papier ab und legen Sie es über den PVA-DABCO-Tropfen (wobei die Zellen mit der Lösung in Kontakt kommen).</li>
	<li>Über Nacht lichtgeschützt trocknen lassen.</li>
</ol>9. Konfokale Mikroskopiebetrachtung und Bildaufnahme
<ol><li>Visualisieren Sie die Deckgläser in einem inversen konfokalen Mikroskop mit einem Objektiv von etwa 63x17.</li>
	<li>Nehmen Sie repräsentative Bilder der markierten Zellen auf.</li>
</ol>10. Quantifizierung der LC3-Punkte
<ol><li>Ziehen Sie jede Bilddatei, die die erfassten Kanäle enthält, z. B. ".czi", per Drag &amp; Drop in den ImageJ (FIJI)-Bildschirm, um sie zu öffnen. Klicken Sie im Dialogfeld auf OK und schließen Sie das Konsolenfenster .</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte " Bild " die Option " Farbe" &gt; "Kanäle teilen" aus.</li>
	<li>Schließen Sie die Bilder, die den anderen Kanälen als dem LC3-Bild entsprechen.</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte Bild die Option &gt; Farbbalance anpassen aus</li>
	<li>Verschieben Sie den Schieberegler "Maximum " nach links, bis das Bild gesättigt ist, um die Zellenkonturen zu visualisieren.</li>
	<li>Zeichnen Sie den Zellenumriss mit dem Freihandauswahl-Werkzeug .</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Zurücksetzen , um die Farbanpassung zurückzusetzen.</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte " Bearbeiten " die Option "Ausschneiden " aus, um das ausgewählte Element auszuschneiden.</li>
	<li>Schließen Sie das Bild, ohne es zu speichern.</li>
	<li>Wählen Sie auf der Registerkarte " Bearbeiten " die Option " Einfügen" aus.</li>
	<li>Wählen Sie im Menü " Analysieren " das Werkzeug " Zähler für 3D-Objekte" aus.</li>
	<li>Legen Sie den Schwellenwert fest. Im Beispiel dieser Studie ist der Schwellenwert auf 2.000 festgelegt.</li>
	<li>Legen Sie den Größenfilter fest. In dieser Studie liegt sie zwischen 50 und 500.</li>
	<li>Achten Sie darauf, dass die Kästchen Objekte und Zusammenfassung markiert sind.</li>
	<li>Klicken Sie auf OK. Die Anzahl der Punkte wird in der Zusammenfassung als erkannte Objekte beschrieben.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65005/65005fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des LC3-Immunfluoreszenzprotokolls. Schematische Darstellung, die das allgemeine Protokoll für die LC3-Immunfluoreszenz darstellt. Mit BioRender.com erstellte Figur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65005/65005fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte erklärt.

Die in diesem Protokoll beschriebene Methode ermöglicht es, die endogene LC3-Verteilung in der Zelle zu visualisieren und die autophagischen Konzentrationen unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren. Eine weitere ähnliche Methode zur Analyse der LC3-Verteilung und zur Bestimmung der Autophagieaktivierung ist die fluoreszenzmarkierte LC3-Transfektion (z. B. RFP-LC3)19. Die RFP-LC3-Transfektion hat den Vorteil, dass keine Fixierung erforderlich ist (was die Anwendung dieser Methode in der Le...

