Name: Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Erfahren Sie die halbautomatische phänotypische Analyse von 3D-Sphäroidzellkulturen mittels LC-MS-Proteomik im Bioreaktor. Diese Methode ermöglicht die hochdurchsatzfähige Charakterisierung von HepG2/C3A- und THLE-3-Zellsphäroiden für biomedizinische Forschung.

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Das Sidoli-Labor bedankt sich bei der Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck und dem NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

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Helle Sedighi Frandsen ist als wissenschaftliche Mitarbeiterin bei CelVivo ApS, dem Hersteller des ClinoStar-Systems, beschäftigt. Karoline Mikkelsen ist eine industrielle Doktorandin, die bei CelVivo ApS beschäftigt ist und ihre Doktorarbeit an der SDU in Odense, Dänemark, durchführt. Alle anderen Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Das Verständnis der Biologie hinter dreidimensionalen (3D) zellulären Strukturen ist äußerst wichtig für ein umfassenderes Wissen über ihre Funktionalitäten. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung von 3D-Modellen für die Untersuchung komplexer Biologie und die Durchführung von Toxizitätsscreenings. Bei der Kultivierung von Zellen in 3D müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, einschließlich der phänotypischen Bewertung des Modellsystems. Ein Phänotyp ist definiert als eine Gruppe von beobachtbaren Merkmalen eines bestimmten Organismus, wie z. B. Morphologie, Verhalten, physiologische und biochemische Eigenschaften20.
In diesem Protokoll zeigen wir, wie Proteomik-Experimente mit wenigen Sphäroiden durchgeführt und zur Überwachung des typischen Leberphänotyps verwendet werden können. Die Massenspektrometrie hat sich zu einer weit verbreiteten Methode zur 3D-Zellcharakterisierung entwickelt, die die Untersuchung einer Vielzahl biologischer Fragestellungen ermöglicht 12,16,21,22. Für eine umfassende Proteomanalyse empfiehlt es sich, mindestens 20 μg Protein-Ausgangsmaterial zu verwenden, von dem 1 μg in das Massenspektrometer injiziert wird. Es ist wichtig zu erwähnen, dass das Hinzufügen von weniger Proben zu einem Verlust der Empfindlichkeit führen kann, und dass das Hinzufügen von mehr Probe die Qualität der Chromatographie allmählich verschlechtern und schließlich zu einer Verstopfung der Säule führen würde. In dieser Studie konnten wir zeigen, dass die HepG2/C3A- und THLE-3-Sphäroide mit wichtigen Proteinen aus der Glykolyse und dem TCA-Zyklus angereichert sind, die spezifische Leberwege sind und für die Aufrechterhaltung des Blutzuckerspiegels und für die Energieproduktion entscheidend sind23,24. Tatsächlich liefert die massenspektrometrische Analyse nicht nur Informationen auf Proteinebene, sondern ermöglicht auch die Untersuchung von posttranslationalen Proteinmodifikationen, wie unsere Gruppe16 bereits gezeigt hat.
Ein weiterer Aspekt, der bei 3D-Phänotypstudien zu berücksichtigen ist, ist die Anzahl und Größe der Sphäroide. Neben der Reproduzierbarkeit von Experimenten ist das Zählen der Anzahl der Sphäroide und die Bestimmung ihrer Größe unerlässlich, um zu bestimmen, wann die Kultur in mehrere Bioreaktoren aufgeteilt werden muss, da die Anzahl der 3D-Strukturen innerhalb eines Gefäßes die Größe und die Stoffwechselaktivität der Sphäroide beeinflussen kann. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass die Anzahl und Größe der Sphäroide von der Zelllinie, der Startanzahl der Zellen, dem Teilungsprozess und dem Zeitpunkt der Entnahme abhängen. Details zur HepG2/C3A-Sphäroidkultur, wie z. B. die Anzahl der Zellen pro Sphäroide, der Proteingehalt und die Größe in Abhängigkeit vom Alter, wurden von Fey, Korzeniowska und Wrzesinski25 bereitgestellt. Für eine genaue und erfolgreiche Analyse mit der hier beschriebenen halbautomatischen Methode ist der kritischste Schritt ein gutes Sphäroidebild. Der Einfachheit halber kann das Bild mit einem Telefon oder Tablet aufgenommen werden, aber die Auflösung sollte so hoch wie möglich gehalten werden. Da Bilder schnell aufgenommen werden können, ermöglichen sie groß angelegte Screening-Experimente, um bestimmte phänotypische Merkmale zu visualisieren oder das Ansprechen auf eine medikamentöse Behandlung zu untersuchen. Aufgrund der steigenden Anzahl von zellbasierten Assays wurden daher in den letzten 10 Jahren eine Reihe von Open-Source-Software für die Bildanalyse entwickelt26. In diesem Protokoll