Name: Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Entdecken Sie eine bioorthogonale Bildgebungsmethode zur Visualisierung des Zellstoffwechsels mit subzellulärer Auflösung. Diese Technik kombiniert stimulierte Raman-Streuung mit Fluoreszenzmikroskopie.

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Wir danken Dr. Yajuan Li und Anthony Fung für ihre technische Unterstützung und dem Fraley-Labor für die Zelllinie. Wir bedanken uns für die Anschubfinanzierung von UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 und Hellman Fellow Award.

1. Medienaufbereitung
<ol><li>Bereiten Sie 10 ml Kontroll- und überschüssige AAAs in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 50 %D2Ovor.<ol><li>Für die Kontrollmedien werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) in einem konischen 15-ml-Röhrchen gemessen und gemischt. Das DMEM-Pulver enthält alle Aminosäuren in Standardkonzentrationen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Fügen Sie 4,7 mlD2O, 0,5 ml fötales Kälberserum (5 % FBS) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) hinzu. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.</li>
		<li>Für das 15x Phe-Behandlungsmedium werden 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5 %) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) in einem konischen 15-ml-Röhrchen abgemessen und gemischt. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Überschüssiges Phe-Pulver in einer Konzentration von 924 mg/L in das Medium geben. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.</li>
		<li>Für das 15x Tryp Behandlungsmedium 10 mg DMEM-Pulver mit 4,7 ml ddH2O, 0,5 ml FBS (5 %) und 0,1 ml Penicillin/Streptomycin (1 %) in einem konischen 15-ml-Röhrchen abmessen und mischen. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Überschüssiges Tryp-Pulver in einer Konzentration von 224 mg/L in das Medium geben. Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist.</li>
		<li>Methionin und Threonin in einer Konzentration von 30,0 mg/ml bzw. 95,0 mg/ml werden zu allen konischen Röhrchen der vorherigen Schritte zugegeben. Wirbeln Sie das Rohr gründlich vor und drehen Sie es um. Natriumpyruvat muss den Nährmedien nicht zugesetzt werden.</li>
		<li>Filtern Sie die Kontroll- und Behandlungsmedien mit einem 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit 0,22 μm Polyethersulfon-Membranfiltern.</li>
		<li>Versiegeln Sie alle konischen Röhrchen mit Parafolie und lagern Sie sie bei 4 °C bis zu 3 Wochen. Bevor Sie die Zellen mit Medien behandeln, erwärmen Sie alle Medien auf 37 °C. HINWEIS: Die pulverförmigen und flüssigen Reagenzien sollten auf der Grundlage des Gesamtvolumens der Behandlungs- und Kontrollmedien gemessen und kombiniert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung der Zellprobe
<ol><li>Halten Sie Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa-Zellen) in einem Kulturkolben (d. h. T10, T25 usw.) unter Verwendung von Standard-DMEM, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) ergänzt wird.</li>
	<li>Subkultur der HeLa-Zellen in einem Split-Verhältnis von 1:10, bis die Zelllebensfähigkeit von 80 % oder höher erreicht ist.</li>
	<li>Sobald die Zellen eine Konfluenz von 80 % oder mehr erreicht haben, werden 2 x 10 5 Zellen pro Well auf eine 24-Well-Platte gesät, wobei DMEM mit0,5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt wird.<ol><li>Bereiten Sie vor der Zellaussaat eine 24-Well-Platte mit sterilisierten, lamininbeschichteten, runden Deckgläsern aus Poly-D-Lysin mit einem Durchmesser von 12 mm vor. Tauchen Sie die Deckgläser in 70%iges Ethanol und trocknen Sie sie vorsichtig mit fusselfreien Tüchern. Legen Sie die sauberen Deckgläser in die entsprechenden Vertiefungen der Platte.</li>
		<li>Sobald die Zellen in Schritt 2.2 eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, waschen Sie die Zellen einmal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Magnesium- und Kalziumionen.</li>
		<li>Man fügt 0,25 % Trypsin hinzu, um die adhärenten Zellen aus dem Kolben zu dissoziieren, und inkubiert bei 37 °C und 5 %CO2 für 3 min.</li>
		<li>Fügen Sie DMEM hinzu, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt ist, pipettieren Sie vorsichtig auf und ab und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 x g bei Raumtemperatur (RT) für 3 Minuten.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM, ergänzt mit 0,5 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin.</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, einem Lichtmikroskop und Trypanblau und säen Sie eine Dichte von 2 x 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Alternativ kann ein automatisierter Zellzähler verwendet werden, um die Zellen zu zählen.</li>
		<li>Die Zellen werden bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurückgelegt und die Platte vorsichtig geschüttelt, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.</li>
	</ol></li>
	<li>Ersetzen Sie nach 8 Stunden das alte Nährmedium durch 50 % D2O/überschüssiges Phe oder 50 %D2O/überschüssiges Tryp-Medium. Die Zellen werden 36 h lang bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurückgelegt.</li>
	<li>Nach 36 h fixieren Sie die Zellen auf Objektträgern.<ol><li>Bereiten Sie vor der Fixierung Objektträger mit Abstandshaltern mit einem Durchmesser von 9 mm vor und geben Sie 15 μl 1x PBS mit Kalzium- und Magnesiumionen anreichern.</li>
		<li>Spülen Sie die Zellen mit 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen.</li>
		<li>Geben Sie 0,5 ml 4%ige methanolfreie Paraformaldehyd-Lösung (PFA) hinzu und lassen Sie die Platte ca. 15 Minuten lang unter der Biosicherheitshaube.</li>
