Name: Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Lernen Sie die optimierte Isolierung und Kultivierung primärer Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe. Dieses Protokoll liefert reine, lebensfähige Zellen für die Keloidforschung und ermöglicht Studien zur Narbenbildung.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Fördernummern 81903189 und 82073418) und der Science and Technology Foundation of Guangzhou (Fördernummer 202102020025) unterstützt.

Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Dermatologischen Krankenhauses der Southern Medical University (2020081) genehmigt. Die informierte Einwilligung der Patienten wurde eingeholt, bevor Gewebe von den Personen entnommen wurde.
1. Vorbereitung
HINWEIS: Die folgenden Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
<ol><li>Bereiten Sie ein vollständiges Nährmedium vor, indem Sie 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Lösung (PSA) zu Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit PSA zu, indem Sie 1 % PSA in 1x PBS geben. Bereiten Sie PBS mit FBS zu, indem Sie 1% FBS zu 1x PBS hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie mehrere sterilisierte Scheren, Pinzetten und Skalpelle durch Autoklavieren vor.</li>
</ol>2. Entnahme von entferntem Gewebe
<ol><li>Entnahme von Gewebe von Keloidpatienten durch Operation. Sammeln Sie das frische Keloidgewebe in einem sterilen Verpackungsbeutel oder sterilen Zentrifugenröhrchen und überführen Sie es so schnell wie möglich in eine biologische Sicherheitswerkbank im Labor. HINWEIS: In diesem Protokoll betrug die Größe des erworbenen Keloidgewebes ungefähr ~20 x 20 x 10 mm3, und die Größe kann je nach Operation variieren.</li>
</ol>3. Isolierung
<ol><li>Nehmen Sie das Keloidgewebe mit einer sterilen Pinzette heraus und legen Sie es 10 Minuten lang in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das 10-25 ml PBS mit 1 % PSA enthält. Bereiten Sie dann eine 6-Well-Platte vor und geben Sie 4 ml PBS, ergänzt mit 1% PSA, in jede Well. Nehmen Sie das Taschentuch mit einer sterilisierten Pinzette heraus und waschen Sie es zweimal mit PBS, das mit 1% PSA ergänzt ist. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette nacheinander von einer Vertiefung in die nächste.</li>
	<li>Entfernen Sie die Fett- und Epidermisschichten mit einer chirurgischen Schere oder einem chirurgischen Skalpell und lassen Sie die Dermisschicht unberührt. Schneiden und präparieren Sie die Dermisschicht mit einer Schere in 3-5 mm2 Stücke, übertragen Sie diese Stücke mit einer sterilen Pinzette in die nächste Vertiefung und waschen Sie sie erneut in PBS mit 1%iger PSA-Lösung.</li>
</ol>4. Kultur
<ol><li>Legen Sie die Dermisgewebestücke mit sterilisierten Pinzetten in Petrischalen; Achten Sie darauf, dass die Stückzahl zwischen 10 und 30 liegt und der Abstand zwischen den einzelnen Teilen >5 mm beträgt. Stellen Sie die Petrischalen kopfüber in einen 5% CO2 -Inkubator bei 37 °C für 30-60 min, bis die Gewebestücke etwas getrocknet sind und an der Petrischale haften. Dann wird DMEM mit 10 % FBS und 1 % PSA versetzt und die Petrischalen vorsichtig in einen 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C gestellt. HINWEIS: Fibroblasten sind eine morphologisch und funktionell heterogene Zellpopulation. In Anbetracht dieser Komplexität sollten die Isolations- und Kulturschritte mit Vorsicht durchgeführt werden. Wählen Sie die keloiden Hautgewebestücke gleichmäßig aus und mischen Sie diese Stücke gut, bevor Sie sie in die Petrischale legen.</li>
	<li>Nach 3 Tagen wird die Hälfte des Überstandes durch ein vollständiges Nährmedium ersetzt. Wechseln Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage. Beobachten Sie die Fibroblasten täglich unter dem Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung. HINWEIS: Alle Schritte sollten vorsichtig ausgeführt werden. Bewegen Sie die Petrischale nach der Isolierung 2 Tage lang nicht, da die Gewebestücke Zeit brauchen, um an den Petrischalen zu haften.</li>
