Name: Quantifizierung der Fitnesskosten bei transgenen Aedes aegypti-Mücken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-15T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von Fitnessparametern bei transgenen Aedes aegypti-Mücken. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Fruchtbarkeit, Flügelgröße und Lebenserwartung für ökologische Populationsstudien.

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Die Autoren danken Dr. Bill Reid und Dr. Alexander Franz von der University of Missouri für ihre Unterstützung bei diesem Protokoll. Die Autoren danken auch Dr. Benjamin Krajacich vom NIH/NIAID für seine Unterstützung bei der R-Analyse. Diese Studie wurde von den NIH mit der Fördernummer R01 AI130085 (KEO) und der NIH/NIAID Division of Intramural Research Program AI001246 (EC) finanziert.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ae. aegypti-Fitnessstudien werden häufig im Labor durchgeführt, um die Fitnesskosten im Zusammenhang mit transgener Fracht (z. B. Gene-Drive-Elemente) oder Gen-Knock-outs zu bewerten, wie in diesem Manuskript diskutiert; Diese Studien können jedoch für eine Vielzahl von Zwecken durchgeführt werden, die darauf abzielen, die Gesundheit einer Ae. aegypti-Gruppe zu bewerten, wie z. B. Wolbachia-Infizierte 30,31, Insektizidresistent...