		<li>Saugen Sie die PFA-Lösung an und spülen Sie zweimal mit 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen.</li>
		<li>Geben Sie 1,5 ml 1x PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, in jede Vertiefung.</li>
		<li>Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus jeder Vertiefung zu ziehen. Invertieren Sie die zellhaltige Seite der Deckgläser und legen Sie sie auf die Abstandshalter für die Bildgebung, um das in Schritt 2.5.1 vorbereitete PBS zu kontaktieren. Stellen Sie sicher, dass die nicht zellhaltige Seite mit Luft in Berührung kommt.</li>
		<li>Versiegeln Sie die äußere Schicht des Deckglases mit transparentem Nagellack mit dem Abstandshalter.</li>
	</ol></li>
	<li>Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C, wenn Sie nicht bebildern.</li>
</ol>3. Spontane Raman-Spektroskopie-Messung (Abbildung 2)
<ol><li>Verwenden Sie ein konfokales Raman-Mikroskop, um spontane Raman-Spektren zu erhalten (Abbildung 2A).</li>
	<li>Schalten Sie den Laser ein, indem Sie den Schlüssel in die Position ON drehen.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf das LabSpec6-Softwaresymbol , um die Erfassungssoftware zu öffnen.</li>
	<li>Legen Sie die biologische Probe auf den Probenhalter direkt unter der Objektivlinse.</li>
	<li>Klicken Sie in der Software auf das Kamerasymbol , um die Videokamera einzuschalten.</li>
	<li>Passen Sie die Fokusebene an, um einen Interessenbereich mit dem 50-fach-Objektiv zu identifizieren. Bewegen Sie den Joystick, um die Hobelverschiebung des XY-Tisches zu steuern, und drehen Sie den Joystick, um die Schärfentiefe zu ändern.</li>
	<li>Nachdem Sie die Position für die Messung gewählt haben, wechseln Sie zum 100-fach-Objektiv mit 40 mW Anregungsleistung. Klicken Sie auf das rote Stopp-Symbol , um die Videokamera auszuschalten.</li>
	<li>Wählen Sie ein Gitter von 1800 Linien/mm und stellen Sie den Erfassungsbereich von 400 cm-1 bis 3.150 cm-1 ein.</li>
	<li>Stellen Sie die Erfassungszeit auf 90 s, die Akkumulation auf 3 und das Binning auf 4 ein, um das geringste Rauschen und das genaueste Spektrum zu erzielen. HINWEIS: Diese Bildgebungsparameter können für das Experiment optimiert werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf das Pfeilsymbol , um die Echtzeitanzeige einzuschalten.</li>
	<li>Stellen Sie die Raman-Verschiebung (cm-1) auf einen Wert Ihrer Wahl ein, um die Fokusebene fein abzustimmen. ANMERKUNG: In diesem Experiment wurde der Raman-Laser auf die Lipidtröpfchen fokussiert, die eine hohe Konzentration anCH2-Bindungen enthielten. Zu diesem Zweck wurde daher eine Raman-Verschiebung von 2.850 cm-1 gewählt, die den Streckmoden derCH2-Bindung entsprach.</li>
	<li>Stellen Sie die Fokusebene mit dem Joystick ein, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu optimieren.</li>
	<li>Nachdem Sie die Fokusebene ausgewählt haben, klicken Sie auf das rote Stopp-Symbol , um eine Echtzeitanzeige anzuzeigen.</li>
	<li>Wählen Sie das Kreissymbol aus, um die Spektrumerfassung zu starten.</li>
	<li>Sobald die Zellregion aufgenommen wurde, verwenden Sie dieselbe Fokusebene, um den Hintergrund mit PBS zu messen. Subtrahieren Sie das Hintergrundspektrum von jedem subzellulären Zielspektrum mit einer separaten Computersoftwareanwendung, z. B. Origin (Abbildung 1B).</li>
</ol>4. Bildgebende Experimente mit 2PEF und SRS
HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen der SRS-Laserausrichtung finden Sie in einem früheren Bericht28. Dieses Protokoll konzentriert sich auf den Betrieb eines multimodalen SRS- und 2PEF-Bildgebungssystems (Abbildung 2C, D).
<ol><li>Klicken Sie auf Start , um den Laser aufzuwärmen.</li>
	<li>Befolgen Sie die Reihenfolge, um die Hauptschalter des Steuergeräts und des Monitors einzuschalten: 1) Drücken Sie den Hauptschalter der Steuereinheit IX3-CBH auf Ein, 2) Drücken Sie den Hauptschalter des Touchpanel-Controllers auf Ein, 3) Drücken Sie den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote, das mit dem Hauptlaserkombinator FV31-SCOMB verbunden ist, auf Einund 4) Drücken Sie den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote, das mit dem Sub-Laser-Combiner FV31-SCOMB verbunden ist, auf Ein.</li>
	<li>Drücken Sie die Hauptschalter des Si-Fotodiodendetektors und des Lock-in-Verstärkers auf Ein.</li>
	<li>Stellen Sie den Stokes-Strahl auf 1.031 nm, die Pulsbreite auf 6 ps und die Wiederholrate auf 80 MHz ein.</li>
	<li>Gekoppelt mit dem Mikroskop stellen Sie das picoEmerald-System ein, das mit dem synchronisierten Pumpstrahl mit einer abstimmbaren Wellenlänge von 720-990 nm, einer Pulsbreite von 5-6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz geliefert wird. Die durchschnittliche Erregerleistung sowohl der Pumpe als auch der Stokes beträgt 450 mW. Optimieren Sie die Anregungsleistung, um Lichtschäden für die Probe zu minimieren.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Ölkondensator mit hoher numerischer Apertur (NA) (d. h. 1,4 NA), um die Stokes- und Pumpbalken zu sammeln, an denen die Probe montiert ist, indem einige Tropfen auf den Kondensator abgegeben werden.</li>
	<li>Montieren Sie die Probe auf das Öl und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger, an dem die Probe befestigt ist. Dies gilt für das Wasserimmersionsobjektiv.</li>
	<li>Stellen Sie den Lock-in-Verstärker auf 20 MHz ein. Bearbeiten Sie das Bild nun mit dem Super-Resolution-Softwaremodul.</li>
	<li>Wählen Sie 512 Pixel x 512 Pixel und 80 μs/Pixel für die Verweilzeit.</li>
	<li>Sobald die gewünschte Zellregion richtig fokussiert ist, nehmen Sie das Bild auf. Speichern Sie die Bilder mit der Erfassungssoftware des Mikroskops als .oir-Grafikdatei von Olympus.</li>
