Name: Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Verarbeitung von Zitrusblütenholz mit dem Budwood Tissue Extractor zur schnellen Krankheitserreger-Erkennung. Diese kostengünstige Methode steigert den Durchsatz und verbessert die Testqualität.

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Die Autoren erkennen das Volk der Cahuilla als die traditionellen Hüter des Landes an, auf dem die experimentelle Arbeit durchgeführt wurde. Wir danken Professor Norman Ellstrand von der University of California, Riverside, für die Bereitstellung von Laborräumen für die Durchführung von Forschungsaktivitäten für dieses Projekt im Rahmen der UCR California Agriculture and Food Enterprise (CAFÉ) Initiative. Diese Forschung wurde durch das CDFA - Specialty Crop Block Grant Program (Grant Nr. 18-0001-055-SC) unterstützt. Zusätzliche Unterstützung kam auch durch das CRB-Projekt 6100; USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-Projekt 1020106; und der National Clean Plant Network-USDA Animal and Plant Health Inspection Service (AP17PPQS&T00C118, AP18PPQS&T00C107, AP19PPQS&T00C148, & AP20PPQS&T00C049) an Georgios Vidalakis.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Mit dem Aufkommen der HLB-Zitruskrankheit wurden die Zitrusindustrie, die Zulassungsbehörden und die Diagnoselabore aufgefordert, sich auf Nukleinsäureextraktionsmethoden mit hohem Durchsatz in Kombination mit manueller Probenverarbeitung mit niedrigem Durchsatz und Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie qPCR34 für die Untersuchung einzelner Bäume in Kombination mit Krankheitsmanagementpraktikenzu verlassen 35. Die HLB-Positivitätsrate in Kalifornien ist von 0,01 % ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65159">Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering</a>. The Authors section was updated from:
Deborah Pagliaccia1,6 
Douglas Hill2 
Emily Dang1 
Gerardo Uribe1 
Agustina De Francesco1 
Ryan Milton2 
Anthony De La Torre2 
Axel Mounkam2 
Tyler Dang1 
Sohrab Botaghi1 
Irene Lavagi-Craddock1 
Alexandra Syed1 
William Grover3 
Adriann Okamba4,5 
Georgios Vidalakis2 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside 
2Technology Evolving Solutions (TES) 
3Department of Bioengineering, University of California Riverside 
4Ecole Sup&#233;rieure d&#39;Ing&#233;nieurs L&#233;onard de Vinci ESILV 
5University of California Riverside 
6California Agriculture and Food Enterprise (CAF&#201;), University of California Riverside
to:
Deborah Pagliaccia1,6 
Douglas Hill2 
Emily Dang1 
Gerardo Uribe1 
Agustina De Francesco1 
Ryan Milton2 
Anthony De La Torre2 
Axel Mounkam2 
Tyler Dang1 
Sohrab Bodaghi1 
Irene Lavagi-Craddock1 
Alexandra Syed1 
William Grover3 
Adriann Okamba4,5 
Georgios Vidalakis1 
1Department of Microbiology and Plant Pathology, University of California Riverside 
2Technology Evolving Solutions (TES) 
3Department of Bioengineering, University of California Riverside 
4Ecole Sup&#233;rieure d&#39;Ing&#233;nieurs L&#233;onard de Vinci ESILV 
5University of California Riverside 
6California Agriculture and Food Enterprise (CAF&#201;), University of California Riverside

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65159">Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