	<li>Wenn die Fibroblasten, die um die Gewebestücke herum wachsen, eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht haben, entfernen Sie die Gewebestücke und das Kulturmedium. Waschen Sie die Fibroblasten mit sterilem 1x PBS und geben Sie 2 ml sterile 1x Trypsin-EDTA-Lösung auf die Platten. Inkubieren Sie die Zellen für ca. ~3-5 min bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2 - Inkubator. Klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Wenn sich die Mehrheit der Zellen von der Platte löst, fügen Sie 2 ml des vollständigen Mediums hinzu, um den Verdauungsprozess zu beenden.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen bei 300 × g 3 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet im vollständigen Medium. Die Fibroblasten werden in eine 9-cm-Zellkulturschale ausgesät und bei 37 °C in einem befeuchteten 5%igen CO2 -Inkubator inkubiert.</li>
</ol>5. Wartung und Konservierung
<ol><li>Etwa 3-4 Tage später, wenn die Fibroblasten auf 80% Konfluenz angewachsen sind, wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 und passieren Sie die Fibroblasten in einem Verhältnis von 1:3. Verwenden Sie die durchgelassenen Fibroblasten für weitere Experimente. HINWEIS: Die Fibroblastenkultur sollte nach 10 Passagen abgebrochen werden, da die Zellen im Vergleich zu den ursprünglichen Zellen veränderte Eigenschaften aufweisen können.</li>
	<li>Kryokonservierung der durchgelassenen Zellen von P1-P3 in flüssigem Stickstoff für die weitere Verwendung.<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.3. Die Zellsuspension wird in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und das Röhrchen 3 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Zellgefriermedium, das 90 % FBS und 10 % DMSO enthält, und überführen Sie die Suspension in Zellkryoröhrchen.</li>
		<li>Legen Sie die Zellen in eine gefrorene Schachtel und legen Sie die gefrorene Schachtel dann in einen Gefrierschrank bei −80 °C. Nach 1 Tag werden die Zellen zur Langzeitkonservierung in flüssigen Stickstoff überführt.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Identifizierung von Fibroblasten durch Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Legen Sie runde Deckgläser in eine 24-Well-Platte und kultivieren Sie die durchgelassenen Fibroblasten bei einer Konzentration von 1 × 104 Zellen/Well. Wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 60 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium. Fügen Sie 1 ml 4%iges Paraformaldehyd hinzu, um die Fibroblasten 20 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren, und waschen Sie sie 3x mit PBS für jeweils 1 Minute. HINWEIS: Zählen Sie die Anzahl der Zellen, indem Sie einen Hämozytometer-Objektträger unter einem Mikroskop oder einen automatischen Zellzähler verwenden.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS, inkubieren Sie es mit 0,5 % Triton X-100 für 20 Minuten für die Permeabilisierung der Zellmembranen und waschen Sie es dann 3x mit PBS für jeweils 1 Minute. PBS mit 0,5 % Rinderserumalbumin hinzufügen und 30 Minuten einweichen lassen. Entfernen Sie es dann und fügen Sie den PDGFR-α/Vimentin-Antikörper hinzu, der in einem Verdünnungsmittel von 1:1.000 verdünnt ist. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie am nächsten Tag den primären Antikörper, waschen Sie die Zellen 3x mit PBS für 3 Minuten und fügen Sie den sekundären Antikörper Alexa Fluor-555 Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG hinzu, der mit dem Antikörperverdünnungsmittel bei 1:200 verdünnt ist, um ihn 1 h lang einzuweichen.</li>
	<li>Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Nehmen Sie die runden Deckgläser mit einer Pinzette heraus, legen Sie sie auf Objektträger und fügen Sie 50 μl 5 μg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Lösung hinzu, um die Zellkerne zu färben. Bewahren Sie die Proben in einer feuchten, dunklen Box auf und beobachten Sie sie unter einem konfokalen Laserfluoreszenzmikroskop. HINWEIS: Fügen Sie eine negative Kontrollgruppe ohne Primärantikörper, aber mit einem Sekundärantikörper hinzu, um eine unspezifische Färbung auszuschließen.</li>
</ol>7. Identifizierung von Fibroblasten mittels Durchflusszytometrie
