Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe
28. Juli 2023
Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.
Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen von Keloiden. Fibroblasten aus Keloidgewebe können durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann. Beginnen Sie mit einer sterilen Pinzette, um das Keloidgewebe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu geben, das 10 bis 25 Milliliter PBS enthält, das mit 1 % PSA angereichert ist.
In der Zwischenzeit fügen Sie vier Milliliter PBS-PSA-Lösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu. Nehmen Sie nun das Gewebe aus der Tube und waschen Sie es zweimal mit PBS-PSA-Lösung. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette nacheinander von einer Vertiefung in die nächste.
Entfernen Sie dann die Fett- und Epidermisschichten mit einer chirurgischen Schere, wobei die Dermis unberührt bleibt. Verwenden Sie eine Schere, um die getrimmte Dermis in drei bis fünf Quadratmillimeter große Stücke zu zerlegen und die Stücke mit einer sterilen Pinzette in die nächste Vertiefung zu übertragen. Waschen Sie die Stücke in PBS PSA-Lösung.
Legen Sie mit einer sterilisierten Pinzette 10 bis 30 Dermisgewebestücke mit einem Abstand von weniger als fünf Millimetern in Petrischalen. Stellen Sie die Schalen kopfüber in einen Inkubator, bis die Stücke trocken sind und an der Schale kleben. Als nächstes fügen Sie sieben Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSA, und inkubieren Sie die Schalen wie zuvor.
Nach drei Tagen wird die Hälfte des Überstandes durch ein vollständiges Nährmedium ersetzt. Beobachten Sie die Fibroblasten täglich unter 40-facher mikroskopischer Vergrößerung. Entfernen Sie die Gewebestücke im Kulturmedium, wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 90 % erreichen.
Waschen Sie die Fibroblasten in PBS und fügen Sie zwei Milliliter sterile Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Nachdem Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator inkubiert haben, klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzu, um die Verdauung zu beenden, sobald sich die meisten Zellen abgelöst haben.
Füllen Sie nun die Zellsuspension in ein steriles 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Medium. Säen Sie die Fibroblasten in eine neun Zentimeter große Zellkulturschale und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator.
Um eine Immunfluoreszenzanalyse durchzuführen, nachdem die Fibroblasten auf runden Deckgläsern kultiviert und in primären und sekundären Antikörpern inkubiert wurden, geben Sie 50 Mikroliter DAPI-Lösung in den Objektträger, um die Zellkerne zu färben. Legen Sie die gewaschenen Deckgläser mit einer Pinzette auf Objektträger. Zum Schluss überführen Sie die Proben in eine feuchte Dunkelbox für die Fluoreszenzmikroskopie.
Fibroblastenauswüchse des Gewebes wurden fünf Tage nach der Verarbeitung beobachtet. Die Fibroblasten zeigten hohe Proliferationsraten und erreichten nach 10 Tagen eine Konfluenz. Die Fibroblasten besaßen längliche und spindelartige Zellkörper, die in Bündeln mit hoher Konfluenz angeordnet waren.
Die Immunfluoreszenzfärbung ergab eine positive rote Immunfluoreszenz der Fibroblasten und eine blaue Immunfluoreszenz des Zellkerns. Durchflusszytometrische Assays zeigten CD90-Positivität in fast allen Fibroblasten. Diese Studie hat eine optimierte Methode beschrieben und klare Anweisungen gegeben, um bestehende Herausforderungen zu lösen und die Erfolgschancen für die Isolierung und Kultur von Keloid-Fibroblasten zu erhöhen.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Gewinnung primärer Fibroblasten aus Keloidgewebe, das reinen und vitalen Fibroblasten effektiv und stabil liefern kann. Die Isolierung und Kultivierung dieser Fibroblasten ist entscheidend, um die Keloidforschung voranzutreiben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellkultur
- Isolierung von Fibroblasten
- Forschung zu Keloiden
Hintergrund
- Keloidale Narben sind abnormale Narben, die schwierig zu untersuchen sind.
- Primäre Fibroblasten sind entscheidend für das Verständnis der Biologie keloidaler Narben.
- Bestehende Protokolle liefern möglicherweise nicht ausreichende Zellviabilität.
- Diese Studie zielt darauf ab, den Isolationsprozess zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Fibroblasten aus Keloidgewebe etablieren.
- Eine stabile Quelle für Fibroblasten für die Laborforschung bereitstellen.