Makroautophagie (allgemein als Autophagie bezeichnet) ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden 1,2. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten3. Bei der Autophagie entsteht ein Doppelmembranvesikel: das Autophagosom. Das Autophagosom enthält die Frachtmoleküle und treibt sie zum Abbau in das Lysosom 1,4.
Autophagosomen werden durch das autophagische Protein Mikrotubuli-assoziiertes Protein Light Chain 3 (LC3)5 dekoriert. Wenn keine Autophagie induziert wird, diffundiert LC3 im Zytoplasma und Zellkern in der LC3-I-Konformation. Wenn andererseits Autophagie induziert wird, wird LC3 mit einem Phosphatidylethanolamin in der Membran der autophagischen Strukturenkonjugiert 6. Diese neue LC3-Konformation wird als LC3-II1 bezeichnet. Die Konformationsverschiebung von LC3 führt zu Veränderungen in der zellulären Lokalisation und der Migration der Dodecylnatriumsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die durch Techniken wie Immunfluoreszenz und Western Blot 5,7 nachgewiesen werden können. Auf diese Weise ist die LC3-Konjugation ein Schlüsselereignis im autophagischen Prozess, das zur Messung der autophagischen Aktivität verwendet werden kann.
Die Azinuszelle der Bauchspeicheldrüse ist eine hochdifferenzierte Zelle, die unter gesunden Bedingungen eine geringe Autophagierate aufweist. Unter verschiedenen physiologischen Bedingungen oder unter pharmakologischer Stimulation können sie jedoch die Autophagie aktivieren. Daher ist die Bestimmung der autophagischen Konzentrationen in dieser Zelllinie nützlich, um die möglichen direkten oder indirekten Auswirkungen verschiedener pharmakologischer oder biologischer Wirkstoffe auf die Autophagie zu untersuchen 8,9.
Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist aufgrund seiner späten Diagnose und seiner hohen Chemotherapieresistenz eine der tödlichsten Krebsarten10. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagie-verwandten Proteinen eine hohe Autophagieaktivität auf11. Bauchspeicheldrüsenkrebszellen können ihre Autophagie als Reaktion auf ungünstige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Chemotherapie-induzierte Schäden anpassen11. Daher kann die Analyse des Autophagieniveaus in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen helfen zu verstehen, wie sie sich an unterschiedliche Umgebungen anpassen, und die Wirksamkeit von autophagiemodulierenden Behandlungen bewerten.
Diese Studie zeigt eine Methode zur Durchführung von LC3-Immunfluoreszenz in zwei verschiedenen zellulären Modellen der Bauchspeicheldrüse. Das erste Modell, PANC-1-Zellen, diente als Modell für das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse. Diese Zellen wurden mit Gemcitabin behandelt, einem Chemotherapeutikum, von dem bereits gezeigt wurde, dass es Autophagie induziert, insbesondere in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, die das onkogene Kirsten-Rattensarkomvirus-Gen (KRAS) tragen12,13. Das zweite Modell, AR42J-Zellen, diente als physiologischeres Modell exokriner Pankreaszellen. Diese Zellen wurden mit Dexamethason differenziert, um den azinären Pankreaszellen ähnlicher zu werden14. In diesen Zellen wurde die Autophagie pharmakologisch durch die Verwendung von PP242 induziert, das ein potenter mTOR-Inhibitor ist15. In dieser Studie demonstrieren wir die Anwendbarkeit des beschriebenen Protokolls mit zwei verschiedenen Pankreasmodellen und seine Fähigkeit, zwischen Zuständen niedriger und hoher Autophagie zu unterscheiden.

<table><tbody><tr><td>10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>12 mm runde Deckgläser</td><td>HDA</td><td>CBR_OBJ_6467</td><td></td></tr><tr><td>24 Well- Zellkulturplatte</td><td>Sorfa</td><td>220300</td><td></td></tr><tr><td>Absolutes Ethanol</td><td>Biopack</td><td>2207.10.00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>R37119</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEN</td><td>Sartorius</td><td>01-052-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>NATOCOR&nbsp;</td><td>Lintc-634</td><td></td></tr><tr><td>Gemcitabina</td><td>Eli Lilly</td><td>VL7502</td><td></td></tr><tr><td>LC3B (D11) XP Kaninchen mAb</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>3868S</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Anedra</td><td>6197</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" (Laborversiegelungsfilm)</td><td>Bemis/Curwood</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep Lösung</td><td>Sartorius</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>PP242</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>SC-301606</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Gibco</td><td>11570626</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluierung der autophagie in zwei verschiedenen pankreaszellmodellen mittels lc3-immunfluoreszenz

Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence

Autophagie ist ein spezialisierter kataboler Prozess, bei dem zytoplasmatische Komponenten, einschließlich Proteine und beschädigte Organellen, selektiv abgebaut werden. Autophagie ermöglicht es Zellen, physiologisch auf Stressreize zu reagieren und so die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Krebszellen könnten ihre Autophagie modulieren, um sich an widrige Bedingungen wie Hypoxie, Nährstoffmangel oder Schäden durch Chemotherapie anzupassen. Das duktale Pankreas-Adenokarzinom ist eine der tödlichsten Krebsarten. Pankreaskarzinomzellen weisen aufgrund der transkriptionellen Hochregulation und posttranslationalen Aktivierung von Autophagieproteinen eine hohe Autophagieaktivität auf.
Hier wurde die PANC-1-Zelllinie als Modell für menschliche Krebszellen der Bauchspeicheldrüse und die AR42J-Pankreas-Azinuszelllinie als physiologisches Modell für hochdifferenzierte Säugetierzellen verwendet. In dieser Studie wurde die Immunfluoreszenz der Mikrotubuli-assoziierten Protein-Leichtkette 3 (LC3) als Indikator für den Status der Autophagie-Aktivierung verwendet. LC3 ist ein Autophagieprotein, das unter basalen Bedingungen ein diffuses Verteilungsmuster im Zytoplasma aufweist (in diesem Zustand als LC3-I bekannt). Die Autophagie-Induktion löst die Konjugation von LC3 mit Phosphatidylethanolamin auf der Oberfläche neu gebildeter Autophagosomen aus, um LC3-II zu bilden, ein membrangebundenes Protein, das die Bildung und Expansion von Autophagosomen unterstützt. Um die Anzahl der markierten autophagischen Strukturen zu quantifizieren, wurde die Open-Source-Software FIJI mit Hilfe des Tools "3D Objects Counter" eingesetzt.
Die Messung der autophagischen Konzentrationen sowohl unter physiologischen Bedingungen als auch in Krebszellen ermöglicht es uns, die Modulation der Autophagie unter verschiedenen Bedingungen wie Hypoxie, Chemotherapie oder dem Knockdown bestimmter Proteine zu untersuchen.

Dieses Protokoll führt die Immunfluoreszenz von LC3 in Pankreaszelllinien durch, um die Autophagieniveaus unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen. Das Ergebnis dieses Experiments war die Gewinnung zellulärer Bilder aus dem roten und blauen Kanal, die LC3 und DAPI entsprechen. Die LC3-Bilder zeigen die zelluläre Verteilung dieses Proteins, während die DAPI die Kernlokalisation zeigt. Abbildung 2A zeigt ein repräsentatives Bild der Immunfluoreszenz von LC3 und seiner Verschmelzung mit der...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die autophagischen Konzentrationen bei Bauchspeicheldrüsenkrebs und Pankreasazinuszellen durch LC3-Immunfluoreszenz und LC3-Punktquantifizierung zu bestimmen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

Autophagy is a specialized catabolic process that selectively degrades cytoplasmic components, including proteins and damaged organelles. Autophagy allows ...