Das Überleben des Stärkeren ist die darwinistische Idee, dass Individuen, die Gene besitzen, die am besten an ihre Umwelt angepasst sind, diese Gene an nachfolgende Generationen weitergeben1. Das bedeutet, dass es die Fitness ist, die darüber entscheidet, ob ihre Gene überleben werden. Dieses mehr als 150 Jahre alte Konzept ist vielleicht die wichtigste Determinante für die Entwicklung eines erfolgreichen Gene Drives bei transgenen Mücken. Gene Drives, oder das super-Mendelsche Vererbungsmuster eines egoistischen genetischen Elements, das es ihm ermöglicht, sich in Populationen auszubreiten2, werden für die genetische Schädlingsbekämpfung erforscht3. Im Rahmen der Vektorkontrolle zielt diese Strategie darauf ab, Wildtyp-Arthropoden (WT) entweder durch pathogenresistente Arthropoden zu ersetzen (Populationsmodifikation) oder sie ganz zu eliminieren (Populationssuppression)4. Transgene Mücken weisen jedoch im Vergleich zu ihren WT-Artgenossen oft Fitnesskosten (auch genetische Belastung genannt) auf, was bedeutet, dass das Transgen in Populationen, die sie übertreffen können, verloren geht. Die Kopplung von Transgenen mit einem Gene-Drive-System ist daher notwendig, um etwaige Fitnesskosten auszugleichen und das Transgen in der Population auf einem Niveau zu pushen, das größer ist als von typischer Mendelscher Vererbung erwartet4.
Laborstudien an Mückenvektorarten haben gezeigt, dass Transgene oft Fitnesskosten aufweisen 5,6,7. Zum Beispiel Irvin et al. Es wurden verschiedene Lebensparameter in Aedes (Ae.) aegypti gemessen, die so konstruiert wurden, dass sie unter Drosophila-Aktin-5C oder synthetischen 3XP3-Promotoren ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) oder Transposase-Gene exprimieren, und verglichen sie mit dem Wildtyp-Orlando-Stamm (dem gleichen genetischen Hintergrund, von dem sie abgeleitet wurden)5. Vor allem fanden sie heraus, dass alle transgenen Stämme eine signifikant reduzierte Fortpflanzungsfähigkeit aufwiesen5. Abhängig vom Transgen zeigten einige Anopheles (An.) Mücken, die Transgene exprimierten, die die Entwicklung des Plasmodium-Parasiten hemmten, auch Fitnesskosten6. Insbesondere legte An. stephensi, die eine Bienengiftphospholipase (PLA2) unter konstitutiven oder blutmehlinduzierbaren Promotoren exprimierte, signifikant weniger Eier im Vergleich zu den Kontrollen6. Diese Autoren stellten auch fest, dass transgene Anopheles, die ein anderes Transgen, ein SM1-Dodecapeptid-Tetramer, exprimierten, keine Fitnesskosten aufwiesen, was sie zu dem Schluss veranlasste, dass die transgenübertragenen Fitnesskosten zumindest wahrscheinlich teilweise von der Wirkung des produzierten transgenen Proteins abhängen6. In der Tat können die Fitnesskosten auf transgene Produkte, Positionseffekte, Off-Target-Effekte, Insertionsmutagenese oder Inzuchteffekte bei im Labor gezüchteten Stämmen zurückgeführt werden7. Gene Drives müssen daher robust genug sein, um diese transgeninduzierten Fitnesskosten auszugleichen und gleichzeitig die Entwicklung von Insertionen und Deletionen (Indels) zu vermeiden, die den Antrieb selbst blockieren.
Die Kosten für die Entwicklungs- oder Reproduktionsfitness können in Labor- oder Käfigstudiengemessen werden 7, wobei der Vorbehalt darin besteht, dass unbekannte Faktoren in diesem Bereich ebenfalls eine Rolle spielen können. Nichtsdestotrotz sind kontrollierte Fitnessstudien ein wichtiger erster Schritt bei der Planung oder Bewertung gentechnisch veränderter Mückenfreisetzungen, wie z. B. ein Gene-Drive-Programm, um festzustellen, ob die transgene Linie über nachfolgende Generationen hinweg bestehen bleibt. Zum Beispiel Hammond et al. evaluiert Ein gambiae CRISPR/Cas9-basierter Gene Drives, die die für die weibliche Fertilität notwendigen Gene störensollen 8. In Käfigstudien, die über mindestens 25 Generationen durchgeführt wurden, fanden die Autoren heraus, dass die Mücken Gen-Drive-resistente Allele entwickelten, die die CRISPR-gezielte Spaltung blockierten und die weibliche Fruchtbarkeit wiederherstellten8. Ihre Modellierungsbemühungen deuteten darauf hin, dass die Fertilität bei Frauen, die heterozygot für den Gene Drive sind, die dramatischsten Auswirkungen auf die Gene-Drive-Fixierung unter simulierten Bedingungen hat8. In diesem Sinne zeigten Ae. aegypti (Higgs' White Eye Stamm, HWE), die so konstruiert wurden, dass sie autonome Gene-Drive-Kassetten unter verschiedenen Promotoren oder an verschiedenen intergenen Loci exprimieren, in simulierten Populationen unterschiedliche Raten der Gene-Drive-Fixierung9. Unter Verwendung der MGDrivE-Modellierung10, kombiniert mit gemessenen Raten der Indelbildung, maternalen Effekten und im Labor gesammelten Lebensparameterdaten, fanden die Autoren heraus, dass die Fitness der Mücken die Persistenz des Gene Drives unter simulierten Bedingungen am stärkstenbeeinflusste 9. Die Fitnesskosten, die die Effizienz des Gene Drives am ehesten beeinträchtigen, sind auf die somatische Cas9-(Über-)Expression oder auf das Zielgen zurückzuführen, insbesondere bei Heterozygoten, und nicht auf den intrinsischen Antrieb selbst 11,12,13,14,15,16,17.
Aufgrund ihrer Bedeutung ist die Fitness ein wichtiger Faktor für die Fähigkeit einer transgenen Linie, über nachfolgende Generationen hinweg zu überleben, und sie kann als Indikator für physiologische Effekte verwendet werden, die mit einem Transgen verbunden sind. Zum Beispiel können Off-Target-Effekte mit Fitnesskosten verbunden sein. In diesem Fall empfiehlt sich die Rückkreuzung einer transgenen Linie über mehrere Generationen. Darüber hinaus kann es auch notwendig sein, die transgene Linie mit einer Linie zu überschreiten, die eine Feldpopulation widerspiegelt, um zu untersuchen, wie gut die transgene Population in der realen Welt konkurrieren kann. Um die Fitnesskosten so zu quantifizieren, dass sie vergleichbar sind, enthält dieses Manuskript einfache Protokolle zur Messung gemeinsamer Lebensgeschichtsmerkmale bei Ae. aegypti-Mücken, mit besonderem Schwerpunkt auf den Fitnesskosten im Zusammenhang mit Transgenen, damit solche Studien leichter reproduzierbar sind. Zu den Protokollen gehören Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit bei Erwachsenen. Die Messung der Flügellänge und -fläche wurde ebenfalls als Fitnessmessung gewählt, da sie mit der Thoraxlänge 18,19 und der Körpergröße korreliert, was in direktem Zusammenhang mit der Größe, Fruchtbarkeit und Immunität des Blutmehls steht20,21. Obwohl es viele Möglichkeiten gibt, die Fitness zu beurteilen, wurden diese Parameter gewählt, weil sie den Fortpflanzungserfolg widerspiegeln, einfach zu messen sind und in der Literatur häufig berichtet werden.

