Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor
1. April 2011
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentration in lebenden Zellen zu überwachen. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst mit dem kalziumindikatorischen Proteins Ratiometrik Peram transfiziert werden, das auf die mitochondriale Matrix ausgerichtet ist, ein oder zwei Tage nach der Transfektion. Das Fluoreszenzmikroskop und die Software werden für die Live-Cell-Bildgebung eingerichtet.
Bilder von Zellen, die ein ratiometrisches Peram exprimieren, werden anschließend nach Zugabe eines Kalzium-mobilisierenden Agonisten aufgenommen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die quantitative Analyse der aufgenommenen Bilder. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die dynamische Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentration mittels Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen, die ein ratiometrisches Kalziumindikatorprotein exprimieren, zeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Messung von Kalziumkonzentrationen mithilfe synthetischer Kalziumindikatoren, liegt darin, dass das ratiometrische Peram genetisch kodiert ist und somit gezielt zu Mitochondrien oder einem anderen beliebigen Organell der Wahl geleitet werden kann. Hallo, ich bin Dr. Ascar, Postdoktorand im Labor von Dr. Benning, und werde heute die Methode vorführen. Um mit dem Protokoll zu beginnen, säen Sie am Vorabend HELA-Zellen auf sterilen Glasdeckgläsern aus, die in einer standardmäßigen sechswelligen Kulturplatte platziert sind, und zwar mit einer Dichte, die am folgenden Tag für die Transfektion etwa 70 % konfluent betragen wird. Bereiten Sie am nächsten Tag DNA-Lipofektamin-2000-Komplexe gemäß den Herstelleranweisungen vor, mit vier Mikrogramm des mitochondrialen Expressionsvektors für ratiometrisches Peram und 10 Mikrolitern Lipofektamin 2000, verdünnt in 0,5 Milliliter Opti-MEM pro zu transfectierender Vertiefung.
Als Nächstes ersetzen Sie das D-M-E-M-F-B-S HELOC-Kulturmedium in jedem Brunnen durch 1,5 Milliliter des gleichen Mediums ohne Antibiotika. Geben Sie die LIPECTOMY-Lösung zur DNA-Lösung hinzu und mischen Sie vorsichtig, nachdem die Komplexe gebildet wurden. Fügen Sie die DNA-Lipectomy-Lösung tropfenweise den zu transinfizierenden Brunnen hinzu, mischen Sie durch vorsichtiges Schaukeln der Platte und inkubieren Sie vier Stunden lang in einem Zellkulturinkubator bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, nach der Inkubation.
Ersetzen Sie das Medium durch D-M-E-M-F-B-S mit Antibiotika. Lassen Sie die Zellen ein bis zwei Tage lang Metrik Peram exprimieren, bevor Sie mit einer Pinzette abbilden. Legen Sie vorsichtig einen Deckglaser mit HELOC-Zellen in eine geeignete Bildgebungskammer mit Bildgebungslösung.
Bringen Sie die Bildgebungsanordnung auf dem Objekttisch eines invertierten Mikroskops an. Verwenden Sie anschließend ein Öl-Immersionobjektiv mit 40x oder höherer Vergrößerung und eine Wellenlänge von 380 Nanometern. Um einen Bereich von Interesse zu finden, der eine oder mehrere Zellen enthält, die ratiometrisches Peram ausdrücken, wird hier 380 Nanometer verwendet, um die Zellen als ratiometrisch zu identifizieren.
Peram ist bei dieser Wellenlänge weniger resistent gegenüber Photobleichen. Sobald ein Bereich von Interesse identifiziert wurde, richten Sie die Software für die duale Anregung bei 495 und 380 Nanometern ein. Erwerben Sie anschließend nacheinander Bilder, indem Sie abwechselnd bei 495 und 380 Nanometern anregen.
Nehmen Sie mindestens 30 Sekunden lang Bilder der Grundwerte der Kalziumkonzentration auf, bevor Sie den Agonisten zugeben. Anschließend wird der Kalzium-mobilisierende Agonist über eine Perfusionsvorrichtung zugegeben, wobei der Zeitpunkt der Zugabe für jede Agonistenexposition vermerkt wird; die Belichtungszeiten und Aufnahmeintervalle sollten optimiert werden, um eine Photo-Bleaching zu vermeiden, gleichzeitig aber eine ausreichende zeitliche Auflösung zu gewährleisten. Nach Abschluss des Experiments können die Bilder offline analysiert werden.