beschreiben wir ein halbautomatisches System, das die Software FIJI18 verwendet, um die Größe von Sphäroiden zu zählen und zu messen. Wir haben Skripte (einfache Programmierbefehle) vorgestellt, um eine Abfolge von algorithmischen Operationen zu definieren, die auf eine Bildsammlung angewendet werden können, was die Analyse zu einem einfachen und schnellen Prozess macht. Je nach Charakteristik des Sphäroids sollte jedoch eine manuelle Messung durchgeführt werden. Wenn zum Beispiel die Sphäroide zu durchscheinend sind, ist die FIJI-Schrift ungenau. Eines der wichtigsten Kriterien für das Funktionieren dieser Methode ist übrigens die Kompaktheit der Sphäroide. Diese Eigenschaft trägt zu einem verstärkten Farbkontrast zwischen den Sphäroiden und dem Hintergrund bei, der für die Genauigkeit der Methode erforderlich ist.
Zusammenfassend wurde neben der Vorstellung einer Methodik zur Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide auch ein halbautomatisches System beschrieben, das mit phänotypischer Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik gekoppelt ist. Wir gehen davon aus, dass diese Toolbox für die Analyse von 3D-Zellen mit vollautomatischer Bildanalysesoftware und Massenspektrometern der nächsten Generation robuster wird.

In-vitro-Zellkulturen haben sich als notwendig und von unschätzbarem Wert erwiesen, um grundlegendes Wissen in der Biologie zu erlangen. Ein Großteil des wissenschaftlichen Verständnisses in der Biologie und insbesondere in der Krebsforschung stammt aus dem 2D-Kultursystem, bei dem Zellen in einer Monoschicht wachsen. Obwohl die 2D-Kultur bisher das dominierende Zellkultursystem war, hat sie viele Nachteile, die möglicherweise weitere biologische Fortschritte ersticken können. Zum Beispiel fehlen 2D-Kulturen Zell-Zell-Interaktionen, die für die Zellsignalübertragung und -proliferation wichtig sind1. Bisher hat sich gezeigt, dass 3D-Kultursysteme die Differenzierung, das Ansprechen auf Medikamente, die Tumorinvasion und die Biologie besser modellierenkönnen 2,3,4,5. Die 3D-Modellierung von bösartigen Krebserkrankungen ist aufgrund der zunehmenden Alterung der Bevölkerung und der Krebssterblichkeit besonders wichtig. Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) ist weltweit eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen und hat häufig eine miserable Prognose6. Es ist bekannt, dass HCC eine niedrige Heilungsrate, ein schlechtes Ansprechen auf Arzneimittel und eine hohe Wiederholungsrate aufweist 6,7,8. Es wurden mehrere 3D-Modelle für normale Leber und HCC entwickelt, die die Physiologie von in vivo normalem und malignem Lebergewebe nachahmen 9,10.
Zu den aktuellen 3D-Systemen gehören Flüssigkeitsüberlagerungen, Bioreaktoren, Hydrogele, Gerüste und 3D-gedruckte Strukturen. Sphäroide, die in Bioreaktoren erzeugt werden, bieten insbesondere einzigartige Vorteile, da sie die Tumorverteilung der Nährstoffexposition, den Gasaustausch und die Zellproliferation/-ruhe nachahmen11. Bioreaktoren eignen sich aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, großen Skalierbarkeit, Nährstoffdiffusion und Zugänglichkeit besonders für Krebsmodelle11. Darüber hinaus können Bioreaktoren Experimente mit hohem Durchsatz, eine höhere Reproduzierbarkeit und weniger menschliche Fehler ermöglichen. Der in dieser Studie verwendete Bioreaktor ist einzigartig, da er ein System mit reduzierter Schwerkraft simuliert, das störende Scherkräfte, die in typischen Bioreaktoren angewendet werden, minimiert und eine bessere Reproduzierbarkeit ermöglicht12. Die omnidirektionale Schwerkraft und die Verringerung der Scherkräfte ermöglichen es den Zellen, sich auf physiologischere Weise zu entwickeln. HepG2/C3A-Zellen, die mit dieser Methode gezüchtet wurden, entwickeln kugelförmige Organellen, die in vivo ATP-, Adenylatkinase-, Harnstoff- und Cholesterinspiegel produzieren13,14. Darüber hinaus sind die medikamentösen Behandlungen in diesem 3D-System im Vergleich zu 2D-Kulturen fortschrittlicher und automatisierter. In 2D-Kulturen müssen medikamentöse Behandlungen oft einen kurzen Zeitverlauf haben, da sie trypsinisieren und die Zellgesundheit erhalten müssen. In unserem Fall können wir jedoch langfristige medikamentöse Behandlungen von Sphäroiden durchführen, ohne die Struktur und Physiologie der Zellen stören zu müssen. Daher ist ein Wechsel von 2D- zu 3D-Kulturen notwendig, um biologische Phänomene in vivo besser zu modellieren und die wissenschaftliche Entwicklung voranzutreiben.
