On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

OLA ist eine vielseitige mikrofluidische Plattform, die für die Gemeinschaft der synthetischen Biologie nützlich ist. insbesondere um künstliche Zellen zu biotechnologisch zu verändern. OLA-basierte Liposomen können uns helfen, die Prinzipien der Selbstorganisation in der Biologie zu verstehen und zellähnliche Strukturen zu konstruieren.

OLA produziert monodisperse, unilaminare Liposomen in Zellgröße in einem Hochdurchsatz und mit einer hervorragenden Verkapselungseffizienz. Es werden sehr kleine Probenvolumina in der Größenordnung von 50 Mikrolitern benötigt, und die gebildeten Liposomen stehen sofort für weitere On-Chip-Experimente zur Verfügung. OLA eignet sich für die Untersuchung biologischer Reaktionen innerhalb von Mikroeinschlüssen, Vesikeldynamik und biomolekularen Kondensaten und deren Wechselwirkungen mit Membranen.

OLA wurde auch als Hochdurchsatzplattform für das Screening von Medikamenten eingesetzt, um beispielsweise die Permeabilität und Membranaktivität von antimikrobiellen Mitteln zu testen. Die Oberflächenfunktionalisierung, bei der es sich um eine PV-Behandlung handelt, ist ein kritischer Schritt für das Protokoll und muss sorgfältig durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die PV-Lösung in das innere Kammerwasser und die lipidführenden organischen Kanäle eindringt. Außerdem sollte der Postproduktionskanal gerade lang genug sein, damit die Oktanoltaschen getrennt werden können, um Liposomen zu bilden.

Ketan Ganar, ein Doktorand aus meinem Labor, wird Chang Chen helfen, das Verfahren zu demonstrieren. Nehmen Sie zunächst einen sauberen Siliziumwafer mit einem Durchmesser von vier Zoll und reinigen Sie ihn weiter mit Druckluft, um Staubpartikel zu entfernen. Montieren Sie den Wafer auf einem Spin Coater und geben Sie vorsichtig etwa fünf Milliliter eines Negativ-Fotolacks in die Mitte des Wafers.

Um eine 10 Mikrometer dicke Fotolackschicht zu erhalten, stellen Sie die Schleuderbeschichtungseinstellungen für 30 Sekunden auf 500 U/min mit einer Beschleunigung von 100 UVP pro Sekunde für die anfängliche Spreizung ein, gefolgt von einer 60-sekündigen Schleuderung bei 3.000 U/min mit einer Beschleunigung von 500 U/min pro Sekunde. Dann die Waffel schleudern. Die Waffel auf einer Heizplatte zwei Minuten bei 65 Grad Celsius und dann fünf Minuten bei 95 Grad Celsius backen.

Sobald der Wafer abgekühlt ist, montieren Sie den Wafer in der Druckkammer der optischen Lithographiemaschine direkt rechts und führen Sie die Oktanol-unterstützte Liposomenanordnung oder das OLA-Design in die Software ein. Sobald das Design gedruckt ist, backen Sie die Waffel eine Minute lang bei 65 Grad Celsius, gefolgt von 95 Grad Celsius für drei Minuten. Um den nicht ausgehärteten Fotolack abzuwaschen, tauchen Sie den Wafer in ein Glasbecherglas mit der Entwicklerlösung, bis der nicht ausgehärtete Fotolack vollständig entfernt ist.

Backen Sie den Wafer 30 Minuten lang bei 150 Grad Celsius hart, um sicherzustellen, dass das gedruckte Design fest auf der Waferoberfläche haftet und sich im nachgelagerten Herstellungsprozess nicht ablöst. Um das mikrofluidische Gerät vorzubereiten, legen Sie den Master-Wafer auf ein quadratisches Stück Aluminium und wickeln Sie die Aluminiumfolie um den Wafer, um eine gut aussehende Struktur zu bilden. Gießen Sie die PDMS-Mischung vorsichtig auf den Master-Wafer.

Die Baugruppe in einem Ofen bei 70 Grad Celsius mindestens zwei Stunden lang inkubieren. Die Masterwaffel aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Um den erstarrten Polydimethylsiloxan- oder PDMS-Block zu entfernen, entfernen Sie die Aluminiumfolie und ziehen Sie dann den PDMS-Block vorsichtig vom Rand des Wafers ab.

Nehmen Sie ein transparentes Glasdeckglas, gießen Sie ca. 0,5 Milliliter PDMS auf die Mitte des Objektträgers und verteilen Sie es durch leichtes Kippen des Objektträgers auf dem Deckglas, um eine vollständige Abdeckung des Objektträgers mit dem PDMS zu gewährleisten. Montieren Sie den Objektträger auf dem Spin Coater. Stellen Sie sicher, dass es mittig platziert ist, so dass die Mitte des Schlittens mit der Mitte des Druckschachts überlappt.

Drehen Sie dann den Objektträger 15 Sekunden lang mit 500 U/min in Schritten von 100 U/min und 30 Sekunden lang mit 1.000 U/min in Schritten von 500 U/min pro Sekunde. Legen Sie den PDM-beschichteten Glasobjektträger mit der beschichteten Seite nach oben auf eine erhöhte Plattform wie einen PDMS-Block in einer abgedeckten Petrischale. Bei 70 Grad Celsius zwei Stunden backen.