Um die Analyse zu beginnen, wählen Sie einen interessierenden Bereich in einem leeren Bereich des Feldes aus, um die Hintergrundfluoreszenz gegebenenfalls zu subtrahieren. Exportieren Sie anschließend die 4 95 3 80-Verhältnismessungen aus dem interessierenden Bereich in Excel oder eine ähnliche Diagrammsoftware. Dieses Bildfeld zeigt die subzelluläre Lokalisation des Verhältnis-Mess-Perams und der Mitochondrien.
Auf der linken Seite ist ein Live-Cell-Bild von Helo-Zellen, die ein ratiometrisches Peram exprimieren. In der Mitte befindet sich die fluoreszierende Färbung der Mitochondrien mit dem selektiven Farbstoff MitoTracker Red CMXRos. Und schließlich rechts das hier gezeigte überlagerte Bild, das eine Serie von Pseudofarben-495-,380-Nanometer-Ratio-Bildern von vier Helo-Zellen zeigt, die ratiometrisches Peram in Mitochondrien exprimieren und mit 10 Mikromolar ATP behandelt wurden. Die Quantifizierung der Änderungen der mitochondrialen Calciumspiegel dieser vier vorhergehenden Zellen ist hier in diesem Bild einer Hela-Zelle dargestellt, die ratiometrisches Peram in den Mitochondrien exprimiert.
Die Heterogenität der Kalziumantwort einzelner Mitochondrien sowie eine signifikante Fragmentierung der Mitochondrien ist nach 60 Minuten Behandlung mit 0,5 Mikromolar Storsporin erkennbar. Einige Mitochondrien zeigen oszillierende Kalziumanstiege, dargestellt durch den weißen Pfeil, während andere keine signifikanten Änderungen des Kalziumspiegels aufweisen, dargestellt durch einen gelben Pfeil. Dieses Diagramm zeigt die Veränderung der globalen mitochondrialen Kalziumkonzentration in einer einzelnen HELO-Zelle nach 120-minütiger Induktion der Apoptose mit 0,5 Mikromolar Storsporin.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie dynamische Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentrationen als Reaktion auf verschiedene tli unter Verwendung des kalziumvermittelten Proteins R geometric peram gemessen werden, das gezielt auf die mitochondriale Matrix ausgerichtet ist.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung von mitochondrialen Kalzium-Flüssen unter Verwendung eines genetisch kodierten Kalzium-Indikators, dem ratiometrischen Pericam-mt. Diese Technik ermöglicht die dynamische Überwachung der Kalziumkonzentrationen in lebenden Zellen und liefert Erkenntnisse über die mitochondriale Funktion.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Fluoreszenzbildgebung
Hintergrund
- Die mitochondriale Kalziumkonzentration ist entscheidend für den zellulären Stoffwechsel und die Signalübertragung.
- Herkömmliche Methoden zur Messung der Kalziumkonzentration basieren häufig auf synthetischen Indikatoren.
- Genetisch kodierte Indikatoren bieten Vorteile hinsichtlich Spezifität und gezielter Lokalisierung.
- Diese Studie verwendet ratiometrisches Pericam-mt zur verbesserten Abbildung der dynamischen mitochondriale Kalziumveränderungen.
Zweck der Studie
- Um Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentration in lebenden Zellen zu überwachen.
- Um die Verwendung eines genetisch kodierten, auf Mitochondrien gezielten Kalziumindikators zu demonstrieren.
- Um eine detaillierte Anleitung zur Bildgebung und Analyse von mitochondrialen Kalziumflüssen bereitzustellen.
Verwendete Methoden
- Transfektion von Zellen mit ratiometrischem Pericam-mt.
- Live-Cell-Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
- Sequenzielle Anregung bei zwei Wellenlängen zur Kalziummessung.
- Quantitative Analyse von Fluoreszenzbildern zur Beurteilung der Kalziumdynamik.
Hauptergebnisse
- Es wurden erfolgreich dynamische Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentrationen gemessen.
- Es wurde eine Heterogenität der Kalziumantworten zwischen einzelnen Mitochondrien beobachtet.
- Unter bestimmten Behandlungen wurde eine signifikante Fragmentierung der Mitochondrien festgestellt.
- Die Ergebnisse zeigten die Wirksamkeit des ratiometrischen Pericam-mt für die Echtzeit-Bildgebung auf.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der mitochondrialen Kalziumdynamik.
