Name: Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie hochgeschwindige Magnetpinzetten nanomechanische Messungen an DNA-Hairpins und SNARE-Komplexen mit 1,2 kHz durchführen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Einblicke in mechanobiologische Prozesse kraftempfindlicher Biomoleküle.

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der koreanischen Regierung (MSIT) finanziert wird (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 und NRF-2021R1A6A10042944). S.-H.R. wurde durch den NRF-Zuschuss (2021R1C1C2009717) unterstützt.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

In dieser Arbeit haben wir einen Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Aufbau vorgestellt, der strukturelle Veränderungen von Biomolekülen mit hoher raumzeitlicher Präzision beobachten kann. Die verwendete Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera erfasst 1.200 Bilder s−1 bei einer Auflösung von 1.280 x 1.024 und ermöglicht so eine Perlenverfolgung von 1,2 kHz. Die Geschwindigkeit der Messungen ist jedoch derzeit durch die Bead-Tracking-Software begrenzt, so dass der ROI bei Hochgeschwindigkeitsmessungen in der Regel auf kl...

Zellen nehmen mechanische Reize aktiv wahr und reagieren darauf. Dabei weisen viele Biomoleküle kraftabhängige Eigenschaften auf, die dynamische Strukturveränderungen ermöglichen. Bekannte Beispiele sind mechanosensitive Ionenkanäle und Zytoskelettelemente, die den Zellen wichtige mechanische Informationen aus ihrer Umgebung liefern.
Darüber hinaus können Moleküle, die eine einzigartige krafttragende Natur aufweisen, auch als mechanosensitiv im weiteren Sinne angesehen werden. Zum Beispiel spielen die lokale Bildung und das Schmelzen von Nukleinsäure-Duplexen sowie Strukturen höherer Ordnung wie G-Quadruplexe eine entscheidende Rolle bei der Replikation, Transkription, Rekombination und neuerdings auch bei der Genom-Editierung. Darüber hinaus erfüllen einige neuronale Proteine, die an der synaptischen Kommunikation beteiligt sind, ihre Funktionen, indem sie physikalische Kräfte erzeugen, die über das Niveau typischer intermolekularer Interaktionen hinausgehen. Unabhängig davon, welches Beispiel man untersucht, wird sich die Untersuchung der Nanomechanik der beteiligten Biomoleküle mit hoher raumzeitlicher Präzision als äußerst nützlich erweisen, um molekulare Mechanismen der damit verbundenen mechanobiologischen Prozesse aufzudecken 1,2,3.
Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Methoden haben sich als leistungsstarke Werkzeuge erwiesen, um die mechanischen Eigenschaften der Biomoleküle 2,4,5,6 zu untersuchen. Sie können strukturelle Veränderungen in Nukleinsäuren und Proteinen gleichzeitig mit Krafteinwirkung beobachten und so kraftabhängige Eigenschaften untersuchen. Zwei bekannte Aufbauten sind optische Pinzetten und magnetische Pinzetten (MTs), die mikrometergroße Kügelchen verwenden, um die Moleküle 5,6,7,8 zu manipulieren. In diesen Plattformen werden Polystyrol (für optische Pinzetten) oder magnetische Kügelchen (für MTs) über molekulare "Griffe", die typischerweise aus kurzen Fragmenten doppelsträngiger DNA (dsDNA) bestehen, an Zielmoleküle (z. B. Nukleinsäuren und Proteine) gebunden. Die Kügelchen werden dann bewegt, um Kraft auszuüben, und abgebildet, um ihre Positionen zu verfolgen, die über strukturelle Veränderungen in den Zielmolekülen berichten. Optische und magnetische Pinzetten sind in ihren Anwendungen weitgehend austauschbar, aber es gibt wichtige Unterschiede in ihren Ansätzen zur Kraftkontrolle. Optische Pinzetten sind intrinsische Positionsklemminstrumente, die Perlen in Position halten, wodurch die aufgebrachte Kraft schwankt, wenn sich die Form eines Zielkonstrukts ändert. Eine Verlängerungserhöhung, z. B. durch Entfaltung, lockert das Seil und verringert die Spannung und umgekehrt. Obwohl aktives Feedback implementiert werden kann, um die Kraft in optischen Pinzetten zu steuern, arbeiten MTs im Gegensatz dazu natürlich als Kraftklemmvorrichtung und nutzen die stabilen Fernfeld-Magnetkräfte von Permanentmagneten, die auch Umgebungsstörungen standhalten können.
Trotz ihrer langen Geschichte und ihres einfachen Designs sind MTs bei ihren Anwendungen für hochpräzise Messungen hinter optischen Pinzetten zurückgeblieben, was vor allem auf die technischen Herausforderungen bei der schnellen Perlenverfolgung zurückzuführen ist. In jüngster Zeit haben jedoch mehrere Gruppen gemeinsam eine vielschichtige Verbesserung sowohl der Hard- als auch der Software für MT-Instrumente 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 durchgeführt . In dieser Arbeit stellen wir ein Beispiel für einen solchen Aufbau vor, der bei 1,2 kHz läuft, und beschreiben, wie man damit nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Biomolekülen durchführen kann. Als Modellsysteme verwenden wir DNA-Haarnadeln und neuronale SNARE-Komplexe und untersuchen deren schnelle, strukturelle Veränderungen im Piconewton-Regime. DNA-Haarnadeln weisen einfache Zwei-Zustands-Übergänge in einem genau definierten Kraftbereich20,21 auf und dienen daher als Spielzeugmodelle, um die Leistung eines Pinzettenaufbaus zu überprüfen. Da sich die SNARE-Proteine zu einem kraftsensitiven Komplex zusammenfügen, der die Membranfusionantreibt 22, wurden sie auch ausgiebig mittels Einzelmolekül-Kraftspektroskopie untersucht 14,23,24,25. Es werden Standardansätze zur Analyse von Daten und zur Extraktion nützlicher Informationen über Thermodynamik und Kinetik vorgestellt. Wir hoffen, dass dieser Artikel die Einführung hochpräziser MTs in mechanobiologischen Studien erleichtern und die Leser motivieren kann, ihre eigenen kraftsensitiven Systeme zu erforschen.