	<li>Erfassen Sie ein Hintergrundbild bei 1.900 cm-1 und subtrahieren Sie es von allen zellulären Bildern.</li>
	<li>Um eine 2PEF-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie denselben abstimmbaren Pikosekundenlaser und stellen Sie die markierungsfreie Autofluoreszenz von Flavin und NADH auf 800 nm bzw. 780 nm ein.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 460 nm/515 nm Filterwürfel, um die rückgestreute Flavin- und NADH-Autofluoreszenzemission zu sammeln.</li>
	<li>Stellen Sie die Verweilzeit auf 8 μs/Pixel und die Pixelgröße auf 512 Pixel x 512 Pixel ein. Stellen Sie den Parameter für die Laserverschlussleistung auf 150 mW ein.</li>
	<li>Für die 3D-Bildrekonstruktion stellen Sie den stimulierten Raman-Verlust auf 2.850 cm-1 (797 nm) ein.</li>
	<li>Sobald die gewünschten Einzelzellen identifiziert wurden, registrieren Sie den Laser, um von der oberen Fokusebene aus zu scannen, um die oberen und unteren Schichten dieser Zellen zu erkennen. HINWEIS: 3D-Modelle werden als OIR-Dateien generiert und gespeichert.</li>
</ol>5. Spektren und Bildanalyse
<ol><li>Spektrenanalyse<ol><li>Verwenden Sie die Origin-Software oder andere relevante Anwendungen, um das Hintergrundspektrum von allen subzellulären Zielspektren zu subtrahieren.</li>
		<li>Verwenden Sie die mathematischen Modellierungsoperationen von MATLAB, um die Raman-Spektren mit den integrierten Funktionen der Software zu verarbeiten. Python kann auch für die Spektrenverarbeitung verwendet werden.<ol><li>Die spektrale Vorverarbeitung beginnt mit der Konvertierung der Dateien in ein Array. Die Spektren werden auf jedem reziproken Zentimeter interpoliert.</li>
			<li>Stellen Sie zur Validierung die Rohdaten grafisch dar. Führen Sie die Basislinienkorrektur für die Rohspektren mit der integrierten Funktion msbackadj in MATLAB durch. Kurz gesagt, die integrierte Funktion schätzt Basislinienpunkte anhand von Trennungseinheitenwerten, die von Benutzern identifiziert wurden, und gibt den Abstand zwischen benachbarten Fenstern zurück. Schätzen und zeichnen Sie anhand der Basislinienpunkte eine Regressionsgerade. Wenden Sie Glättung an, um die Regressionsgerade zu glätten und die Basislinie von jedem einzelnen Rohspektrum zu subtrahieren.</li>
			<li>Führen Sie eine Min-Max-Normalisierung durch, indem Sie die Raman-Intensität des Proteins bei 2.930 cm-1 durch die Intensität jeder Raman-Verschiebung dividieren. Das 2.930 cm-1-Signal ist typischerweise die höchste Intensität im Raman-Spektrum . Bei dieser Normalisierung wird der Maximalwert in eine 1 umgewandelt, während der Minimalwert in eine 0 umgewandelt wird. Jeder zweite Wert wird in eine Dezimalzahl zwischen 0 und 1 umgewandelt.</li>
			<li>Mitteln Sie die einzelnen Spektren desselben Zustands zu einem einzigen Spektrum, um das Rauschen zu reduzieren.</li>
		</ol></li>
		<li>Verwenden Sie nach der Verarbeitung Anwendungen wie Origin, um alle Spektren gleichzeitig anzuzeigen. Die in den Spektren dargestellten Peaks stellen eine bestimmte chemische Bindung oder funktionelle Gruppe dar.</li>
	</ol></li>
	<li>3D-Bildanalyse von Lipidtröpfchen<ol><li>Verwenden Sie die FIJI-ImageJ-Software, um alle 3D-Bilder zu verarbeiten</li>
		<li>Führen Sie die Funktionen Bandpassfilter und Glättung für die 3D-Bildstapel aus.</li>
		<li>Für die 3D-Bildanalyse weisen Sie jedem Lipidtröpfchen einen sphärischen Score zu, der durch Messung des Abstands zwischen seinem Massenschwerpunkt und der Oberfläche berechnet wird. Vergleichen Sie jede sphärische Partitur mit einer sphärischen Partitur einer perfekten Kugel auf derselben euklidischen Ebene. Verwerfen Sie Lipidtröpfchen mit niedrigen sphärischen Werten und bewerten Sie die verbleibenden Lipidtröpfchen auf ihr Volumen und ihre Anzahl.</li>
		<li>Analysieren Sie das Volumen und die Anzahl der Lipidtröpfchen zwischen verschiedenen Behandlungen auf statistische Signifikanz in einer geeigneten statistischen Softwareanwendung. Hier kam GraphPad Prism zum Einsatz.</li>
	</ol></li>
	<li>Hyperspektrale 2D-Bildanalyse<ol><li>Verwenden Sie die FIJI-ImageJ-Software, um alle hyperspektralen 2D-Bilder zu verarbeiten.</li>
		<li>Wählen Sie den Kanal 2.930 cm-1 aus, um ein Maskenbild mit den Werten 0 und 1 zu erstellen. Weisen Sie den Hintergrund 0 und den Zellbereich 1 zu.</li>
		<li>Subtrahieren Sie den Deuterium-markierten Proteinkanal (2.175 cm-1) vom Hintergrundkanal (1.900 cm-1), um die Fluoreszenzeffekte zu entfernen.</li>
		<li>Dividieren Sie den resultierenden Deuterium-markierten Proteinkanal durch den Proteinkanal (2.930 cm-1), um ratiometrische Bilder der Proteinumsatzrate zu erhalten.</li>
		<li>Multiplizieren Sie dann das in Schritt 5.3.2 erstellte Maskenbild mit den ratiometrischen Bildern, um alle verbleibenden Hintergrundgeräusche zu entfernen. Dadurch wird in jedem ratiometrischen Bild ein dunkler Hintergrund erzeugt.</li>
		<li>Verwenden Sie das Freihandauswahl-Werkzeug in FIJI-ImageJ, um die in einzelnen Zellen angezeigten Pixelintensitäten manuell zu segmentieren und zu berechnen. Die Pixelintensitäten entsprechen den Konzentrationen der chemischen Bindung, die visualisiert wird.</li>
		<li>Analysieren Sie die Pixelintensitäten auf statistische Signifikanz in einer geeigneten Statistiksoftwareanwendung. Hier kam GraphPad Prism zum Einsatz. Wiederholen Sie diese Analyse mit der verbleibenden ratiometrischen Analyse.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Leica TCS SP8 CARS CARS Microscope - Label Free Imaging. Leica Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/">https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/downloads/</a> (2023).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