- Genetisch kodierte Indikatoren wie der verhältnis-metrische Pericam-mt verbessern die Abbildungsmöglichkeiten.
- Diese Technik kann unter verschiedenen experimentellen Bedingungen angewendet werden, um die mitochondriale Funktion zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Überwachung der mitochondrialen Kalziumdynamik liefert entscheidende mechanistische Einblicke in Apoptosewege und ermöglicht die Validierung von Zielstrukturen in Zelltodmechanismen. Dieser Ansatz mit genetisch kodierten Sensoren unterstützt die Vorhersagegenauigkeit in präklinischen Modellen, indem organellespezifische Kalziumflüsse mit zeitlicher Auflösung quantifiziert werden. Die Methode ermöglicht eine frühzeitige Absicherung therapeutischer Hypothesen, die mitochondriale Dysfunktionen in Krankheitsmodellen betreffen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von mitochondrialem Kalzium als Regulator apoptotischer Signalwege zur Überprüfung spezifischer Hypothesen.
- Operationaler Wert: Bietet organellespezifische Messgrößen, die Mehrdeutigkeiten in mechanistischen Studien zum Zelltod verringern.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der kalziumvermittelten Apoptose beteiligt sind, durch Echtzeit-Flussmessungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative, verhältnisbasierte Daten, die Dosis-Wirkungs-Analysen von Substanzen ermöglichen, die den mitochondrialen Calciumhaushalt beeinflussen.
- Operativer Wert: Kompatibel mit Standard-Breitfeldmikroskopie, wodurch eine Integration in bestehende Bildgebungssysteme ohne spezielle Ausrüstung möglich ist.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die langfristige Verfolgung von Kalziumdynamik und mitochondrialer Morphologie in lebenden Zellen über mehrere Stunden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet mitochondriale Kalziumveränderungen mit apoptotischen Ergebnissen und untermauert damit die Relevanz von Biomarkern in Krankheitsmodellen.
- Operativer Wert: Zeigt die Anwendbarkeit sowohl mit ATP (physiologischer Agonist) als auch mit Staurosporin (Apoptoseinduktor), wodurch die Einsatzmöglichkeiten über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg erweitert werden.
- Translationale Kontinuität: Erleichtert den Übergang von der Mechanismuserforschung zur präklinischen Validierung, indem dynamische, physiologisch relevante Messgrößen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die mechanistische Entlastung bis hin zur präklinischen Bewertung ein, indem sie dynamische, quantifizierbare Daten zur mitochondrialen Funktion liefert.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung calciumabhängiger apoptotischer Signalwege durch Echtzeit-Messungen des mitochondrialen Flusses.
- Screening: Ermöglicht vorkonfektionierte Assay-Systeme mit standardisierten, reproduzierbaren Calcium-Signalen für Screening-Kampagnen von Wirkstoffen.
- Analytik: Liefert quantitative, verhältnisbasierte Ausgangssignale (Anregungsverhältnis 495 nm/380 nm), die statistische Vergleiche der Calciumdynamik unter verschiedenen Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet mitochondriale Calciumveränderungen mit apoptotischen Phänotypen und unterstützt so den Zusammenhang zwischen molekularem Mechanismus und phänotypischer Wirkung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Bildgebungsmethode zur Untersuchung mitochondrialer Dysfunktionen in verschiedenen Krankheitsbereichen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in Apoptosewegen verringert werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch genetisch kodierte, auf Organellen ausgerichtete Indikatoren, die Farbstoffaustritt und Artefakte vermeiden.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühzeitige, quantitative Einblicke in mitochondriale Wirkmechanismen von Wirkstoffen bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Verbindungen basierend auf Profilen zur Modulation der mitochondrialen Calciumhaushaltsregulation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Molekularbiologie für die Transfektion und die Bildgebung an lebenden Zellen.
- Ist abhängig von der Fluoreszenzmikroskopie mit Dual-Anregungsfähigkeit (380 nm und 495 nm) und Standard-Filter-Sätzen.
- Erfordert die Standardisierung von Bildaufnahmeprotokollen und die Analyse von interessierenden Bildbereichen (Region-of-Interest) über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Effizienz der mitochondrialen Targeting und mögliche Überexpressionseffekte in verschiedenen Zellmodellen.
- Praktische Einschränkungen beinhalten das Risiko der Photobleiche bei Langzeit-Bildgebung und die Notwendigkeit der Optimierung der Agonisten-Expositionsintervalle.