hochgeschwindigkeits-magnetpinzette für nanomechanische messungen an kraftempfindlichen elementen

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Einzelmolekül-Magnetpinzetten (MTs) haben sich als leistungsstarke Werkzeuge zur gewaltsamen Abfrage von Biomolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen erwiesen und sind daher bereit, auf dem Gebiet der Mechanobiologie nützlich zu sein. Da die Methode in der Regel auf bildbasiertem Tracking von magnetischen Beads beruht, haben die Geschwindigkeitsbegrenzung bei der Aufnahme und Analyse von Bildern sowie die thermischen Fluktuationen der Beads ihre Anwendung bei der Beobachtung kleiner und schneller struktureller Veränderungen in Zielmolekülen lange Zeit behindert. Dieser Artikel beschreibt detaillierte Methoden für den Aufbau und Betrieb eines hochauflösenden MT-Aufbaus, der die nanoskalige Millisekundendynamik von Biomolekülen und ihren Komplexen auflösen kann. Als Anwendungsbeispiele werden Experimente mit DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexen (Membranfusionsmaschinerie) demonstriert, wobei der Schwerpunkt darauf liegt, wie deren transiente Zustände und Übergänge in Gegenwart von Kräften auf der Piconewton-Skala detektiert werden können. Wir gehen davon aus, dass Hochgeschwindigkeits-MTs weiterhin hochpräzise nanomechanische Messungen an Molekülen ermöglichen werden, die Kräfte in Zellen wahrnehmen, übertragen und erzeugen, und damit unser Verständnis der Mechanobiologie auf molekularer Ebene vertiefen werden.

Kalibrierung erzwingen Die Ergebnisse der beiden Kraftmessmethoden (seitliche Verschiebungsvarianz der Perlen und Leistungsspektrumanalyse) unterschieden sich um 0-2 pN (Abbildung 2G). Nach den Ergebnissen in Abbildung 2F können wir mit normalen Neodym-Magneten zuverlässig bis zu 30 pN erreichen.
Zwei-Zustands-Übergänge einer 8 bp DNA-Haarnadel Wir untersuchten zunächst die Nanomechanik einer ku...