DO-SRS- und 2PEF-Bildgebung wurden eingesetzt, um die Stoffwechseldynamik in verschiedenen Ex-vivo-Modellen zu untersuchen, darunter Drosophila und menschliches Gewebe 21,22,23,24,26,27,33. Die in dieser Studie verwendete Bildgebungsmodalität integriert DO-SRS und 2PEF-Mikroskopie, ...

Als essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) können Phenylalanin (Phe) und Tryptophan (Tryp) vom menschlichen Körper aufgenommen werden, um neue Moleküle zur Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen zu synthetisieren1. Phe wird für die Synthese von Proteinen, Melanin und Tyrosin benötigt, während Tryp für die Synthese von Melatonin, Serotonin und Niacinbenötigt wird 2,3. Ein übermäßiger Konsum dieser AAAs kann jedoch das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) hochregulieren, die AMP-aktivierte Proteinkinase hemmen und in den mitochondrialen Stoffwechsel eingreifen, wodurch die Biosynthese von Makromolekülen kollektiv verändert und zur Produktion von bösartigen Vorläufern wie reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in gesunden Zellen geführt wird 4,5,6. Die direkte Visualisierung einer veränderten Stoffwechseldynamik unter übermäßiger AAA-Regulation ist unerlässlich, um die Rolle von AAAs bei der Förderung der Krebsentstehung und des Wachstums gesunder Zellen zu verstehen 7,8,9.
Herkömmliche AAA-Studien stützen sich auf die Gaschromatographie (GC)10. Andere Methoden, wie z. B. die Magnetresonanztomographie (MRT), haben eine begrenzte räumliche Auflösung, was die Durchführung zellulärer und subzellulärer Analysen biologischer Proben erschwert11. Kürzlich wurde die matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) entwickelt, um die Rolle von AAAs bei der Lipid- und Proteinsynthese bei der Krebsproliferation mit nicht-invasiven Biomarkernaufzuklären 12,13,14. Diese Technik leidet jedoch immer noch unter geringen Abbildungstiefen, schlechter räumlicher Auflösung und umfangreicher Probenvorbereitung. Auf zellulärer Ebene können ungiftige stabile Isotope wie Stickstoff-15 und Kohlenstoff-13 mit Multi-Isotopen-Bildgebung und nanoskaliger Sekundärionen-Massenspektrometrie aufgespürt werden, um ihren Einbau in Makromoleküle zu verstehen. Diese Methoden sind jedoch zerstörerisch für lebende biologische Proben15,16. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine weitere leistungsstarke Technik, mit der die Stoffwechseldynamik sichtbar gemacht werden kann17. Die langsame Abtastrate während der AFM-Bildgebung kann hingegen zu einer Bildverzerrung des Ergebnisses durch thermische Drift führen.
Wir haben eine nicht-invasive biorthogonale Bildgebungsmodalität entwickelt, indem wir Deuteriumoxid (D2O)-Sonden-stimulierte Raman-Streumikroskopie (DO-SRS) und markierungsfreie Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) gekoppelt haben. Diese Modalität erreicht eine hohe räumliche Auflösung und chemische Spezifität bei der Abbildung biologischer Proben 18,19,20,21,22,23,24. Dieses Protokoll stellt die Anwendungen von DO-SRS und 2PEF vor, um die metabolische Dynamik von Änderungen des Lipid-, Protein- und Redoxverhältnisses während des Fortschreitens von Krebs zu untersuchen. Da es sich beiD2Oum eine stabile Isotopenform von Wasser handelt, können zelluläre Biomoleküle mit Deuterium (D) markiert werden, da es schnell mit dem gesamten Körperwasser in den Zellen kompensiert wird und Kohlenstoff-Deuterium (C-D)-Bindungen (C-D) durch enzymatischen Austausch bildet21. Die C-D-Bindungen in neu synthetisierten Makromolekülen, einschließlich Lipiden, Proteinen, DNA/RNA und Kohlenhydraten, können in der stillen zellulären Region des Raman-Spektrumsnachgewiesen werden 20,21,22,25,26,27. Mit zwei synchronisierten Laserpulsen können C-D-Bindungen von neu synthetisierten Lipiden und Proteinen mittels hyperspektraler Bildgebung (HSI) auf einzelnen Zellen dargestellt werden, ohne dass sie extrahiert oder mit zytotoxischen Wirkstoffen markiert werden müssen. Darüber hinaus ist die SRS-Mikroskopie in der Lage, dreidimensionale (3D) Modelle ausgewählter Regionen von Interesse in biologischen Proben zu erstellen, indem eine Reihe von Querschnittsbildern aufgenommen und kombiniert wird22,26. Mit hyperspektraler und volumetrischer 3D-Bildgebung kann DO-SRS räumliche Verteilungen von neu synthetisierten Makromolekülen in einzelnen Zellen erhalten, zusammen mit der Art von Organellen, die den Prozess der Förderung des Krebswachstums gemäß AAA-Regulation22 erleichtern. Darüber hinaus können wir mit 2PEF Autofluoreszenzsignale von Flavin und Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) mit hoher Auflösung, tiefer Eindringtiefe und geringer Schädigung in biologischen Proben erhalten21,23,24. Flavin- und NADH-Autofluoreszenzsignale wurden verwendet, um die Redoxhomöostase und Lipidperoxidation in Krebszellen zu charakterisieren22,26. Die Kopplung von DO-SRS und 2PEF ermöglicht somit nicht nur eine subzelluläre Analyse der AAA-regulierten Stoffwechseldynamik in Krebszellen mit hoher räumlicher Verteilung, chemischen Spezifitätsinformationen und minimaler Probenvorbereitung, sondern reduziert auch die Notwendigkeit, endogene Moleküle mit toxischen Reagenzien zu extrahieren oder zu markieren. In diesem Protokoll stellen wir zunächst die Verfahren derD2O- und Aminosäurepräparation sowie der Krebszellkultur vor. Anschließend zeigen wir die Protokolle der DO-SRS-Bildgebung und der 2PEF-Bildgebung. Abschließend präsentieren wir die repräsentativen Ergebnisse der SRS- und 2PEF-Bildgebung, die AAA-regulierte metabolische Veränderungen von Lipiden und Proteinen sowie Änderungen des Redoxverhältnisses in Krebszellen zeigen. Eine detaillierte Darstellung des Prozesses ist in Abbildung 1 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>10 mL Serologische Pipetten&nbsp;</td><td>Avantor (by VWR)</td><td>75816-100</td><td>https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100</td></tr><tr><td>konisches Zentrifugenröhrchen mit 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664</td></tr><tr><td>16 % Formaldehyd, methanolfrei</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28906</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0112929</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929</td></tr><tr><td>25 mm Spritzenvorsatzfilter, 2 &mu; m PES</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>381-2216-OEM</td><td>https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003</td></tr><tr><td>460 nm Filter</td><td>Cube Olympus</td><td></td><td>OCT-ET460/50M32</td></tr><tr><td>Netzteile des Netzteils für LD OBIS 6 Laser Remote</td><td>Olympus</td><td></td><td>Stromversorgung des</td></tr><tr><td>Laser-Bandpassfilters</td><td>KR Electronics</td><td>KR2724 8</td><td>MHz</td></tr><tr><td>BNC 50 Ohm Terminator&nbsp;</td><td>Mini Circuits</td><td>STRM-50</td><td></td></tr><tr><td>BNC Kabel</td><td>Thorlabs</td><td>2249-C</td><td>Koaxialkabel, BNC Stecker/Stecker</td></tr><tr><td>Breitband Dielektrischer Spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E03</td><td>750 - 1100 nm</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kondensator</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Corning</td><td>2850-25</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25</td></tr><tr><td>Gleichstromnetzteil</td><td>TopWard</td><td>6302D</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitische Halterung</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid Zellkulturreagenz</td><td>mpbio&nbsp;</td><td>196055</td> https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf <td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle" s Medium ohne Methionin, Threonin und Natriumpyruvat</td><td>MilliporeSigma</td><td>38210000</td><td>https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder Mit Natriumbicarbonat und ohne Methionin, Threonin und Natriumpyruvat&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium</td><td>Corning</td><td>MT10027CV</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20</td></tr><tr><td>FIJI ImageJ ImageJ</td><td></td><td>Version 1.53t 24. August 2022</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Schweres Wasser (Deuteriumoxid)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>7732-18-5</td><td>https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L</td></tr><tr><td>Hela Cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>https://www.atcc.org/products/ccl-2</td></tr><tr><td>Hämozymeter</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z359629-1EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB& gclsrc=aw.ds</td></tr><tr><td>Bandpassfilter mit hohem Außendurchmesser</td><td>Chroma-Technologie</td><td>ET890/220m</td><td>Filtert den Stokes-Strahl und sendet den Pumpstrahl</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH300880340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340</td></tr><tr><td>HyClone Trypsin 0,25 % (1x) Lösung</td><td>Cytiva</td><td>SH30042.02</td><td>https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445</td></tr><tr><td>Integriertes SRS-Lasersystem</td><td>Angewandte Physik & Elektronik, Inc.</td><td>picoEMERALD</td><td>picoEMERALD liefert einen Ausgangsimpuls bei 1031 nm mit einer Pulsbreite von 6 ps und einer Wiederholrate von 80 MHz, der als Stokes-Strahl dient. Der frequenzverdoppelte Strahl bei 532 nm wird verwendet, um einen Pikosekunden-Optisch-Parametrischen Oszillator (OPO) synchron zu säen, um eine modengekoppelte Impulsfolge mit einer Pulsbreite von fünf ~ 6 ps zu erzeugen (der Leerlaufstrahl des OPO wird mit einem interferometrischen Filter blockiert). Die Ausgangswellenlänge des OPO ist ab 720&ndash; 950 nm, der als Pumpstrahl dient. Die Intensität des 1031 nm Stokes Strahls wird durch ein eingebautes EOM bei 8 MHz mit einer Modulationstiefe von mehr als 90% sinusförmig moduliert. Der Pumpstrahl wird räumlich mit dem Stokes-Strahl überlappt, indem ein dichroitischer Spiegel im Inneren von picoEMERALD verwendet wird. Die zeitliche Überlappung zwischen Pump- und Stokes-Pulsen wird durch eine eingebaute Verzögerungsstufe erreicht und durch das SRS-Signal von reinem D2O am Mikroskop optimiert.</td></tr><tr><td>Inverses Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>IX3-CBH Steuerbox</td><td>Olympus</td><td></td><td>Steuerung des Laser-Scanning-Mikroskops</td></tr><tr><td>Kinematische Spiegelhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>POLARIS-K1-2AH</td><td>2 flache Sechskant-Einsteller</td></tr><tr><td>L-Phenalynin</td><td>Sigma</td><td>P5482-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482</td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T8941-25G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941</td></tr><tr><td>LabSpec 6</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td><td>https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/</td></tr> <tr><td>Lock-In Verstärker</td><td>Zurich Instruments</td><td>N/A</td><td>https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier</td></tr><tr><td>Dichromoischer Langpass-Strahlteiler</td><td>Semrock</td><td>Di02-R980-25x36</td><td>980 nm Laser BrightLine Einkantiger laserflacher dichroitischer Strahlteiler</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>Version: R2022b</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-003</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003</td></tr><tr><td>Mikroskopie-Bildgebungssoftware</td><td>Olympus</td><td>FluoView</td><td></td></tr><tr><td>MPLN 100x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364</td></tr><tr><td>MPLN 50x, Olympus</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON&nbsp;</td><td>https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[Fokus]=cmsInhalt11363</td></tr><tr><td>NA Ölkondensator</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>6-U130</td><td>https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Wet n Wild</td><td>B01EO2G5O4</td><td>https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td>Origin 2022b (9.95)</td><td>https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782</td></tr><tr><td>PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung)</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>14040117</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermofischer - Gibco</td><td>15140122</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122</td></tr><tr><td>Periskop-Baugruppe</td><td>Thorlabs</td><td>RS99</td><td>Enthält die obere und untere Einheit sowie Oslash; 1" Pfosten und Klemmgabel.</td></tr><tr><td>picoEmerald System</td><td>A.P.E</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ <tr><td>geschirmte Box mit BNC-Anschlüssen</td><td>Pomona Electronics</td><td>2902</td><td>Aluminiumgehäuse mit Abdeckung, BNC-Buchse / Buchse</td></tr><tr><td>Si-Photodiodendetektor</td><td>Hausgemachte</td><td>N/A</td><td>DYI-Serie</td></tr><tr><td>Silizium-Wafer-Abstandshalter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/</td></tr> <tr><td>Spontane Raman-Spektroskopie</td><td>Horiba XploRA</td><td>N/A</td> https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ <td></td></tr><tr><td>Stimulierte Raman-Streumikroskopie</td><td>Hausgemachte</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Berührung&nbsp; Panel Controller</td><td>Olympus</td><td></td><td>Steuerung der X-Y-Richtung des Laser-Scanning-Mikroskops</td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,4 % (0,85 % NaCl)&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td>https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution"</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Kaverme - Amazon</td><td>B07RNVXXV1</td><td>https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1"</td></tr><tr><td>Zwei-Photonen-Anregungs-Fluoreszenzmikroskopie</td><td>Hausgemachtes</td><td>N/</td>A-Wägepapier<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12578-165</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper</td></tr><tr><td>Zurich LabOneQ Software</td><td>Zurich Instruments</td><td></td><td>Steuert den Zurich Lock-in-Verstärker</td></tr></tbody></table>