<table><tbody><tr><td>1 Unze durchscheinende Kunststoff-Souffle-Becher</td><td>WebstaurantStore</td><td>301100PC</td><td></td></tr><tr><td>2 oz. durchscheinende Polystyrol-Souffle-Becher</td><td>WebstaurantStore</td><td>760P200N</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Kunststoff-Pipettierer&nbsp;</td><td>Cornin</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konische Röhrchen</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>64 oz. weißer doppelt polybeschichteter Lebensmittelbecher aus Papier</td><td>WebstaurantStore</td><td>999SOUP64WB</td><td>für Moskitoeinschließung</td></tr><tr><td>65 mm Linse&nbsp;</td><td>Canon</td><td>MP-E 65mm f/2.8 1-5x Makro Foto</td><td>Canon Makro Foto MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; zum Fotografieren von Flügeln oder Eierpapier, obwohl andere Kameras wahrscheinlich ausreichend sind</td></tr><tr><td>Aedes aegypti&nbsp; Mücken</td><td>BEI</td><td>mehreren Stämmen als Eier sind erhältlich</td><td></td></tr><tr><td>Künstliche Membranfutterautomaten</td><td>https://lillieglassblowers.com/</td> <td>Meduim Membranfutterautomat, Sonderanfertigung, 33mm</td><td>Chemglass bietet auch an, aber Größen sind für uns falsch. Unsere sind ca. 3 cm groß?</td></tr><tr><td>ATP</td><td>MP Biomedical</td><td>ICN15026605</td><td>Alle hochwertigen ATP, 10mM Filter sterile Aliquoten bei -20</td></tr><tr><td>Autoklav</td><td></td><td></td><td>zum Sterilisieren von Wasser zum Schlüpfen</td></tr><tr><td>Canon EOS 7D Kamera&nbsp;</td><td>Canon</td><td>3814B004</td><td>zum Fotografieren von Flügeln oder Eierpapier, obwohl andere Kameras wahrscheinlich ausreichend</td></tr><tr><td>defibriertes Schafsblut sind&nbsp;</td><td>Colorado Serum Co.</td><td>60 ml, alle 2 Wochen</td><td>https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated</td></tr><tr><td>Dual Schwanenhalsmikroskop Illuminator</td><td>Dolan Jenner Fiber-Lite 180</td><td>181-1 System</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Dumont</td><td>5SF</td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td></td><td>omnisorb ii</td><td>4" Vliesschwämme</td></tr><tr><td>Glasmikroskop Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen aus Glas, 100 & 15 mm</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td>zur Betäubung/Manipulation von Mücken auf Eis</td></tr><tr><td>Schweinedarm</td><td>Alle Delikatessen</td><td></td><td>, die wir in loser Schüttung kaufen, teilen, waschen und in kleinen Aliquots von ~4X12" bei -20 in 50 ml konischen</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe lagern</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Leica GZ4 StereoZoom-Mikroskop</td><td></td><td></td><td>zum Screening transgener Mücken (falls zutreffend)</td></tr><tr><td>Pinsel</td><td>AIT Synthetikpinsel&nbsp;</td><td>Größe 10-0</td><td>zur Manipulation von Larven/Puppen (Amazon)</td></tr><tr><td>Strumpfhose</td><td>Walmart</td><td>L'Eier Jeden Tag</td><td>&nbsp; Damen Nylon Plus Kniestrümpfe durchsichtige Spitze, 16 Paar (plus passt in den Karton)</td></tr><tr><td>Bleistifte</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffbehälter für die Lagerung von Kartons</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 58 Qt Aufbewahrungsbox Durchsichtiger Boden Weißer Deckel Set von 8</td></tr><tr><td>Kunststoffbehältern für die Aufzucht von Larven</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 28 Qt. Aufbewahrungsbox Kunststoff, Weiß, Set mit 10</td></tr><tr><td>Kunststoffbehältern zum Schlüpfen von Larven</td><td>Walmart</td><td></td><td>Sterilite 6 Qt. Aufbewahrungsbox Kunststoff, Weiß</td></tr><tr><td>Polypropylen durchsichtige Feinkostbehälter&nbsp;</td><td>WebstaurantLaden</td><td>&nbsp; 127DM12BULK</td><td>12 oz oder 16 oz bei Bedarf für größere (127RD16BULK)</td></tr><tr><td>Gummibänder</td><td>Office Max</td><td>&nbsp;#100736/#909606 /#3777415</td><td>12", #64 und #10</td></tr><tr><td>Gummistopfen</td><td>VWR</td><td>217-0515</td><td>für die Mückeneinschließung</td></tr><tr><td>Zuckerquelle, wie z.B. Würfelzucker oder Rosinen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramin Flockenfutter</td><td>Tetramin</td><td>16106</td><td></td></tr><tr><td>tpsDig</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>Eine kostenlose morphometrische Bildverarbeitungssoftware, die online vertrieben wird, verfügbar unter https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>tpsUtil</td><td>Stony Brook Morphometrics</td><td></td><td>Eine kostenlose morphometrische Bildverarbeitungssoftware, die online vertrieben wird, verfügbar unter https://www.sbmorphometrics.org/</td></tr> <tr><td>Weißes Organzagewebe 8" &times; 8"</td><td>FabricWholesale.com&nbsp;</td><td>4491676</td><td>Joann Casa Collection Organzastoff von Casa Collection&nbsp;</td></tr><tr><td>Whitman Grade 1 Qualitatives Filterpapier</td><td>Whitman</td><td>1001-824</td><td>für Eierpapier. Die weiße Farbe macht es einfacher, die schwarzen Eier zu sehen.</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der fitnesskosten bei transgenen aedes aegypti-mücken