<ol><li>Das Zellpellet wird in ein steriles 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen aufgefangen und mit 50 μl PBS mit 1 % FBS resuspendiert. Inkubieren Sie mit Anti-CD90 für 30 Minuten im Dunkeln und fügen Sie der Kontrollgruppe eine Anti-IgG-Isotyp-Kontrolle hinzu. Dann werden 200 μl PBS mit 1 % FBS zugegeben und das Röhrchen 10 Minuten lang bei 300 × g bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 μl PBS mit 1 % FBS hinzu. Resuspendieren und filtrieren Sie die Suspension durch ein Zellsieb (70 mesh). Eine 5 μg/ml Stammlösung von DAPI im Verhältnis 1:100 in das Filtrat geben und dann die Ergebnisse durch Durchflusszytometrie erfassen. Legen Sie die Vorwärtsstreuung (FSC) als Abszisse und die Seitenstreuung (SSC) als Ordinate fest, und kreisen Sie die Hauptzellenpopulation ein. Wählen Sie die Zellpopulation aus, und legen Sie das Phycoerythrin als Abszisse und die Anzahl als Ordinate für die Analyse fest.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Chinese+keloid+patients+identifies+novel+causative+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes.</a> Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).</li>
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<li>Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatments+in+the+management+of+keloids+and+hypertrophic+scars%3A+A+critically+appraised+topic%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic.</a> British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).</li>
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<li>Supp, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+studies+of+keloid+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Animal models for studies of keloid scarring.</a> Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).</li>
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<li>Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+%28ATF3%29+regulates+cell+growth%2C+apoptosis%2C+invasion+and+collagen+synthesis+in+keloid+fibroblast+through+transforming+growth+factor+beta+%28TGF-beta%29%2FSMAD+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway.</a> Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).</li>
<li>Sato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditioned+medium+obtained+from+amnion-derived+mesenchymal+stem+cell+culture+prevents+activation+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+explant+culture%3A+An+improved+method+for+consistently+harvesting+homogeneous+populations+of+keloid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts.</a> Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+glucose+metabolism+and+cell+function+in+keloid+fibroblasts+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia.</a> Redox Biology. 38, 101815(2021).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+integration+analysis+reveals+the+correlation+between+mesenchymal+stromal+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts.</a> Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).</li>
<li>Yao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+PDGFR%CE%B1+regulates+the+fibroblast-to-myofibroblast+transition+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing.</a> Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).</li>
<li>Domdey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consecutive+dosing+of+UVB+irradiation+induces+loss+of+ABCB5+expression+and+activation+of+EMT+and+fibrosis+proteins+in+limbal+epithelial+cells+similar+to+pterygium+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium.</a> Stem Cell Research. 40, 102936(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubular+epithelial+cell+necroptosis+promotes+tubulointerstitial+fibrosis+in+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease.</a> FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).</li>
<li>Korosec, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+identity+and+location+within+the+dermis+determine+the+function+of+papillary+and+reticular+fibroblasts+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).</li>
</ol>