Legen Sie den PDMS-Block mit den gravierten Kanälen nach oben und den PDMs-beschichteten Glasobjektträger mit der beschichteten Seite nach oben in die Vakuumkammer des Plasmareinigers. Schalten Sie das Vakuum ein und setzen Sie den Inhalt 15 Sekunden lang einem Luftplasma mit einer Radiofrequenz von 12 Megahertz aus, um die Oberflächen zu aktivieren. Sauerstoffplasma ist in Form eines rosafarbenen Farbtons zu sehen.

Legen Sie den PDMS-beschichteten Objektträger unmittelbar nach der Plasmabehandlung mit der PDMS-Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Platzieren Sie den PDMS-Block vorsichtig so, dass das mikrofluidische Muster nun in Richtung des PDMS-beschichteten Glasobjektträgers zeigt, damit sie sich verbinden können. Backen Sie die geklebten Geräte zwei Stunden lang bei 70 Grad Celsius.

Geben Sie 200 Mikroliter 5%igen Polyvinylalkohol oder OVA-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und schließen Sie es an den mikrofluidischen Reservoirständer an. Führen Sie den Schlauch so ein, dass ein Ende in die PVA-Lösung eingetaucht ist und das andere Ende mit dem Einlass des äußeren wässrigen Kanals des mikrofluidischen Geräts verbunden ist. Erhöhen Sie den Druck der äußeren wässrigen Phase auf 100 Millibar, um die PVA-Lösung in die äußeren wässrigen Kanäle fließen zu lassen.

Erhöhen Sie den Druck der inneren wässrigen und lipidführenden organischen Phasen auf 120 Millibar, um den Rückfluss der PVA-Lösung in diesen Kanälen zu verhindern. Lassen Sie die PVA-Lösung auf diese Weise etwa fünf Minuten lang fließen, um eine vollständige Funktionalisierung des Austrittskanals zu gewährleisten. Erhöhen Sie den Druck in den lipidführenden organischen und inneren wässrigen Kanälen auf zwei bar, um die PVA-Lösung zu entfernen, und lösen Sie den Schlauch sofort vom äußeren wässrigen Einlass.

Verwenden Sie gleichzeitig einen Schlauch, der mit einem Unterdruckkanal verbunden ist, um überschüssiges PVA aus dem Austrittskanal zu entfernen. Backen Sie das Gerät 15 Minuten bei 120 Grad Celsius und lassen Sie es vor Gebrauch abkühlen. Das Gerät kann mindestens einen Monat lang unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.

Geben Sie die Lösungen in drei 1,5-Milliliter-Röhrchen und setzen Sie sie zusammen. Verbinden Sie sie mit dem PVA-behandelten Mikrofluidik-Chip und üben Sie einen Überdruck auf die drei Kanäle aus, etwa 100 Millibar auf die inneren wässrigen und lipidführenden organischen Kanäle und etwa 200 Millibar auf den äußeren wässrigen Kanal. Sobald alle drei Phasen an der Verbindungsstelle mitfließen, stellen Sie sicher, dass die doppelte Emulsionsproduktion beginnt, und passen Sie den Druck entsprechend seiner Qualität an.

Wenn die doppelten Emulsionströpfchen fließen, treten die Oktanol-Taschen immer stärker hervor und werden schließlich abgeklemmt, wodurch Liposomen gebildet werden. Ein Hellfeldbild der schnellen Erzeugung von Doppelemulsionströpfchen ist hier zu sehen. Der fluoreszierende Lipidkanal zeigt die Bildung einer Octanol-Alltasche durch partielle Entnetzung.

Der innere wässrige Kanal zeigt die Verkapselung von gelb fluoreszierendem Protein. Die Entnetzung der Oktanoltasche im Austrittskanal, die ein Liposom bildet, ist in dieser Abbildung dargestellt. Dieses Bild zeigt das Schema des pH-abhängigen Übergangs der homogenen Lösung von Polylysin und ATP, die im Liposom verkapselt sind, zu phasengetrennten Polylysin-ATP-Koazervaten.

Das anfängliche saure Milieu im Liposom macht die molekulare Ladung von ATP neutral und hemmt die Koazervation. Wenn sich der pH-Wert in den Liposomen mit dem von außen aufgebrachten pH-Anstieg ausgleicht, erhält ATP eine negative Ladung, was eine Koazervation auslöst. Die räumliche Verteilung von Polylysin und der Membran sowie die Zeitrafferbilder der Bildung von Polylysin-ATP-Koazervaten innerhalb der Liposomen sind in dieser Abbildung dargestellt.

Die äußerliche Abgabe eines basischen Puffers erhöht den pH-Wert in den Liposomen im Laufe von Minuten und leitet die Koazervation ein. T gleich null Minuten bezieht sich auf die Zeit kurz vor dem Auftreten des ersten Koazervationsereignisses. Bei der Demonstration des Verfahrens ist es wichtig, den Kanaldruck geduldig einzustellen, um eine gleichmäßige doppelte Emulsionsproduktion zu erzeugen.

OLA und seine Variationen wurden in verschiedenen Studien eingesetzt, z. B. zum Wachstum und zur Teilung von Liposomen, zum Verständnis der Dynamik biomolekularer Kondensate, zur zellfreien Expression von Proteinen sowie zur Verkapselung von Bakterien. Wir glauben also, dass OLA eine vielseitige Plattform für die synthetische Biologie ist.