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biomoleküle unterliegen kleinen und schnellen strukturellen Veränderungen, oft als Reaktion auf Krafteinwirkungen. Hochauflösende magnetische Pinzetten können diese Dynamik unter physiologisch relevanten Kräften erforschen. Da die Methode nanoskalige Messungen mit einer Genauigkeit von Millisekunden durchführt, ist es möglich, subtile Veränderungen von Nukleinsäuren und Proteinen in Echtzeit zu überwachen.Fehlfunktionen von ersttragenden und mechanosensitiven Proteinen können potenziell zu Herz-Kreislauf- und Muskel-Skelett-Erkrankungen führen. Eine magnetische Pinzette kann Aufschluss über die Wirkmechanismen dieser Proteine geben. Das Set muss richtig ausgerichtet und kalibriert sein, um gute Auflösungen zu erhalten.Auch bei der Vorbereitung und Identifizierung von molekularen Konstrukten für Messungen ist Vorsicht geboten. Beginnen Sie damit, ein inverses Mikroskop auf einem schwingungsdämpfenden optischen Tisch aufzustellen. Installieren Sie als Nächstes eine Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera und einen Framegrabber.Montieren Sie einen motorisierten Lineartisch mit mehr als 20 Millimetern Verfahrweg vertikal auf einem manuellen XY-Tisch, um einen Translationstisch für die Magnetm

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von magnetischen Pinzette, um die Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse auf der Ebene einzelner Moleküle in einem hoch parallelisierbaren Weise zu studieren.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

Magnetische Pinzette, ein leistungsfähiges Einzelmolekül-Manipulation Technik kann für die direkte Messung der Verdrehung angepasst werden (unter Verwendung einer Konfiguration mit der Bezeichnung frei umlaufenden magnetischen Pinzette) und Drehmoment (mit einer Konfigurations bezeichnet magnetischen Drehmoment Pinzette) in biologischen Makromolekülen. Richtlinien zur Durchführung solcher Messungen gegeben sind, einschließlich Anwendungen auf die Untersuchung von DNA und zugehörige...

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die intrazellulären mechanischen Eigenschaften isolierter embryonaler Zebrafischzellen im dreidimensionalen Einschluss mit direkter Kraftmessung durch eine optische Falle zu untersuchen.

Direkte Kraftmessungen der subzellulären Mechanik im Einschluss mit optischen Pinzetten

Die Magnetkraftmikroskopie (MFM) verwendet eine vertikal magnetisierte Rasterkraftmikroskopiesonde, um die Probentopographie und die lokale Magnetfeldstärke mit nanoskaliger Auflösung zu messen. Die Optimierung der räumlichen Auflösung und Empfindlichkeit von MFM erfordert ein ausgewogenes Verhältnis zwischen abnehmender Hubhöhe und zunehmender Antriebsamplitude (Oszillation) und profitiert vom Betrieb in einem Handschuhfach mit inerter Atmosphäre.

Optimierung der Auflösung und Empfindlichkeit der Magnetkraftmikroskopie zur Visualisierung nanoskaliger magnetischer Domänen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer magnetischen Einzelmolekülpinzette zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen telomeren DNA-bindenden Proteinen (Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 [TRF1] und TRF2) und langen Telomeren, die aus menschlichen Zellen extrahiert wurden. Es beschreibt die Vorbereitungsschritte für Telomere und telomerische Repeat-Bindungsfaktoren, die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten sowie die Methoden der Datenerhebung und -analyse.

Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Hier präsentieren wir ein Protokoll der gesamten Zelle elektrochemische Experimente, den Beitrag der PROTONENTRANSPORT, die Rate der extrazellulären Elektronentransport über die äußere Membran Zellfarbstoffe Komplex in Shewanella Oneidensis MR-1 zu studieren.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Erfahren Sie, wie hochgeschwindige Magnetpinzetten nanomechanische Messungen an DNA-Hairpins und SNARE-Komplexen mit 1,2 kHz durchführen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Einblicke in mechanobiologische Prozesse kraftempfindlicher Biomoleküle.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

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