In dieser Arbeit wird eine Methodik zur Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide vorgestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2) und ein halbautomatisches System zur phänotypischen Charakterisierung von 3D-Strukturen gezeigt (Abbildung 3). Auf der Bildebene liefern wir Informationen zum Zählen und Messen der Fläche von Sphäroiden (Abbildung 3). Mit Hilfe von massenspektrometrischen Methoden zeigen wir, wie die Proteomik zur Beurteilung spezifischer biologischer Funktionen eingesetzt werden kann (Abbildung 4). Durch das Sammeln und Analysieren dieser Daten hoffen wir, das Verständnis der Biologie hinter 3D-Zellkultursystemen zu verbessern.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Spritze Fisher Scientific</td> 1481754 <td>Luer-Lock-Spitze, graduiert auf 12 mL</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro; L Pipettenspitzen mit breiter Öffnung</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Pipettenspitzen mit breiter Öffnung</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Orochem-Filterplatte</td><td>Orochem&nbsp;</td><td>OF1100</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit Sockel</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Vakuumverteiler</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bronchialepitheliales Zellwachstumsmedium (BEGM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in Zellkulturqualität</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Bioreaktor für 3D-Zellkulturen</td></tr><tr><td>ClinoStar Inkubator</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>CO2 Inkubator für 3D-Zellkulturen</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Elplasia 24-Well-Platte mit ultraniedrigem Aufsatz und rundem Boden mit Mikrowells</td><td>Corning</td><td>4441</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Thermo</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Fisher</td><td>Scientific MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Corning</td><td>354052</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>Thermo</td><td>51033557</td><td>CO2 Inkubator für 2D-Zellkulturen</td></tr><tr><td>HPLC-Qualität Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Qualität Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in HPLC-Qualität</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB Resin 30 &micro; m</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Massenspektrometer</td><td>Thermo</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Hochauflösendes Massenspektrometer</td></tr><tr><td>PAULA Mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>PerkinElmer Victor X2 Multilabel Mikroplatten-Reader</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Papier</td><td>Hydrion</td><td>93</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoetanolamin</td><td>Sigma</td><td>P0503</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>A260-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenpistole</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur-Harz</td><td>MSWIL</td><td>R13. AQ.003</td><td>120 &Aring; Porengröße, C18-AQ-Phase, 3 &mu; M Bead Größe</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>Modifiziertes Trypsin in Sequenzierqualität</td><td>Promega</td><td>V511A</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Vakuumkonzentrator (96-Well-Platten)</td><td>Thermo</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Sterilhaube</td><td>Thermo</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten</td><td>Fisher</td><td>Scientific 1367549</td><td></td></tr><tr><td>S-Falle</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-80</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadel (18 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14817100</td><td>3" Länge, 0,05" Durchmesser</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>Thermo</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>FSGPD10</tr></tbody></table>

halbautomatische phänotypische analyse funktioneller 3d-sphäroidzellkulturen

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

