Erzeugung von funktionellen endodermalen Leberorganoiden

Unsere Forschung zielt darauf ab, humanrelevante in vitro Lebermodelle für die Wirksamkeits- und Sicherheitsprüfung von Arzneimitteln zu entwickeln, die gesundes und erkranktes Lebergewebe in präklinischen Studien genau nachahmen. Die Reproduktion der vollen Leberkomplexität, das Erreichen einer langfristigen Funktionalität, die Standardisierung von Protokollen und die Skalierung der Organoidproduktion für Hochdurchsatzanwendungen sind nach wie vor eine große experimentelle Herausforderung in der Organoidforschung. Wir haben kürzlich Leberfibrose aus gesunden Leberorganoiden modelliert und Modelle für seltene Lebererkrankungen, einschließlich Citrullinämie und Pyruvat-Carboxylase-Mangel, aus patienteneigenen Zellen etabliert. Im Gegensatz zu anderen Methoden liefert unser eHEPO-Protokoll schnell und skalierbar funktionsfähige Leberorganoide, die eine langfristige Funktionalität und mehrere Assays aus einer konsistenten Ausgangspopulation unterstützen.

[Erzähler] Geben Sie zunächst 6 Milliliter kaltes DMEM/F-12 in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie sofort 80 Mikroliter FOD-Basalmembranmatrix oder BMM in das Röhrchen und mischen Sie gut. Beschichten Sie eine mit Gewebekulturen behandelte Well-Platte mit der BMM-Lösung und geben Sie die Lösung ab, um die Oberfläche der Well-Platte zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in einem 37° Celsius heißen Inkubator. Nehmen Sie eine induzierbare pluripotente Stammzelle oder IPSC-Platte und aspirieren Sie das IPSC-spezifische Medium. Spülen Sie die Platte mit DMEM/F-12 oder DPBS und geben Sie 1 Milliliter des spezifischen Enzyms in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Nach einer einminütigen Inkubation aspirieren Sie das Enzym und inkubieren die Platte fünf bis sieben Minuten lang bei 37° Celsius. Geben Sie dann 1 Milliliter vorgewärmtes IPSC-Medium auf die Platte und klopfen Sie vorsichtig auf die Seite, um die undifferenzierten Kolonienaggregate von der Oberfläche der Platte zu lösen. Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen 5-Milliliter-Pipette und säen Sie dann die Zellsuspension in der gewünschten Dichte auf die BMM-beschichtete Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen drei bis fünf Tage lang bei 37° Celsius, um eine Konfluenz von 70% zu erreichen. Ersetzen Sie das IPSC-Medium durch das Endoderm-Medium, bevor Sie mit der Differenzierung beginnen. Die Zellen erhalten nach der Differenzierung eine stachelige Form, was auf die Zell-Zell-Interaktion hinweist. Spülen Sie die Endodermzellen mit PBS. Fügen Sie 300 Mikroliter Trypsin hinzu. Und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang im Inkubator. Geben Sie 3 Milliliter kaltes DMEM/F-12 in die Zellen und pipettieren Sie mit 1.000-Mikroliter-Filterspitzen, um einzelne Zellen zu erzeugen. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Entsorgen des Überstands wird das Pellet mit 10 Millilitern FACS-Puffer gewaschen. Um eine Einzelzellsuspension herzustellen, filtrieren Sie die Zellen mit einem 100-Mikrometer-Maschensieb und dann mit einem 40-Mikrometer-Maschensieb, bevor Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang zentrifugieren. Resuspendieren Sie 15 Millionen Zellen mit 105 Mikrolitern FACS-Puffer und fügen Sie der Suspension 45 Mikroliter FcR und 15 Mikroliter EpCAM hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 4° Celsius und schützen Sie die Röhre vor Licht. Fügen Sie dann 500 Mikroliter FACS-Puffer hinzu, um die Zellsuspension zu waschen. Nach dem Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern FACS-Puffer und fügen Sie der Zellsuspension 0,5 Mikromolare pro Milliliter DAPI hinzu, um die toten Zellen zu quantifizieren. Nach der Zellsortierung zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand. Und resuspendieren Sie 3.000 bis 5.000 Zellen in 20 Mikrolitern BMM. Säen Sie die Zellen aus, indem Sie ein Tröpfchen BMM in die Mitte jeder 48-Well-Platte geben und die Zellen zwei Minuten lang bei 37° Celsius inkubieren, bis das BMM verfestigt ist. Überlagern Sie das Tröpfchen mit dem Erweiterungsmedium. Um das Organoidtröpfchen zu spalten, verwerfen Sie das Organoidmedium und geben Sie 500 Mikroliter kaltes Ad-DMEM/F-12 in die Vertiefung. Verwenden Sie 1.000-Mikroliter-Filterspitzen, um die BMM-Tröpfchen kräftig zu pipettieren. Sammeln Sie maximal 10 BMM-Tröpfchen in konische 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 5 Milliliter kaltes Ad-DMEM/F-12 hinzu. Lege die Tube für drei bis fünf Minuten auf Eis. Die Zellen werden bei 200 x g fünf Minuten lang bei 4° Celsius zentrifugiert und der Überstand verworfen, bis 1 Milliliter des Überstands übrig bleibt. Pipettieren Sie das Küvettenpellet 30 bis 40 Mal kräftig mit 200-Mikroliter-Filterspitzen. Nach der mechanischen Dissoziation werden 5 Milliliter kaltes Ad-DMEM/F-12 zugegeben, bevor die Zellen fünf Minuten lang zentrifugiert werden. Entsorgen Sie den Überstand. Und lege die Suspension auf Eis. Säen Sie ein 50-Mikroliter-BMM-Tröpfchen aus. Und fügen Sie dem Expansionsmedium 25 Nanogramm pro Milliliter BMP7 hinzu. Ersetzen Sie nach dreitägiger Kultivierung das Medium durch das Differenzierungsmedium und kultivieren Sie die Zellen mindestens 14 Tage lang. Eine Immunfärbeanalyse wurde durchgeführt, um zu validieren, ob die Organoide, die aus den EpCAM+-Zellen stammen, an die Leberlinie gebunden sind. Das Vorhandensein von CK19+- und HNF4ɑ+-Zellen deutet darauf hin, dass Hepatoblasten- und Gallengangsvorläuferzellen in den Organoiden vorhanden sind. Darüber hinaus weisen Organoide, die epitheliale Gewebemarker exprimieren, wie z. B. E-CAD+-Zellen und kubische oder polyedrische Epithelzellen, die ZO-1 exprimieren, auf das Vorhandensein von Tight Junctions zwischen den Zellen hin. Die Immunhistochemie zeigte, dass die E-CAD+-Zellen eine polygonale epitheloide Struktur aufwiesen, die einen hepatozytenähnlichen Phänotyp widerspiegelt. Hier sind die transmissionselektronenmikroskopischen Aufnahmen von eHEPOs zu sehen. Die weißen Kreise zeigen die interzellulären Verbindungskomplexe. Die schwarzen Pfeile zeigen die apikale Oberflächendifferenzierung. Und der rote Pfeil zeigt einen Querschnitt aus Mikrovilli. Die qPCR-Analyse zeigte, dass Organoide reife Hepatozytenmarker wie ALB, A1AT, CYP3A4 und CYP3A7 erhielten. Ein rosa gefärbter Bereich in der PAS-Färbung zeigt die Glykogenspeicherkapazität von Organoiden an. Darüber hinaus zeigte unsere Analyse die Fähigkeit der Organoide, ALB in das Kulturmedium zu sezernieren, Ammoniak aus dem Kulturmedium zu eliminieren, die Enzymaktivität von CYP3A4 und die Transportkapazität der Gallensäuren.