Die LC3-Immunfluoreszenz ermöglicht die Bestimmung des Autophagieniveaus in Pankreaszellen. Es ermöglicht die Untersuchung der möglichen Auswirkungen verschiedener Wirkstoffe auf die Autophagie von Bauchspeicheldrüsenzellen. Immunfluoreszenz ist eine Technik zum Nachweis von endogenem LC3-Protein, wodurch Probleme vermieden werden, die durch eine Überexpression von LC3 verursacht werden, wie z. B. die Bildung von Proteinaggregaten, die nichts mit Autophagie zu tun haben.Felipe Renna, Doktorand, und Malena Herrera López, Doktorandin aus dem Labor von Maria Ines Vaccaro, demonstrieren das Verfahren. Um mit der Zellvorbereitung zu beginnen, tränken Sie runde 12-Millimeter-Deckgläser in absolutem Ethanol. Legen Sie nach dem Entfernen des Deckels das getränkte Deckglas senkrecht in die 24-Well-Platte.Setzen Sie die Multi-Well-Platte 15 Minuten lang ultravioletter Strahlung aus. Positionieren Sie dann das Deckglas waagerecht und waschen Sie es mit DMEM. Sehen Sie sich nun die geringe Anzahl von Pankreaszellen an, die in DMEM resuspendiert wurden und 10 % FBS, Penicillin und Streptomycin enthalten, und inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.Zwei Tage nach der Zellaussaat wird eine Gemcitabinlösung in DMEM mit einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter hergestellt. Saugen Sie dann die Hälfte des Volumens aus jeder Vertiefung in einem separaten Röhrchen ab und fügen Sie eine angemessene Menge Gemcitabinlösung hinzu. Geben Sie das halbe Volumen, das jeder Vertiefung entspricht, zurück in die behandelten Vertiefungen und inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang.Zur Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wird kaltes Methanol in eine 24-Well-Platte mit Zellen gegeben. Bereiten Sie auch eine Sechs-Well-Platte mit kaltem PBS vor. Nehmen Sie mit einer Spritzennadel und einer Pinzette jedes Deckglas und waschen Sie es zweimal in PBS.Anschließend sechs Minuten in Methanol inkubieren. Nach zweimaligem Waschen mit PBS inkubieren Sie die Deckgläser eine Stunde lang in einer Blockierlösung. Fügen Sie der Blockierlösung im Verhältnis eins zu 1000 ein Anti-LC3 hinzu und halten Sie es auf Eis.Legen Sie ein Stück Laborversiegelungsfolie über den Multi-Well-Deckel und geben Sie 25 Mikroliter Anti-LC3-Lösung pro Deckglas über die Versiegelungsfolie. Legen Sie mit einer Spritzennadel und einer Pinzette jedes Deckglas über den primären Antikörpertropfen und stellen Sie sicher, dass die Zellseite mit der Lösung in Kontakt kommt. Legen Sie die Multi-Well-Platte in die Feuchtigkeitskammer.Mit Folie abdecken und über Nacht im Kühlschrank inkubieren. Nehmen Sie am nächsten Tag die Multi-Well-Platte aus der Feuchtigkeitskammer. Legen Sie die Deckgläser wieder auf die Multi-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS.Verdünnen Sie fluoreszenzmarkiertes Anti-Kaninchen in einer Blockierlösung im Verhältnis eins zu 800 und bewahren Sie es im Dunkeln auf Eis auf. Geben Sie nach dem Verschließen des Multiwell-Deckels 25 Mikroliter Anti-Kaninchen-Lösung pro Deckglas über die Siegelfolie. Und behandeln Sie das Deckglas wie zuvor gezeigt mit einem Sekundärantikörper.Anschließend inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang in der Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur und geschützt vor Licht. Waschen Sie am Ende der Inkubation mit Antikörpern die Deckgläser auf der Multiwell-Platte dreimal mit PBS. Inkubieren Sie jedes Deckglas mit der vorbereiteten DAPI-Lösung 10 Minuten lang.Bewahren Sie die Multiwell-Platte nach dem Waschen mit PBS im Dunkeln auf. Bereiten Sie für die Zellmontage zwei Becher mit Wasser und einem Blatt Papier vor. Geben Sie 10 Mikroliter PVA-DABCO-Lösung pro Deckglas auf einen Objektträger.Waschen Sie das Deckglas in Wasser und trocknen Sie es dann auf Papier. Zum Schluss legen Sie es über den PVA-DABCO-Tropfen. Und trocknen Sie über Nacht im Dunkeln.Schließen Sie dann das geöffnete Konsolenfenster. Wählen Sie auf der Registerkarte Bild die Option Farbe und dann Kanäle teilen aus. Schließen Sie das Bild, das den anderen Kanälen als dem LC3-Bild entspricht.Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Bild" die Option "Anpassen" und dann "Farbbalance". Verschieben Sie den Schieberegler "Maximum" nach links, bis das Bild gesättigt ist, um die Zellenkonturen zu visualisieren. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um den Zellenumriss zu zeichnen, und klicken Sie auf Zurücksetzen, um die Farben anzupassen.Um das ausgewählte Element auf der Registerkarte "Bearbeiten" auszuschneiden, wählen Sie "Ausschneiden" und schließen Sie das Bild, ohne es zu speichern. Wählen Sie auf der Registerkarte Bearbeiten die Option Einfügen aus. Wählen Sie im Menü "Analysieren" das Werkzeug "Zähler für 3D-Objekte" aus.Legen Sie den Schwellenwert auf 2000 und den Größenfilter auf 50 bis 500 fest. Stellen Sie sicher, dass die Objekte und Zusammenfassungsfelder markiert sind, und klicken Sie auf OK.In Protokollfenster, die Anzahl der Punkte wird als erkannte Objekte beschrieben. Die Immunfluoreszenz zeigte die zelluläre Verteilung des LC3-Proteins, während die DAPI eine nukleäre Lokalisation in Pankreaszellen zeigte.Die LC3-Punkte stiegen unter Gemcitabin-Behandlung signifikant an, was auf eine autophagische Aktivität hinweist. Bei einem übermäßigen Zusammenfluss neigen die exokrinen Pankreaszellen dazu, sich aufzutürmen und übereinander zu wachsen. Die Paraformaldehyd-Zellfixierungsmethode erwies sich als unwirksam für die Konservierung von LC3-Proteinen, da sie keine genaue Verteilung widerspiegelte.Wenn die Fixierung oder Behandlung durchgeführt wurde, ohne zwei Tage nach der Aussaat zu warten, hatten die PANC1-Zellen eine runde Form. Diese Morphologie verringerte die Beziehung zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern, was es schwierig machte, die intrazelluläre Verteilung von LC3 zu verstehen. Eine unvollständige Methanolfixierung könnte die korrekte LC3-Immunmarkierung beeinträchtigen, was zu unklaren Bildern und einer suboptimalen Quantifizierung führen könnte.Das Wichtigste, was bei diesem Verfahren zu beachten ist, ist, dass die Zellen sechs Minuten lang in kaltem Methanol anstelle von Paraformaldehyd fixiert werden müssen. Nach diesem Verfahren kann die Kolokalisation zwischen LC3 und anderen Proteinen analysiert werden, was die Untersuchung verschiedener molekularer Signalwege im Zusammenhang mit LC3-Funktionen ermöglicht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Autophagie ist ein allgegenwärtiges Prozess, Zellen zu zersetzen und zu recyceln Proteine ​​und Organellen ermöglicht. Wir bieten fortschrittliche Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren und zu quantifizieren, die klein, aber wichtig, körperliche Veränderungen mit der Induktion von Autophagie verbunden sind, einschließlich der Bildung und Verteilung von Autophagosomen und Lysosomen, und deren Verschmelzung zu autolysosomes.