Wir stellen ein Protokoll vor, das die Eigenschaften und Vorteile der Verwendung eines eigenständigen Klinostistinkubators für die Züchtung, Behandlung und Überwachung von 3D-Zellkulturen beschreibt. Der Klinostat ahmt eine Umgebung nach, in der sich Zellen als hochreproduzierbare Sphäroide mit geringen Scherkräften und aktiver Nährstoffdiffusion zusammensetzen können. Wir zeigen, dass sowohl Krebs- als auch Nicht-Krebs-Hepatozyten (HepG2/C3A- und THLE-3-Zelllinien) 3 Wochen Wachstum benötigen, bevor sie Funktionalitäten erreichen, die mit denen von Leberzellen vergleichbar sind. Dieses Protokoll unterstreicht die Bequemlichkeit der Verwendung von Inkubatoren für 3D-Zellen mit Kameras, die das Zellwachstum überwachen, da Schnappschüsse gemacht werden können, um Sphäroide nach der Behandlung zu zählen und zu messen. Wir beschreiben den Vergleich von THLE-3- und HepG2/C3A-Zelllinien und zeigen, wie nicht-krebsartige Zelllinien gezüchtet und immortalisierte Krebszellen gezüchtet werden können. Wir demonstrieren und veranschaulichen, wie Proteomik-Experimente aus wenigen Sphäroiden durchgeführt werden können, die ohne Störung der Zellsignalisierung gesammelt werden können, d.h. keine Trypsinisierung erforderlich ist. Wir zeigen, dass die Proteomik-Analyse verwendet werden kann, um den typischen Leberphänotyp des Atmungskettenstoffwechsels und die Produktion von Proteinen zu überwachen, die an der Metallentgiftung beteiligt sind, und beschreiben ein halbautomatisches System zur Zählung und Messung der Fläche des Sphäroides. Insgesamt stellt das Protokoll eine Toolbox dar, die eine phänotypische Charakterisierung mittels Bildaufnahme und eine Proteomik-Pipeline zum Experimentieren mit 3D-Zellkulturmodellen umfasst.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Eigenschaften eines innovativen stressfreien 3D-Zellinkubators, eines Systems, das speziell für die Kultivierung von 3D-Sphäroiden entwickelt wurde (Abbildung 2). Wir haben das Protokoll für die 3D-Kultivierung von THLE-3- und HepG2/C3A-Zelllinien optimiert. Das hier beschriebene Protokoll ist einfach anzuwenden und ermöglicht die Reproduzierbarkeit und kostengünstige Kultivierung von &gt; 100 Sphäroiden pro Bioreaktor. Im Bioreaktor werden die Sphäroide ähnlich behandelt wie Zellen, die in einer 2D-Kultur gehalten werden. Optimale Wachstumsbedingungen werden erreicht, indem das Medium zwei- bis dreimal pro Woche ausgetauscht wird (Abbildung 2B) und die Rotationsgeschwindigkeit entsprechend dem Wachstum und der Größe der Sphäroide angepasst wird (Abbildung 2C). Dieses System, in dem 3D-Sphäroide in rotierenden Bioreaktoren kultiviert werden (Abbildung 2E,F), bietet eine optimale Wachstumsumgebung für 3D-Strukturen, indem das Sphäroid einer gleichen und sehr geringen Scherkraft ausgesetzt wird.
Wir haben bereits gezeigt, wie Sphäroide für die Analyse der Chromatinmodifikation16 verwendet werden können. Hier zeigen wir im Detail, wie man Lebersphäroide erhält und wie Proteomik-Experimente zur Analyse des gesamten Proteoms durchgeführt werden können (Abbildung 1). Kurz gesagt, das Protokoll wurde durch die Verwendung von THLE-3- oder HepG2/C3A-Flachzellen initiiert, bis die Kultur eine Konfluenz von 80 % erreichte. Um Zellen als Sphäroide zu kultivieren, wurden etwa 2.000 Zellen in eine Platte mit extrem niedriger Anhaftung plattiert, die Mikrowellen enthielt, damit sie sich selbst aggregieren konnten, und dann wurden die gebildeten Sphäroide in einen Bioreaktor übertragen (Abbildung 1A). Obwohl sie nach 3 Wochen in der Kultur funktionell aktiv sind, wie zuvorgezeigt wurde 17, zeigen wir Ergebnisse von Sphäroide, die nach 36 Tagen in Kultur für dieses Protokoll gesammelt wurden. Nach der Entnahme wurden die Sphäroide heruntergeschleudert und sowohl das Pellet als auch der Überstand für die Analyse gelagert. Die Zellviabilität wurde anhand des Überstandes für die Quantifizierung der von geschädigten Zellen freigesetzten Adenylatkinase bewertet, wie zuvor beschrieben17. Zelluläre Proteine wurden aus dem Zellpellet extrahiert und das gesamte Proteom mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert (Abbildung 1B).
