Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentration in lebenden Zellen zu überwachen. Dies wird erreicht, indem Zellen zunächst ein oder zwei Tage nach der Transfektion mit dem Kalziumindikator-Proteinverhältnis metrisch peram transeziert werden, das auf die mitochondriale Matrix ausgerichtet ist. Das Fluoreszenzmikroskop und die Software sind für die Bildgebung lebender Zellen ausgelegt.

Bilder von ratiometrischen Peram-exprimierenden Zellen werden dann unter Zugabe eines kalziummobilisierenden Agonisten aufgenommen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die quantitative Analyse der aufgenommenen Bilder. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die dynamische Veränderungen der mitochondrialen Kalziumkonzentration durch Fluoreszenzmikroskopie von lebenden Zellen zeigen, die ein ratiometrisches Kalziumindikatorprotein exprimieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Messung des Kalziumspiegels unter Verwendung synthetischer Kalziumindikatoren, besteht darin, dass das Verhältnis metrischer Peram genetisch kodiert ist und daher auf Mitochondrien oder jedes andere Organal von Interesse ausgerichtet werden kann. Hallo, ich bin Dr. Ascar, ein Postdoc in Dr. Bennings Labor, und ich werde das Verfahren heute demonstrieren. Um mit dem Protokoll zu beginnen Platte Helozellen am Vorabend, Transfektion auf sterilen Glasdeckgläsern, die in eine Standard-Kulturplatte mit sechs Vertiefungen bei einer Dichte gelegt werden, die etwa 70% konfluent für die Transfektion am nächsten Tag sein wird. Bereiten Sie am nächsten Tag DNA-Lipektomie 2000-Komplexe gemäß den Anweisungen des Herstellers mit vier Mikrogramm des metrischen mitochondrialen Peram-Expressionsvektors und 10 Mikrolitern Lipektomie 2000 vor, verdünnt in 0,5 Millilitern des Optimums für jede zu transfizierende Vertiefung.

Ersetzen Sie anschließend die D-M-E-M-F-B-S HELOC-Nährmedien in jeder Vertiefung durch 1,5 Milliliter desselben Mediums ohne Antibiotika. Geben Sie die LIPEKTOMIELÖSUNG in die DNA-Lösung und mischen Sie sie vorsichtig, nachdem sich die Komplexe gebildet haben. Geben Sie die DNA-Lipektomielösung tropfenweise in jede zu transfizierende Vertiefung, mischen Sie sie, indem Sie die Platte leicht schaukeln, und inkubieren Sie nach der Inkubation vier Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid.

Ersetzen Sie das Medium durch D-M-E-M-F-B-S, das Antibiotika enthält. Lassen Sie die Zellen ein bis zwei Tage lang den metrischen Peram exprimieren, bevor Sie mit einer Pinzette abbilden. Legen Sie ein Deckglas mit HELOC-Zellen vorsichtig in eine geeignete Bildgebungskammer mit Bildgebungslösung.

Montieren Sie die Bildgebungskammer in einem inversen Mikroskoptisch. Verwenden Sie als Nächstes ein Ölimmersionsobjektiv mit 40 x oder höher und eine Wellenlänge von 380 Nanometern. Um einen Interessenbereich zu finden, der eine oder mehrere Zellen enthält, die das Verhältnis metrisch peram 380 Nanometer ausdrücken, wird hier verwendet, um die Zellen als Verhältnis metrisch zu identifizieren.

Peram ist bei dieser Wellenlänge weniger beständig gegen Photobleichung. Sobald ein Interessenbereich identifiziert wurde, richten Sie die Software für die duale Anregung bei 495 und 380 Nanometern ein. Nehmen Sie als Nächstes Bilder nacheinander auf, indem Sie sie abwechselnd bei 495 und 380 Nanometern anregen.

Nehmen Sie mindestens 30 Sekunden lang Bilder des Kalziumausgangs auf, bevor Sie den Agonisten anwenden. Tragen Sie dann den kalziummobilisierenden Agonisten über ein Profusionsgerät auf, wobei die Additionszeit für jeden Agonisten zu beachten ist, die Expositionszeiten und die Aufnahmeintervalle sollten optimiert werden, um Photobleiche zu verhindern und gleichzeitig eine ausreichende zeitliche Auflösung zu ermöglichen. Sobald das Experiment abgeschlossen ist, können die Bilder offline analysiert werden.

Um mit der Analyse zu beginnen, wählen Sie einen interessierenden Bereich innerhalb eines leeren Bereichs des Feldes aus, um bei Bedarf die Hintergrundfluoreszenz zu subtrahieren. Exportieren Sie als Nächstes die 4 95 3 80 Verhältnismessungen aus dem interessierenden Bereich in Excel oder eine ähnliche Grafiksoftware. Dieser Bildausschnitt zeigt die subzelluläre Lokalisation des Verhältnisses, des metrischen Perams und der Mitochondrien.

Auf der linken Seite ist ein Live-Zellbild von Helozellen zu sehen, die das metrische Verhältnis peram exprimieren. In der Mitte befindet sich die Fluoreszenzfärbung der Mitochondrien und der selektive Farbstoff MIT tracker red CMX Ross. Und schließlich auf der rechten Seite ist das hier gezeigte zusammengeführte Bild eine Serie von pseudofarbigen Bildern mit einem Verhältnis von 4 95 und 3 80 Nanometern von vier Helozellen, die in den Mitochondrien, die mit 10 mikromolaren A TP behandelt wurden, das Verhältnis metrisches Peram exprimieren, und die Quantifizierung von Veränderungen der mitochondrialen Kalziumspiegel dieser vorherigen vier Zellen ist hier in diesem Bild einer Helazelle gezeigt, die das Verhältnis metrisches Peram in den Mitochondrien exprimiert.

Die Heterogenität der Calciumreaktion in einzelnen Mitochondrien sowie eine signifikante Fragmentierung der Mitochondrien wird durch eine 60-minütige Behandlung mit 0,5 Mikromolaren stor Sporin deutlich. Einige Mitochondrien weisen einen oszillatorischen Anstieg des Kalziumspiegels auf, der mit dem weißen Pfeil dargestellt ist, während andere keine signifikanten Veränderungen des Kalziumspiegels aufweisen, die mit einem gelben Pfeil dargestellt sind. Diese Grafik zeigt die Veränderung des globalen mitochondrialen Kalziumspiegels in einer einzelnen Helozelle nach Induktion der Apoptose für 120 Minuten mit 0,5 mikromolaren stor Sporin.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie dynamische Veränderungen des mitochondrialen Kalziumspiegels als Reaktion auf verschiedene tli mit dem kalziummedizinischen Protein R geometric Peram messen können, das selektiv auf die mitochondriale Matrix ausgerichtet ist.