Quantitative Analyse von Autophagie mit Advanced 3D Fluoreszenzmikroskopie

Zeitraffer-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Autophagie Marker erlaubt die Überwachung der dynamischen Autophagie Reaktion mit hoher zeitlicher Auflösung. Mit spezifischen Autophagie und Organellen Marker in einer Kombination aus 3 verschiedenen Farben, können wir folgen den Beitrag eines Proteins an Autophagosom Bildung in einem robusten räumlichen und zeitlichen Kontext.

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.<br...

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Aktive Autophagie ist mit produktiven Muskelregeneration verbunden, die für die Muskelstammzell-Aktivierung (MuSC) essentiell ist. Hier stellen wir ein Protokoll für die in situ- Detektion von LC3, einen Autophagie-Marker in MyoD-positiven MuSCs von Muskelgewebeabschnitten von Kontroll- und verletzten Mäusen zur Verfügung.

In situ Immunfluoreszenz Färbung der Autophagie in Muskelstammzellen

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für eine optimierte korrelative Lichtelektronenmikroskopie vor, die auf endogener, fluoreszierender Markierung basiert, um die Lokalisierung seltener Proteine in Bezug auf die zelluläre Ultrastruktur zu untersuchen. Die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes wird durch die ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 in ausgehungerten Zellen ohne Bafilomycin-Behandlung demonstriert.

Ultrastrukturelle Lokalisierung von endogenem LC3 mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Hier stellen wir die Methodik zur prägnanten Bestimmung des Autophagosomenmarkers LC3-II-Spiegel in extrazellulären Vesikeln (EVs) durch Immunblotting vor. Die Analyse der LC3-II-Spiegel in EVs, der Autolysosomenbildung und der Omegasomenbildung deutet auf die neue Rolle von STX6 bei der Freisetzung von LC3-II-positiven EVs hin, wenn die Autophagosomen-Lysosomenfusion gehemmt wird.

Bewertung der LC3-II-Freisetzung über extrazelluläre Vesikel in Bezug auf die Akkumulation intrazellulärer LC3-positiver Vesikel

Mehrphotonenmikroskopie ermöglicht die Steuerung von Photonen niedriger Energie mit tiefen optischen Durchbruch und geringere Phototoxizität. Wir beschreiben den Einsatz dieser Technologie für Live-Cell-Kennzeichnung in Zebrafisch-Embryonen. Dieses Protokoll kann leicht für die Foto-Induktion verschiedener Licht-responsive Moleküle angepasst werden.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Lernen Sie die LC3-Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Autophagie in Pankreaskrebs- und Azinuszellen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen zur Erforschung molekularer Mechanismen.

Evaluierung der Autophagie in zwei verschiedenen Pankreaszellmodellen mittels LC3-Immunfluoreszenz

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