Dieses Protokoll demonstriert auch ein halbautomatisches Verfahren zur Zählung von Sphäroiden (Abbildung 3A) unter Verwendung des öffentlichen Bildverarbeitungsprogramms FIJI (Fiji Is Just ImageJ)18. Für die Analyse sollte ein qualitativ hochwertiges Bild des Sphäroids aufgenommen werden, und einige Parameter sollten berücksichtigt werden, wie in Abschnitt 5 erwähnt. Nachdem das Bild für die Analyse vorbereitet wurde, wird ein Makroskript (Ergänzungsdatei 1) zum Zählen der Sphäroide verwendet. Das Makro funktioniert, indem es zunächst einen Ordner mit dem Namen FIJI Spheroids counting in dem Ordner erstellt, in dem sich die Sphäroidbilder befinden. In diesem Ordner werden alle Informationen aus der Analyse gespeichert. Dazu gehört ein Bild der gezählten Sphäroide, mit einer ID-Nummer auf jedem Sphäroid. Es enthält auch eine Excel-Datei namens Sphäroidzählung. Diese Datei enthält die Pixelfläche und die ID-Nummer für jedes Sphäroid, das gezählt wurde. Die Daten, die einem analysierten Bild entsprechen, werden auf jeder Registerkarte der Datei angezeigt. Die Registerkarte ist nach dem Namen des analysierten Bildes beschriftet. Da die Größe der Sphäroide durch viele Faktoren beeinträchtigt werden kann, einschließlich der Anzahl der Strukturen innerhalb eines Gefäßes und der medikamentösen Behandlung, ist es auch wichtig, ihre Oberfläche zu überwachen (Planimetrie). Das hier vorgestellte Makroskript (Ergänzungsdatei 2) arbeitet mit der Messung der schwarzen Bereiche, die den Sphäroiden im Bild entsprechen (Abbildung 3B). Die Ausgabe wird in einer Datei namens planimetry.xlsx gesammelt, die die gemessene Fläche, den Umfang und den Durchmesser jedes Sphäroids enthält. Es gibt auch ein Maß namens Feret, das zur Berechnung des Durchmessers verwendet wird. Feret ist der längstmögliche Durchmesser, während minFeret der kürzeste ist. Der Durchmesser ist der Durchschnitt dieser beiden. Im Ausgabeordner befindet sich neben der planimetrie.xlsx Datei auch ein Bild der gemessenen Sphäroide.
Bevor mit der Proteomanalyse begonnen wurde, wurde die Lebensfähigkeit der Sphäroide über die Kulturzeit bewertet. Die AK-Spiegel steigen bis zum 17. Tag an und erreichen etwa 7 % des Zelltods, und dann sinkt der Tod auf Werte unter 5 % (Abbildung 4A), was mit der zuvor veröffentlichten Arbeit17 übereinstimmt. Dieses Protokoll zeigt auch die vollständige Proteomanalyse zur Überwachung des Zellphänotyps. Zunächst wurden die Proteome von THLE-3 und HepG2/C3A Flachzellen und Sphäroiden verglichen. Durch die Analyse der ersten Hauptkomponente (PC1) wird deutlich, dass es eine strikte Trennung von Sphäroidproben und flachen Zellkulturen gibt, und es scheint, dass die Korrelation des Zelltyps (THLE-3 und HepG2/C3A) nicht relevant ist (Abbildung 4B). Obwohl THLE-3- und HepG2/C3A-Sphäroide nicht zusammenwachsen, haben sie ähnliche Profile, die mit der Leberfunktion übereinstimmen. Wir zeigen in diesem Protokoll das Beispiel von Metallothioneinen, die eine Rolle bei der Metallentgiftung durch die Leber spielen. In der Proteomik-Analyse identifizierten wir 2 Isoformen, die in Sphäroiden im Vergleich zu flachen Zellen (MT1E und MT1X) überexprimiert sind (Abbildung 4C). Wir zeigen auch die Gene Ontology (GO) Anreicherung beider Zelllinien, die als Sphäroide gezüchtet wurden. Der Kohlenhydratstoffwechsel, der den Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus), die Elektronentransportkette (Zellatmung) und den Pyruvatstoffwechsel umfasst, ist ein häufiger Begriff und wird sowohl in HepG2/C3A- als auch in THLE-3-Sphäroiden angereichert (Abbildung 4D,E). Zelluläre Entgiftung, Fettsäure- und Cholesterinstoffwechsel sind weitere Funktionen, die in beiden Sphäroiden angereichert sind. Zusammen sind diese Funktionen bekanntermaßen entscheidend für die Leberfunktion.