Es sind keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe ist eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung. Bisher gab es zwei Methoden zur Gewinnung primärer Fibroblasten: Enzymverdau und Explantatkultur11,12,13,14. Beide traditionellen Methoden haben jedoch Einschränkungen, wie z. B. die Anfälligkeit für Kontamination, die Vermischung mit anderen Zelltypen, eine lange Kulturzeit und eine ...

Keloid, eine fibroproliferative Erkrankung, manifestiert sich durch das kontinuierliche Wachstum von Plaques, die oft ohne Selbstbeschränkung in die umgebende normale Haut eindringen und bei den Patienten verschiedene Grade von Juckreiz, Schmerzen sowie kosmetischen und psychischen Belastungen verursachen1. Fibroblasten, die primären Zellen, die an Keloiden beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Krankheit durch übermäßige Proliferation, redundante extrazelluläre Matrixproduktion und desorganisierte Kollagene 2,3. Die zugrundeliegende Pathogenese ist jedoch noch unklar, und es fehlt noch an einer wirksamen therapeutischen Methode für Keloide; Daher besteht dringender Bedarf an weiterer Forschung 4,5.
Da es kein ideales Tiermodell für die Keloidforschung in vivo gibt 6,7, kann der Aufbau eines In-vitro-Modells durch die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben die Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit für die Keloidforschung bieten 2,6. Primärzellen sind solche, die direkt aus lebendem Gewebe stammen, und es ist allgemein anerkannt, dass diese Zellen dem physiologischen Zustand und dem genetischen Hintergrund mehrerer Individuen im Vergleich zu Zelllinien ähnlicher sein können 8,9. Die Kultivierung von Primärzellen bietet ein leistungsfähiges Mittel, um das Wachstum und den Stoffwechsel von Zellen sowie andere Zellphänotypen zu untersuchen.
Derzeit gibt es zwei Methoden zur Gewinnung von primären Fibroblasten: den Enzymverdau und die Explantatkultur. Es wurden jedoch mehrere Hindernisse für die Gewinnung von primären Fibroblasten identifiziert, wie z. B. das Risiko einer Kontamination durch verschiedene Bakterien oder Pilze, die Vermischung mit anderen Zelltypen, die nicht leicht zu entfernen sind, die lange Dauer des Kulturzyklus, die anschließenden Veränderungen der Zelleigenschaften im Vergleich zu den ursprünglichen Zellen usw. 9. Daher ist die Entwicklung eines praktikablen und effektiven Verfahrens zur Gewinnung primärer Fibroblasten die Grundlage für weitere Studien und Anwendungen. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Extraktion von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, das effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen kann.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL steriles Zentrifugenröhrchen</td><td>JETBIOFIL</td><td>CFT002015</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steriles Zentrifugenröhrchen</td><td>JETBIOFIL</td><td>8076</td><td></td></tr><tr><td>4% Polyformaldehyd</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0099</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>50 mL steriles Zentrifugenröhrchen</td><td>JETBIOFIL</td><td>8081</td><td>Put Keloidgewebe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-555 Ziege Anti-Kaninchen IgG&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Alexa&nbsp; Fluor&nbsp; 555&nbsp;</td><td>Zweiter Antikörper für Immunfluoreszenz-Färbeassay</td></tr><tr><td>Anti-Human-CD90</td><td>BioLegend</td><td>B301002</td><td>Identifizieren Sie die Reinheit von Fibroblasten</td></tr><tr><td>Antikörper-Verdünnungsmittel</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0262</td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Serie A2</td><td>Isolierungs- und Kulturzellen</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin,</td><td>Aladdin</td><td>B265993</td><td>Blockierung für Immunfluoreszenz-Färbeassay</td></tr><tr><td>Kohlendioxid-Inkubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td>Verwendung für die Kultivierung</td></tr><tr><td>von Zellen Kryoröhrchen</td><td>Corning</td><td>43513</td><td>Lagern Sie die Zellen in einer</td>Niedertemperatur-Zentrifugalmaschine</tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>ST 16R</td><td>Überstand ablegen&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C1006</td><td>Färbung des Zellkerns</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td>Verwendung von</td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium</td> zur Konservierung <td>von Zellen Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Kulturmedium Lösung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>BI</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>BD FACSCelesta</td><td>Beobachtung die Identität von Zellen</td></tr><tr><td>Tiefkühlbox</td><td>Thermo Scientific</td><td> 5100-0050</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Lasermikroskop</td><td>Nikon</td><td>AIR-HD25</td><td>Beobachtung des Immunfluoreszenz-Färbeassays</td></tr><tr><td>PDGFR-& alpha-Antikörper</td><td>CST</td><td>3174T</td><td>Erster Antikörper für Immunfluoreszenz-Färbeassay</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Am-Lösung</td><td>Solarbio</td><td>P1410</td><td>Zugabe von Nährmedium zur Vermeidung von Kontamination</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>JETBIOFIL</td><td>7556</td><td>Kulturfibroblasten</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Nährmedium</td></tr><tr><td>Kaninchen (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5742S</td><td>Als Kontrolle für die Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Runddeckglas</td><td>Biosharp</td><td>801007</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Löcher in die Zellmembran stanzen</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Wird für die Passage von Zellen</td></tr><tr><td>verwendet Vimentin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab8978</td><td>Erster Antikörper für Immunfluoreszenz-Färbeassay</td></tr></tbody></table>

isolierung, kultivierung und charakterisierung von primären dermalen fibroblasten aus humanem keloidgewebe