bioorthogonale chemische bildgebung des zellstoffwechsels, der durch aromatische aminosäuren reguliert wird

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) sind Bausteine für die Synthese neuer Biomassen in Zellen und die Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen. Zum Beispiel ist ein reichliches Angebot an AAAs für Krebszellen wichtig, um ihr schnelles Wachstum und ihre Teilung aufrechtzuerhalten. Damit steigt die Nachfrage nach einem hochspezifischen, nicht-invasiven Bildgebungsansatz mit minimaler Probenvorbereitung, um direkt zu visualisieren, wie Zellen AAAs für ihren Stoffwechsel in situ nutzen. Hier entwickeln wir eine optische Bildgebungsplattform, die Deuteriumoxid (D2O)-Sondierung mit stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) kombiniert und DO-SRS mit Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (2PEF) in ein einziges Mikroskop integriert, um die Stoffwechselaktivitäten von HeLa-Zellen unter AAA-Regulierung direkt sichtbar zu machen. Insgesamt bietet die DO-SRS-Plattform eine hohe räumliche Auflösung und Spezifität von neu synthetisierten Proteinen und Lipiden in einzelnen HeLa-Zelleinheiten. Darüber hinaus kann die 2PEF-Modalität Autofluoreszenzsignale von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin markierungsfrei detektieren. Das hier beschriebene Bildgebungssystem ist sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Modellen kompatibel, was für verschiedene Experimente flexibel ist. Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Protokolls umfasst Zellkultur, Nährmedienvorbereitung, Zellsynchronisation, Zellfixierung und Probenbildgebung mit DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten.

Die Zugabe von überschüssigen AAAs in 15-facher Konzentration zu den 50%D2O-haltigenZellkulturmedien führte zu deutlichen C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine in HeLa-Zellen (Abbildung 2B). Frühere Experimente wurden mit unterschiedlichen Konzentrationsniveaus durchgeführt, z. B. 2x und 5x, und obwohl die Daten nicht präsentiert werden, erzeugte die 15-fache Konzentration die deutlichsten C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine. Insbesondere du...

Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Wir präsentieren ein neues Bildgebungsverfahren mit markierungsfreier Fähigkeit, hoher chemischer Spezifität und subzellulärer Auflösung. Unsere Methodik kann eine Frage zu metabolischer Dysfunktion beim Altern und Krankheiten wie Krebs beantworten Raman-Bildgebung, gekoppelt mit Zwei-Photonen-Fluoreszenz und Erzeugung der zweiten Harmonischen, bietet eine zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnologie, die eine minimale Probenvorbereitung erfordert und eine hohe subzelluläre Auflösung erreicht, ohne die Zellprobe zu beschädigen. Als Teil unserer Plattform werden mehrere Bildgebungsmodalitäten betrieben.Einzelpersonen sollten unser Protokoll nach bestem Wissen und Gewissen befolgen und beachten, dass unser System hausgemacht ist. Auf dem Weg dorthin sollten sie ihre eigene Praxis entwickeln, um den Erfolg sicherzustellen. Beginnen Sie in zwei separaten Röhrchen mit dem Abmessen und Mischen von 10 Milligramm DMEM-Pulver mit 4,7 Millilitern doppelt destilliertem Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen.Wirbeln Sie das Röhrchen gründlich vor und invertieren Sie es, um sicherzustellen, dass die Lösung gut gemischt ist. Für beide Röhrchen 4,7 ml Deuteriumoxid, 0,5 ml FBS und 0,1 ml Penicillin und Streptomycin hinzufügen, bevor Sie das Röhrchen vortexen und invertieren. Als nächstes geben Sie überschüssiges Phenylalanin in ein Röhrchen und überschüssiges Tryptophanpulver in das zweite Röhrchen und mischen Sie erneut.Methionin und Threonin mit 30 bzw. 95 mg pro ml in beide Röhrchen geben, gefolgt von Vortexen und Invertieren des Röhrchens. Anschließend filtrieren Sie das vorbereitete Medium mit einem 25-Millimeter-Spritzenvorsatzfilter mit 0,22-Mikrometer-Filtern. Versiegeln Sie alle konischen Röhrchen des Mediums mit Parafilm.Vorbereitete Medien bei vier Grad Celsius lagern. Halten Sie Heilerzellen in einer Kulturflasche unter Verwendung von Standard-DMEM, das mit 10 % FBS, 1 % Penicillin und Streptomycin ergänzt wird. Subkultivieren Sie die Heilerzellen in einem Split-Verhältnis von eins zu 10, bis die Zelllebensfähigkeit von 80 % oder höher erreicht ist.Vor der Aussaat der Zellen werden die sterilisierten, lamininbeschichteten, runden Deckgläser aus Poly-D-Lysin mit einem Durchmesser von 12 mm in 70%iges Ethanol getaucht. Trocknen Sie die Deckgläser mit fusselfreien Tüchern ab und legen Sie die sauberen Deckgläser in die entsprechenden Vertiefungen der Platte. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Magnesium- und Kalziumionen.Fügen Sie 0,25 % Trypsin hinzu, um die Adhärenzzellen vom Kolben zu trennen, und inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie dann DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin und Streptomycin zu den Zellen. Pipettieren Sie vorsichtig nach oben und unten.Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 g für drei Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Als nächstes werden die Zellen in DMEM resuspendiert, ergänzt mit 0,5 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin. Zählen Sie die Trypanblau-Färbezellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop und säen Sie sie mit einer Dichte von zwei mal 10 bis zur fünften Zelle pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig, indem Sie die Platte leicht schütteln. Bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Ersetzen Sie nach acht Stunden das alte Nährmedium durch 50 % Deuteriumoxid und überschüssiges Phenylalanin oder 50 % Deuteriumoxid und überschüssiges Tryptophanmedium.Die Zellen werden 36 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in den Inkubator zurückgelegt. Bereiten Sie nun Objektträger mit Abbildungsräumen von neun mm Durchmesser vor. Geben Sie 15 Mikroliter PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, und spülen Sie die Zellen mit der gleichen Lösung.Fügen Sie 0,5 ml 4%ige methanolfreie Paraformaldehydlösung hinzu und lassen Sie die Platte 15 Minuten lang unter der Biosicherheitshaube. Saugen Sie die Paraformaldehydlösung an und spülen Sie sie mit PBS, ergänzt mit zweimal Kalzium und Magnesiumeisen. Geben Sie einen ml PBS, ergänzt mit Kalzium- und Magnesiumionen, in jede Vertiefung.Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Deckgläser vorsichtig aus jeder Vertiefung zu entfernen. Drehen Sie sie um und legen Sie die Zellseite auf die Bildräume, die mit dem PBS in Kontakt stehen. Versiegeln Sie die äußere Schicht des Deckglases mit dem Abstandshalter mit transparentem Nagellack.Legen Sie die biologische Probe auf den Probenhalter direkt unter der Objektivlinse. Klicken Sie dann auf das Kamerasymbol in der Software, um die Videokamera einzuschalten, und passen Sie die Fokusebene an, um einen Interessenbereich mit dem 50X-Objektiv zu identifizieren. Wechseln Sie zum 100X-Objektiv.Klicken Sie auf das Stopp-Symbol, um die Videokamera auszuschalten. Wählen Sie dann ein Gitter von 1.800 Linien pro mm und stellen Sie den Erfassungsbereich von 400 bis 3.150 Zentimeter umgekehrt ein. Stellen Sie abschließend die Erfassungszeit auf 90 Sekunden, die Akkumulation auf drei und das Binning auf vier Sekunden ein, um das geringste Rauschen und das genaueste Spektrum zu erzielen.Klicken Sie auf Start, um den Laser aufzuwärmen. Drücken Sie zunächst den Hauptschalter der Steuerbox IX3CBH auf Ein, gefolgt vom Hauptschalter des Touchpanel-Controllers. Schalten Sie dann den Hauptschalter des Netzteils des Netzteils für LDOBIS6 Laserfernbedienung ein, die mit dem Hauptkamm des Laserkombinators FV31S verbunden ist.Schalten Sie auch das Netzteil der LDOBIS6 Laser-Fernstromversorgung ein, die an den Sub-Laser-Combiner FV31S-Kamm angeschlossen ist. Drücken Sie danach die Hauptschalter des SI-Fotodiodendetektors und des Lock-in-Verstärkers ein. Stellen Sie das Laser-IR auf 1031 Nanometer ein Stellen Sie das Pico-Smaragdsystem auf eine abstimmbare Wellenlänge zwischen 720 und 990 nm ein.Montieren Sie die Probe auf das Öl und platzieren Sie einen großen Wassertropfen auf dem Objektträger, wo die Probe fixiert ist. Wählen Sie die Scangröße als 512 x 512 Pixel aus. Erfassen und speichern Sie die Bilder als Olympus.OIR-Grafikdatei. Nachdem Sie das Signal auf 862.0 eingestellt haben, erfassen Sie ein Hintergrundbild und speichern Sie es. Stellen Sie die Verweilzeit auf acht Mikrosekunden pro Pixel und die Pixelgröße auf 512 x 512 Pixel ein.Stellen Sie den Parameter für die Laserverschlussleistung auf 150 Milliwatt ein Für die 3D-Bildrekonstruktion stellen Sie den stimulierten Raman-Verlust auf 2.850 cm invers. Sobald die gewünschten Einzelzellen identifiziert wurden, registrieren Sie den Laser, um von der oberen Fokusebene aus zu scannen, um die oberen und unteren Schichten dieser Zellen zu erkennen. Deuteriumoxid, sondierte, stimulierte Raman-Streuung wurde verwendet, um die räumliche Verteilung von CD-Signalen auf einzelnen Zellen sichtbar zu machen.Die Kontrollzellen wiesen moderate CD-, Lipid- und Proteinbanden auf. Der 15 x v und 15 x Trip zeigte jedoch stärkere CD-Lipid- und Proteinverbote. Die quantitative Analyse zeigte, dass überschüssige aromatische Aminosäuren die Lipidsynthese um 10 bis 17 % hochregulieren, aber die Proteinsynthese um 10 % herunterregulieren können. Die metrische Analyse der mit aromatischen Aminosäuren behandelten Zellen zeigte einen 50%igen Anstieg des Flavins geteilt durch Flavin plus NADH und einen 10%igen Anstieg des ungesättigten Lipids geteilt durch gesättigtes Lipid.Die stimulierte Raman-3D-Lipidtröpfchen-Volumenprojektion in Heilerzellen unter Kontrolle und überschüssigen aromatischen Aminosäuren wird gezeigt. Quantitative Analysen von 3D-Lipidtröpfchen zeigten einen Anstieg der Anzahl, aber eine Verringerung der Größe der mit aromatischen Aminosäuren behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Die Bildgebungsparameter für die Raman- und Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung sollten von einer Probe zur nächsten optimiert werden, um die beste Bildqualität zu gewährleisten.Individuen können unser System mit der zweiten harmonischen Generation koppeln, um die Kollagenstruktur zu untersuchen, die frühe metabolische Veränderungen beim Altern und bei Krankheiten aufklärt, und um das Fortschreiten von Neurodegeneration oder Krebs zu verstehen. Unsere Technologie ist die erste dieser Art, um die Lipid- und Proteinsynthese in biologischen Systemen mit hoher subzellulärer Auflösung sichtbar zu machen. Die Technologie kann auch in der Klinik zur nicht-invasiven Erkennung von Krankheiten eingesetzt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