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf für Sphäroide, Kultur und Probenvorbereitung . (A) Experimenteller Ansatz für 3D-Zellkulturen. Flachzellkulturen bei gewünschter Konfluenz wurden trypsinisiert und auf einer 24-Well-Platte mit extrem niedriger Anhaftung ausgesät, die Mikrowells enthielt, in denen sich die Zellen selbst zu Sphäroiden zusammensetzen. Nach 24 h wurden die Sphäroide in einen Bioreaktor überführt und kultiviert, bis sie für die Analyse bereit sind. (B) Nach der Entnahme wurden die Sphäroide pelletiert, und sowohl das Pellet als auch der Kulturüberstand wurden bis zur Verarbeitung gelagert. Histone16und Nicht-Histonproteine wurden extrahiert, zu Peptiden verdaut und mittels hochauflösender Massenspektrometrie analysiert. Die aus der Massenspektrometrie gewonnenen Rohdateien wurden mit der menschlichen Datenbank abgeglichen und die Daten wurden weiterverarbeitet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig02v2.jpg"> Abbildung 2: 3D-Zellkultursystem . (A) Teile des Bioreaktors. Der Bioreaktor besteht aus einer Gasaustausch- und Befeuchtungskammer mit Wasserperlen und einer zu öffnenden Zellkammer mit zwei Stopfen für den Medienaustausch und die Sphäroidesammlung. (B) Austausch von Bioreaktormedien. Der Bioreaktor wird mit einer Spritze mit einer Nadel mit 10 ml Nährmedium gefüllt. (C) Die Systemsteuerungs-App. Die Drehzahl, der CO2-Gehalt, die Temperatur, das Alarmprotokoll und andere Funktionen können über das Steuergerät gesteuert werden. (D) Platzierung des Bioreaktors im 3D-Inkubator. Jeder Bioreaktor verfügt über einen zugehörigen Motor, der den Bioreaktor langsam drehen kann. (E) Bioreaktor in Bewegung mit der Drehzahl (U/min), die von einer (C)-Tablette gesteuert wird. Die Drehzahl (U/min) wird entsprechend der Größe der Sphäroide eingestellt. (F) Bioreaktoren im 3D-Inkubator. Der 3D-Inkubator bietet Platz für bis zu 6 einzeln gesteuerte Bioreaktoren. Foto mit freundlicher Genehmigung von Jason Torres Photography. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig02largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig03.jpg"> Abbildung 3: Phänotypische Charakterisierung von Sphäroiden mittels Bildaufnahme . (A) Halbautomatische Sphäroidzählung. Nach der Aufnahme von Schnappschüssen der Sphäroide im Bioreaktor wird das Bild für die Analyse auf den Fidschi-Inseln vorbereitet. Jedes Sphäroid wird gezählt, und für jedes von ihnen wird eine ID-Nummer angegeben. Ein Makro wird verwendet, und die Ergebnisse werden mit der ID für das gezählte Sphäroid, der Beschriftung (Name des analysierten Bildes) und dem Bereich (die Anzahl der im Sphäroid gezählten Pixel) angezeigt. (B) Planimetrische Bestimmung der Sphäroidfläche. Mit Hilfe eines Makros werden die Fläche, der Umfang und der Durchmesser eines bestimmten Sphäroids bestimmt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65086/65086fig04.jpg"> Abbildung 4: Proteomanalyse von Lebersphäroiden . (A) Die Viabilität der Sphäroide wurde auf der Grundlage der Freisetzung der Adenylatkinase (AK) auf dem Kulturüberstand berechnet. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte für doppelte Datenpunkte ± SD. (B) Es wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, um das Proteom von THLE-3 und HepG2/C3A Flachzellen und Sphäroiden zu vergleichen. (C) Relative Häufigkeit von Metallothioneinen, bei denen es sich um Proteine handelt, die von der menschlichen Leber exprimiert werden. Die Daten werden als Mittelwerte ± REM dargestellt. (D) Funktionell gruppierte Netzwerke zeigen GO-Anreicherung für HepG2/C3A-Sphäroide und (E) THLE-3-Sphäroide, wobei nur die Markierung des höchstwertigen Terms pro Gruppe angezeigt wird. Das Netzwerk wurde mit ClueGo19 aufgebaut. Die Knotengröße stellt die Bedeutung des Begriffs Anreicherung dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/65086fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzungsdatei 1: Makroskript für die