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Transgene Mücken weisen im Vergleich zu ihren Wildtyp-Artgenossen oft Fitnesskosten auf. In diesem Zusammenhang geht es bei Fitnesskostenstudien darum, Lebensparameterdaten von genetisch veränderten Stechmücken zu sammeln und sie mit Stechmücken zu vergleichen, denen Transgene aus demselben genetischen Hintergrund fehlen. Dieses Manuskript zeigt, wie gemeinsame Merkmale der Lebensgeschichte der Mücke Aedes aegypti gemessen werden können, einschließlich Fruchtbarkeit, Flügelgröße und -form, Fruchtbarkeit, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit der adulten Mücke. Diese Parameter wurden gewählt, weil sie den Fortpflanzungserfolg widerspiegeln, einfach zu messen sind und in der Literatur häufig berichtet werden. Die repräsentativen Ergebnisse quantifizieren die Fitnesskosten, die entweder mit einem Gen-Knock-out oder einer einmaligen Insertion eines Gene-Drive-Elements verbunden sind. Die Standardisierung der Art und Weise, wie Lebensparameterdaten gesammelt werden, ist wichtig, da solche Daten verwendet werden können, um die Gesundheit transgener Mücken zu vergleichen, die in Studien erzeugt wurden, oder um die Transgen-Fixierungsrate in einer simulierten Wildtyp-Mückenpopulation zu modellieren. Obwohl dieses Protokoll spezifisch für transgene Aedes aegypti ist, kann es auch für andere Mückenarten oder andere experimentelle Behandlungsbedingungen verwendet werden, mit dem Vorbehalt, dass bestimmte biologische Kontexte besondere Anpassungen erfordern können.

In Anlehnung an das obige Protokoll wurde die Fitness von zwei Mückenlinien untersucht: (1) CRISPR/Cas9-vermittelter Knock-out des Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424) Speichelproteins und (2) Ae. aegypti-Linien , die autonome CRISPR/Cas9-vermittelte Gene Drivesexprimieren 9. Im ersteren Fall wurde eine homozygote D7L1-Knock-out-Linie etabliert, indem der nicht-homologe Endverbindungsweg (NHEJ) ausgenutzt wurde, um die Störung nach der Mikroinjektion von Embryonen mit sgRNAs, die für da...