13 C-Isotopenmarkierung ist eine nützliche Technik für die Bestimmung der Zelle zentralen Stoffwechsel für verschiedene Arten von Mikroorganismen. Nachdem die Zellen mit einer bestimmten markiertem Substrat gezüchtet haben, können GC-MS-Messung zeigen funktionale Stoffwechselwege auf einzigartige Kennzeichnung Muster in proteinogenen Aminosäuren basiert.

Stoffwechselweg der Firmung und der Entdeckung durch 13 C-Kennzeichnung von proteinogenen Aminosäuren

Eine einfache Fluoreszenz-Assay wird präsentiert, um die Effizienz von amino-Acyl-tRNA-synthestase/tRNA-Paaren, die Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (NcAAs) in Proteine in Säugetierzellen zu bewerten. Die Anwendung des NcAAs auf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) studieren wird beschrieben, einschließlich Foto-Vernetzung Zuordnung Websites und Bioorthogonal GPCR Kennzeichnung auf lebende Zellen zu binden.

Optimierung der genetischen Einbeziehung der chemischen Sonden in GPCRs für Foto-Vernetzung-Mapping und Bioorthogonal Chemie in Live Säugerzellen

Hier präsentieren wir ein robustes Protokoll zur Quantifizierung von 40 Verbindungen, die am zentralen Kohlenstoff- und Energiestoffwechsel in zellfreien Proteinsynthesereaktionen beteiligt sind. Das zellfreie Synthesegemisch wird mit Anilin zur effektiven Trennung mittels umgekehrter Flüssigchromatographie abgeführt und dann durch Massenspektrometrie unter isotopisch gekennzeichneten internen Standards quantifiziert.

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Dieses Protokoll stellt einen radioaktiv markierten Aminosäureaufnahmetest vor, der für die Bewertung des Aminosäureverbrauchs entweder in Primärzellen oder in isolierten Knochen nützlich ist.

Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH), auch bekannt als Mid-Infrared Photothermal-FISH (MIP-FISH), verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren und ihren Stoffwechsel zu verstehen. Diese Methodik kann für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Kartierung des Zellstoffwechsels mit Einzelzellauflösung.

Optische photothermale Infrarot-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (OPTIR-FISH)

Unter Verwendung einer multimodalen Plattform, die markierungsfreie optische Bildgebungsmodalitäten kombiniert, haben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der zellulären Dynamik und des Stoffwechsels entwickelt. Durch Bildgebung mittels Multiphotonenfluoreszenz, Erzeugung der zweiten Harmonischen und stimulierte Raman-Streumikroskopie können wir einen ganzheitlichen Überblick über die zelluläre und molekulare Umgebung erhalten.

Multimodale optische Bildgebungsplattform zur Untersuchung des zellulären Stoffwechsels

Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Entdecken Sie eine bioorthogonale Bildgebungsmethode zur Visualisierung des Zellstoffwechsels mit subzellulärer Auflösung. Diese Technik kombiniert stimulierte Raman-Streuung mit Fluoreszenzmikroskopie.

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

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