Sphäroidzählung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzungsdatei 2: Makro für die planimetrische Bestimmung von Sphäroide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65086/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Dieses Protokoll zeigt, wie hochreproduzierbare Sphäroide gezüchtet werden können und wie proteomische Experimente durchgeführt werden können, um die biologische Funktion von 3D-Strukturen zu charakterisieren. Unsere 3D-Kultur kann gleichzeitig Hunderte von biologischen Replikaten im selben Bioreaktor herstellen, und der LC-MS-Ansatz kann die Häufigkeit von Tausenden von Proteinen in einem einzigen Experiment messen. Das Verfahren wird von Stephanie Stransky, einer Postdoktorandin aus dem Labor, demonstriert.Nehmen Sie zunächst die Suspension von HepG2/C3A- und THLE-3-Zellen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen und verdünnen Sie die Zellsuspension in kompletten Wachstumsmedien, um 1 Million Zellen in einem maximalen Volumen von 1,5 Millilitern zu erhalten. Waschen Sie die Vertiefungen einer runden 24-Well-Bodenplatte mit extrem niedrigem Aufsatz mit 0,5 Millilitern Wachstumsmedium und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 3.000 g.Die Zellsuspension auf die Platte geben und drei Minuten bei 120 g zentrifugieren. Inkubieren Sie dann die Platte, um die Bildung von Sphäroiden zu initiieren. Als nächstes wird der Bioreaktor 24 Stunden vor dem Transfer der Sphäroide ins Gleichgewicht gebracht, indem die Feuchtigkeitskammer mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer langen Nadel mit 25 Millilitern sterilem Wasser und die Zellkammer mit neun Millilitern Wachstumsmedium gefüllt wird.Anschließend wird der Bioreaktor für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einen 3D-Inkubator gestellt. Pipettieren Sie die Sphäroide vorsichtig mit Spitzen mit einer Breite von einem Milliliter auf und ab, um sie von der Platte mit extrem niedrigem Aufsatz zu lösen, und übertragen Sie sie in eine Gewebekulturschale. Um verbleibende Sphäroide aufzufangen, waschen Sie die Platte mit 0,5 Millilitern vorgewärmtem Nährmedium und geben Sie sie in die Kulturschale.Beurteilen Sie mit einem Lichtmikroskop die Größe, Kompaktheit und Rundheit der Sphäroide, um diejenigen auszuwählen, die angemessen geformt sind. Das ausgewählte Sphäroid wird in den mit fünf Millilitern frischem Wachstumsmedium gefüllten Äquilibrierbioreaktor überführt. Füllen Sie dann den gesamten Bioreaktor mit frischem Nährmedium.Positionieren Sie den Bioreaktor im 3D-Inkubator und stellen Sie die Drehzahl über die Steuereinheit ein. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage 10 Milliliter altes Nährmedium durch 10 Milliliter frisches Medium. Ändern Sie die Rotationsgeschwindigkeit jedes Mal, nachdem Sie das Medium ausgetauscht haben.Die Sphäroide werden 15 Tage lang kultiviert und auf zwei frische Bioreaktoren verteilt. Öffnen Sie die auf dem Tablet installierte 3D-App, wählen Sie den Bioreaktor aus und nehmen Sie das Bild auf. Alternativ können Sie einen schwarzen Hintergrund hinter dem Bioreaktor platzieren und sicherstellen, dass kein Licht auf der Zellkammer reflektiert wird.Nehmen Sie das Bild so nah wie möglich am Bioreaktor auf. Sammeln Sie dann Sphäroide, indem Sie fünf Milliliter Medien aus dem Bioreaktor entfernen, indem Sie eine Spritze verwenden, die an einer langen Nadel durch den oberen Anschluss befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Sphäroide in die untere Mitte des Bioreaktors absinken.