- Das Verständnis der Keloidbildung und -behandlung verbessern.
Verwendete Methoden
- Verwendung steriler Pinzetten und Zentrifugenröhrchen für die Gewebeprobeentnahme.
- Waschen des Keloidegewebes mit PBS, ergänzt mit 1 % PSA.
- Reihumübertragung des Gewebes zwischen den Vertiefungen einer sechslochigen Platte.
- Einrichtung der Kulturbedingungen für das Wachstum von Fibroblasten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung lebensfähiger Fibroblasten aus Keloidgewebe.
- Das Protokoll bietet eine reichliche Zellquelle für die Forschung.
- Fibroblasten behielten über die Zeit Stabilität und Lebensfähigkeit bei.
- Erleichterte weitere Untersuchungen zur Keloidbiologie.
Schlussfolgerungen
- Das optimierte Protokoll ist wirksam für die Isolierung von Fibroblasten.
- Bietet eine Grundlage für zukünftige Forschung zu Keloide.
- Erhöht das Potenzial für therapeutische Fortschritte in der Behandlung von Keloide.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die zuverlässige Isolierung und Kultur primärer dermaler Fibroblasten aus Keloidgewebe trägt einem entscheidenden Bedarf an krankheitsrelevanten zellulären Modellen in der frühen Arzneimittelforschung Rechnung. Dieses Protokoll ermöglicht einen konsistenten Zugang zu reinen, validierten Fibroblastenpopulationen und unterstützt damit mechanistische Studien sowie die Validierung von Zielstrukturen bei fibrotischen Hauterkrankungen. Die Methode erhöht das Vorhersagevermögen und gewährleistet eine translationale Kontinuität bei der Prüfung therapeutischer Hypothesen in Forschungsprojekten zu Keloide.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung fibroblastenvermittelter Signalwege, die an der Pathogenese von Keloide beteiligt sind.
- Unterstützt die biologische Ent风险bewertung durch bereitgestellte funktionell validierte primäre Zellen.
- Erleichtert mechanistische Studien zur Klärung der Zielrelevanz bei fibrotischen Erkrankungen.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit für frühe Portfolio-Triage-Entscheidungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert eine reproduzierbare Quelle primärer Fibroblasten zur Standardisierung von Assays.
- Ermöglicht die Entwicklung quantitativer, zellbasierter Assays zur Evaluierung von Substanzen.
- Unterstützt Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit in Screening-Workflows.
- Verringert die Variabilität, indem Kontaminationen und Beimischungen von Nicht-Fibroblasten minimiert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt in vitro-Modelle mit krankheitsrelevanten menschlichen Zelltypen für translationsmedizinische Studien ab.
- Ermöglicht die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung in der Keloid-Forschung.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von antifibrotischen Kandidaten.
- Bietet eine Plattform für die Entdeckung und Validierung von Biomarkern, wenn sie durch nachgeschaltete Studien unterstützt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll verortet die Isolierung primärer keloider Fibroblasten an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und präklinischer Forschung und ermöglicht eine robuste Zielvalidierung sowie die Entwicklung von Assays für Pipelines zur Behandlung fibrotischer Hauterkrankungen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen bei der Pathogenese von Keloiden.
- Screening: Bietet validierte, reproduzierbare Zellsysteme zur Entwicklung quantitativer Assays.
- Analytik: Ermöglicht die Charakterisierung mittels Immunfluoreszenz und flusszytometrischer Analysen zur Bestätigung der Zellidentität.
- Translationale Forschung: Stellt zelluläre Modelle bereit, die krankheitsrelevante Bedingungen abbilden und für die präklinische Evaluierung von Wirkstoffkandidaten geeignet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen standardisierten Protokollablauf, der für verschiedene Forschungsteams und Projekte angepasst werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unklarheiten in der Keloid-Forschung.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Workflows mit primären Zellen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Qualität von Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz in frühen Programmphasen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von anti-fibrotischen Wirkstoffen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnis in der sterilen Gewebehandhabung und in Techniken der Primärzellkultur.
- Benötigt Zugang zu Zellkulturlaboren sowie Instrumenten für Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um eine reproduzierbare Zellisolierung und -charakterisierung zu gewährleisten.
- Kann eine Anpassung an andere fibrotische oder dermale Gewebeproben erfordern.
- Mögliche Einschränkungen umfassen die Variabilität der Spender und die Verfügbarkeit des Gewebes.