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie gängige Lebensparameterdaten bei Aedes aegypti-Mücken gemessen werden, einschließlich Fruchtbarkeit, Flügelgröße, Fertilität, Geschlechterverhältnis, Lebensfähigkeit, Entwicklungszeiten, männlicher Beitrag und Langlebigkeit adulter Mücken. Diese Messungen können verwendet werden, um die Fitness transgener Stechmücken zu beurteilen.

Quantifizierung der Fitnesskosten bei transgenen Aedes aegypti-Mücken

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...

Dieses Protokoll zeigt Standardmessungen, die die Fitness bei Aedes aegypti-Mücken widerspiegeln, diese Fitnessparameter wurden ausgewählt, weil sie den Fortpflanzungserfolg widerspiegeln, einfach zu messen sind und in der Literatur häufig berichtet werden. Legen Sie zunächst Eierpapier über Nacht in steriles Wasser in den Insektor, um transgene und Wildtyp-Mücken zu schlüpfen. Lassen Sie die Larven nach Belieben fressen, indem Sie einige Tropfen gemahlene Fischfuttergülle geben.Um sicherzustellen, dass die Erwachsenen Jungfrauen sind, trennen Sie die Puppen nach Geschlecht, sobald sie schlüpfen, legen Sie die Puppe auf einen Glasobjektträger und entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einem Taschentuch, um die Puppe ruhig zu stellen. Unter einem Stereoskop mit zwei- bis vierfacher Vergrößerung und einem feinen Pinsel die Puppe mit der Vorderseite nach oben positionieren. Analysieren Sie dann visuell den Schwanz auf Unterschiede in der Form des Genitallappens.Setzen Sie männliche und weibliche Puppen in getrennte Wasserbecher in geeigneter Haltung. Um Wildtyp- oder transgenen Gene Drive eines oder zwei Männchen in Massen mit jungfräulichen Wildtyp-Weibchen zu kreuzen, geben Sie anä

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit...

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

Um die Unterdrückung der Population von Aedes aegypti mit dem RIDL-® (Freisetzung von Insekten, die ein dominantes Lethal-System tragen) zu erreichen, muss eine große Anzahl männlicher Mücken freigesetzt werden. Dies erfordert den Einsatz von Techniken und Technologien für die Massenaufzucht, um zuverlässige Systeme bereitzustellen, um die maximale Anzahl hochwertiger männlicher Mücken zu erhalten.

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, tierische und künstliche Blutmahlzeiten an Aedes aegypti Mücken durch einen künstlichen Membran-Feeder zu liefern und das Volumen der aufgenommenen Mahlzeit genau zu quantifizieren.

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Vorbereitung bestrahlter und markierter männlicher Aedes aegypti-Moskitos für die Freisetzung in einem operationellen sterilen Insektentechnikprogramm

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von männlichen Aedes aegypti unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff als Marker. Weibliche Moskitos sind sowohl markierten als auch unmarkierten Männchen zur Kopulation ausgesetzt. Nach der Paarung werden ihre Spermatheken unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um ihren Paarungspartner zu bestimmen.

Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Rhodamin B zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit bei männlichen Aedes aegypti-Moskitos

Die hier berichteten Protokolle veranschaulichen drei alternative Möglichkeiten, die Leistung von gentechnisch veränderten Moskitos zu bewerten, die für die Vektorkontrolle in laboreigenen Kleinkäfigversuchen bestimmt sind. Jedes Protokoll ist auf die spezifische Modifikation des Mückenstamms (Gene Drive oder Non-Gene Drive) und die Art der gemessenen Parameter zugeschnitten.

Kleinkäfig-Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anopheline-Mücken

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Lernen Sie die Quantifizierung von Fitnessparametern bei transgenen Aedes aegypti-Mücken. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Fruchtbarkeit, Flügelgröße und Lebenserwartung für ökologische Populationsstudien.

Quantifizierung der Fitnesskosten bei transgenen Aedes aegypti-Mücken

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