Öffnen Sie nun den vorderen Anschluss und sammeln Sie die Sphäroide mit einer Spitze mit einer Breite von einem Milliliter. Füllen Sie diese Sphäroide in Mikrozentrifugenröhrchen um, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 g und entsorgen Sie das Medium. Waschen Sie das Sphäroid, indem Sie 200 Mikroliter HBSS hinzufügen, um das FBS zu entfernen.Danach führen Sie eine Zentrifugation bei 500 g für fünf Minuten durch und entsorgen den Überstand. Tauchen Sie das Kugelpellet dann schnell in flüssigen Stickstoff, um es einzufrieren, und lagern Sie dieses gefrorene Pellet bis zur Weiterverarbeitung bei minus 80 Grad Celsius. Um die Zellen zu lysieren, nehmen Sie ein Röhrchen mit gesammelten Sphäroiden und resuspendieren Sie sie in 25 Mikrolitern 5%SDS.Homogenisieren Sie das Pellet, indem Sie es auf und ab pipettieren. Anschließend werden ein Mikrogramm Proben und 10 Mikroliter 0,1%ige Trichloressigsäure aufgelöst. Nach der Extraktion des Proteins und der Reinigung der Proben richten Sie die MS-Akquisitionsmethode ein, um die MS/MS-Spektren aus den identifizierten Peptidsignalen zu erzeugen.Übertragen Sie dann die Platte in den Nanoliter-Flüssigkeitschromatographie-Autosampler. Stellen Sie den vollständigen MS-Scan auf 300 zu 1, 100 Masse-zu-Ladungs-Verhältnis im Orbitrap ein. Stellen Sie die Auflösung auf 120000 ein und stellen Sie das Ziel für die automatische Verstärkungsregelung auf 125 ein.Stellen Sie dann MS/MS im Orbitrap mit einem sequentiellen Isolationsfenster von 50 Masse-zu-Ladungs-Verhältnis ein. Richten Sie das Ziel für die automatische Verstärkungsregelung auf 400 aus und stellen Sie eine höhere Kollisionsdissoziationsenergie von 30 ein. Laut der Viabilitätsanalyse von Sphäroiden steigt der Adenylatkinasespiegel bis zum 17. Tag an, was zu etwa 7 % des Zelltods führt.Danach sinkt die Sterberate auf unter 5%Darüber hinaus zeigt eine Analyse der ersten Hauptkomponente eine klare Unterscheidung zwischen Sphäroidproben und flachen Zellkulturen. Die proteomische Analyse zeigte, dass THLE-3- und HepG2/C3A-Sphäroide ähnliche Profile aufweisen, die die Leberfunktion widerspiegeln. Darüber hinaus zeigten die Sphäroide eine Überexpression von zwei Isoformen von Metallothioneinen im Vergleich zu flachen Zellen.Funktionell gruppierte Netzwerke zeigten eine genontologische Anreicherung für den Kohlenhydratstoffwechselprozess in HepG2/C3A- und THLE-3-Sphären. Um ein Verschütten von Wachstumsmedien zu vermeiden, öffnen oder schließen Sie den vorderen Anschluss nicht, wenn die Zellkammer vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist. Die in diesem Protokoll beschriebene Probenvorbereitung und -analyse kann verwendet werden, um das Proteom von Zellkulturen mit 2D- und 3D-Methoden sowie von Gewebeproben zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Hier wird ein Verfahren zur Herstellung von 3-dimensionalen (3D) Sphäroid Kokultur Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten, gefolgt von Messung von Stoffwechselfunktionen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer beschrieben.

Vorbereitung und metabolische Assay von 3-dimensionalen Sphäroid Ko-Kulturen von Pankreaskarzinom-Zellen und Fibroblasten

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von vom Patienten abgeleiteten Sphäroiden und nachgelagerte Analysen, einschließlich Quantifizierung der Proliferation, Zytotoxizitätstests, Durchflusszytometrie, Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung, um Potenzial der Kandidaten als antineoplastische Therapeutika. Dieses Protokoll unterstützt Präzisionsmedizin mit der Identifizierung spezifischer Medikamente für jeden Patienten und das Krankheitsstadium.

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

Wir präsentieren ein motorbetriebenes zentrifugales mikrofluidisches Gerät, das Zellsphäride kultivieren kann. Mit diesem Gerät können Sphäroide von einzelnen oder mehreren Zelltypen leicht unter hohen Schwerkraftbedingungen kokultiviert werden.

Lab-on-a-CD-Plattform zur Generierung mehrzelliger dreidimensionaler Sphäriden

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Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

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