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasten, der wichtigste Zelltyp im Keloidgewebe, spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung und Entwicklung von Keloiden. Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen der biologischen Funktion und der molekularen Mechanismen von Keloiden sowie für neue therapeutische Strategien zu ihrer Behandlung. Die traditionelle Methode zur Gewinnung primärer Fibroblasten hat Einschränkungen, wie z. B. einen schlechten Zellzustand, eine Vermischung mit anderen Zelltypen und eine Anfälligkeit für Kontamination. In diesem Artikel wird ein optimiertes und leicht reproduzierbares Protokoll beschrieben, das das Auftreten möglicher Probleme bei der Gewinnung von Fibroblasten reduzieren könnte. In diesem Protokoll können Fibroblasten 5 Tage nach der Isolierung beobachtet werden und erreichen nach 10 Tagen Kultur eine Konfluenz von fast 80 %. Anschließend werden die Fibroblasten mit PDGFRα- und Vimentin-Antikörpern für Immunfluoreszenz-Assays und CD90-Antikörpern für die Durchflusszytometrie verifiziert und verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fibroblasten aus Keloidgewebe durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden können, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann.

Der zeitliche Ablauf des Protokolls ist in Abbildung 1A zusammengefasst. Einige repräsentative Bilder des Isolationsprozesses sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Epidermis- und Fettschichten wurden vorsichtig entfernt, und die Dermisschicht wurde in kleine Fragmente von 3-4 mm2 getrennt, die in die Petrischalen inokuliert wurden.
Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurden 5 Tage nach der Verarbei...

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...

Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen von Keloiden. Fibroblasten aus Keloidgewebe können durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann. Beginnen Sie mit einer sterilen Pinzette, um das Keloidgewebe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu geben, das 10 bis 25 Milliliter PBS enthält, das mit 1 % PSA angereichert ist.In der Zwischenzeit fügen Sie vier Milliliter PBS-PSA-Lösung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte hinzu. Nehmen Sie nun das Gewebe aus der Tube und waschen Sie es zweimal mit PBS-PSA-Lösung. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette nacheinander von einer Vertiefung in die nächste.Entfernen Sie dann die Fett- und Epidermisschichten mit einer chirurgischen Schere, wobei die Dermis unberührt bleibt. Verwenden Sie eine Schere, um die getrimmte Dermis in drei bis fünf Quadratmillimeter große Stücke zu zerlegen und die Stücke mit einer sterilen Pinzette in die nächste Vertiefung zu übertragen. Waschen Sie die Stücke in PBS PSA-Lösung.Legen Sie mit einer sterilisierten Pinzette 10 bis 30 Dermisgewebestücke mit einem Abstand von weniger als fünf Millimetern in Petrischalen. Stellen Sie die Schalen kopfüber in einen Inkubator, bis die Stücke trocken sind und an der Schale kleben. Als nächstes fügen Sie sieben Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSA, und inkubieren Sie die Schalen wie zuvor.Nach drei Tagen wird die Hälfte des Überstandes durch ein vollständiges Nährmedium ersetzt. Beobachten Sie die Fibroblasten täglich unter 40-facher mikroskopischer Vergrößerung. Entfernen Sie die Gewebestücke im Kulturmedium, wenn die Fibroblasten eine Konfluenz von 90 % erreichen.Waschen Sie die Fibroblasten in PBS und fügen Sie zwei Milliliter sterile Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Nachdem Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator inkubiert haben, klopfen Sie vorsichtig auf die Kulturschale und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. Fügen Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzu, um die Verdauung zu beenden, sobald sich die meisten Zellen abgelöst haben.Füllen Sie nun die Zellsuspension in ein steriles 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen um und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Zellpellet in vollständigem Medium. Säen Sie die Fibroblasten in eine neun Zentimeter große Zellkulturschale und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator.Um eine Immunfluoreszenzanalyse durchzuführen, nachdem die Fibroblasten auf runden Deckgläsern kultiviert und in primären und sekundären Antikörpern inkubiert wurden, geben Sie 50 Mikroliter DAPI-Lösung in den Objektträger, um die Zellkerne zu färben. Legen Sie die gewaschenen Deckgläser mit einer Pinzette auf Objektträger. Zum Schluss überführen Sie die Proben in eine feuchte Dunkelbox für die Fluoreszenzmikroskopie.Fibroblastenauswüchse des Gewebes wurden fünf Tage nach der Verarbeitung beobachtet. Die Fibroblasten zeigten hohe Proliferationsraten und erreichten nach 10 Tagen eine Konfluenz. Die Fibroblasten besaßen längliche und spindelartige Zellkörper, die in Bündeln mit hoher Konfluenz angeordnet waren.Die Immunfluoreszenzfärbung ergab eine positive rote Immunfluoreszenz der Fibroblasten und eine blaue Immunfluoreszenz des Zellkerns. Durchflusszytometrische Assays zeigten CD90-Positivität in fast allen Fibroblasten. Diese Studie hat eine optimierte Methode beschrieben und klare Anweisungen gegeben, um bestehende Herausforderungen zu lösen und die Erfolgschancen für die Isolierung und Kultur von Keloid-Fibroblasten zu erhöhen.

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Eine schnelle und robuste Lösung zur Isolierung von lebensfähigen Erwachsenen epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut beschrieben wird. Das Verfahren nutzt enzymatische Verdauung der Haut Kollagen-Matrix, durch Zupfen der Haarfollikel und Isolierung von einzelnen Zellsuspensionen oder Gewebestücke für die Zellkultur gefolgt.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

Die Fibroblasten Explantatkultur Protokoll aus der menschlichen Haut Stanzbiopsien ist eine technisch robuste und einfache Weise abzuleiten Hautzellen innerhalb von 4-8 Wochen für Banken von etwa 15-20 Millionen Zellen auf einem niedrigen Durchgang Nummer.

Haut Stanzbiopsie Explantatkultur für die Ableitung des primären humanen Fibroblasten

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von Schwann-Zellen aus menschlichem Dermisgewebe. Die menschliche Dermis enthält verschiedene Zelltypen, darunter Fibroblasten und Schwann-Zellen. Nach der Isolierung werden die Zellen mit einem Antimitotikum behandelt, um proliferierende Fibroblasten zu eliminieren, was zu einer Reinkultur von Schwann-Zellen führt.

Isolierung und Kultivierung von primären Schwann-Zellen aus einer humanen Dermis

Wir berichten über eine Methode, um naive multipotent Haut stammenden Vorläufer (SKP) Zellen aus primären humanen Fibroblasten Kulturen zu isolieren. Wir zeigen, dass diese SKPs von Fibroblastenkulturen abgeleitet ähnliche Stammzellen Eigenschaften teilen, die, die direkt aus der menschlichen Haut Biopsien abgeleitet. Diese Zellen exprimieren die Neuralleisten Marker Nestin, zusätzlich zu der multipotenten Marker wie OCT4 und Nanog.

Naive Adult Stem Cells Isolation von primären humanen Fibroblasten Kulturen

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe effizient zu isolieren. Diese Methode vereinfacht das konventionelle Verfahren mithilfe der ROCK-Inhibitor Y-27632 Mittel-und Impfung spontan Epidermiszellen von dermalen Zellen zu trennen.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Dieses Manuskript beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von papillären und Netzfibroblasten von der menschlichen Haut. Sie umgeht in der vitro-Kultur, die mit dem häufig verwendeten Isolationsprotokoll über Explantationskulturen unvermeidlich war. Die ausstrahlenden fibroblasten Untersätze sind funktional unterscheidbar und zeigen eine differenzierte Genexpression und Lokalisierung innerhalb der Dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen. Eine Bewertungsmethode unter Verwendung von Immunfärbung wird ebenfalls berichtet.

Isolierung und Kultur von primären oralen Keratinozyten aus dem erwachsenen Mausgaumen

Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.

Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

Die Untersuchung der Wundheilung im Zusammenhang mit Muskel-Skelett-Verletzungen erfordert oft die Beurteilung von In-vitro-Interaktionen zwischen Schwann-Zellen (SCs), Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung dieser Primärzellen aus der menschlichen Vorhaut.

Isolierung, Kultur und Charakterisierung von primären Schwann-Zellen, Keratinozyten und Fibroblasten aus der menschlichen Vorhaut

Lernen Sie die optimierte Isolierung und Kultivierung primärer Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe. Dieses Protokoll liefert reine, lebensfähige Zellen für die Keloidforschung und ermöglicht Studien zur Narbenbildung.

Isolierung, Kultivierung und Charakterisierung von primären dermalen Fibroblasten aus humanem Keloidgewebe

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