Durch Transplantate übertragbare phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten, wie Viroide, Viren und Bakterien, haben in allen Zitrusanbaugebieten der Welt verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verursacht. Zitrusviroide sind limitierende Produktionsfaktoren aufgrund der Exokortis- und Kachexie-Krankheiten, die sie bei wirtschaftlich wichtigen Zitrusarten wie Dreiblatt, Dreiblatthybriden, Mandarinen, Clementinen und Mandarinen verursachen 1,2,3. In Kalifornien sind diese viroidempfindlichen Zitrussorten die Grundlage für den wachsenden und profitablen Markt der "Easy-Peeler" und folgen damit dem sich wandelnden Trend in der Präferenz der Verbraucher für Früchte, die leicht zu schälen, segmentiert und kernlos sind 4,5,6. So werden Zitrusviroide im Rahmen des California Department of Food and Agriculture (CDFA) "Citrus Nursery Stock Pest Cleanliness Program-Senate Bill 140" reguliert, und die Labore der Plant Pest Diagnostics Branch der CDFA führen jährlich Tausende von Zitrusviroidtests durch 7,8,9,10 . Das Citrus-Tristeza-Virus (CTV) ist seit Beginn der globalen Epidemie in den 1930er Jahren für das Absterben von über 100 Millionen Zitrusbäumen verantwortlich 3,9,10,11. In Kalifornien stellen Lochfraß und Isolate des Virus, die Trifoliate brechen, eine ernsthafte Bedrohung für die 3,6 Milliarden Dollar schwere kalifornische Zitrusindustrie dar12,13,14. Folglich stuft die CDFA CTV als regulierten Pflanzenschädling der Klasse A ein, und das Labor der Central California Tristeza Eradication Agency (CCTEA) führt jedes Jahr umfangreiche Felduntersuchungen und Tausende von Virustests durch15,16. Es wird geschätzt, dass das Bakterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) und die Huanglongbing-Krankheit (HLB) in Florida einen wirtschaftlichen Schaden von fast 9 Milliarden US-Dollar verursacht haben, was auf eine Reduzierung der Zitrusanbaufläche um 40 %, einen Rückgang der Zitrusproduktion um 57 % und einen Verlust von fast 8.000 Arbeitsplätzen zurückzuführenist 17,18. In Kalifornien wurde prognostiziert, dass eine hypothetische Reduzierung der Zitrusanbaufläche um 20 % aufgrund von HLB zu mehr als 8.200 Arbeitsplatzverlusten und einer Verringerung des Bruttoinlandsprodukts des Staates um über eine halbe Milliarde Dollar führen würde. Daher gibt das Citrus Pest and Disease Prevention Program jährlich über 40 Millionen US-Dollar für Erhebungen aus, um CLas aus Kalifornien zu testen, zu erkennen und auszurotten14,17,19,20.
Ein Schlüsselelement bei der Bekämpfung von Zitrusviroiden, Viren und Bakterien ist die Verwendung von pathogengetestetem Vermehrungsmaterial (z. B. Knospenholz) für die Baumproduktion. Auf Krankheitserreger getestetes Zitrusblütenholz wird im Rahmen umfassender Quarantäneprogramme produziert und gepflegt, die fortschrittliche Techniken zur Eliminierung und zum Nachweis von Krankheitserregern einsetzen10,21. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, testet jedes Jahr Tausende von Knospenholzproben von Zitrussorten, die neu in den Bundesstaat und die USA importiert wurden, sowie von Zitrusblütenbäumen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und die Funktionen des National Clean Plant Network for Citruszu unterstützen 10,17,22. Um das große Volumen an Zitrustests bewältigen zu können, sind zuverlässige und kostengünstige Assays zum Nachweis von Krankheitserregern mit hohem Durchsatz eine grundlegende Komponente für den Erfolg von Programmen wie dem CCPP 7,10,22.
Während molekularbasierte Assays zum Nachweis von Krankheitserregern wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine deutliche Steigerung des Durchsatzes in pflanzendiagnostischen Laboren ermöglicht haben, ist unserer Erfahrung nach einer der kritischsten Engpässe bei der Implementierung von Hochdurchsatzprotokollen der Verarbeitungsschritt der Probe von Pflanzengewebe. Dies gilt insbesondere für Zitrusfrüchte, da die derzeit verfügbaren Protokolle für die Verarbeitung von phloemreichen Geweben wie Blattstielen und Knospenholzrinde arbeitsintensiv und zeitaufwändig sind und teure und spezialisierte Laborgeräte erfordern. Diese Protokolle erfordern manuelles Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden 8,23,24. Im CCPP-Diagnoselabor umfasst die Probenverarbeitung beispielsweise (i) Häckseln von Hand (6-9 Proben/h/Bediener), (ii) Gefriertrocknung (16-24 h), (iii) Pulverisierung (30-60 s) und (iv) Zentrifugation (1-2 h). Der Prozess erfordert auch spezielle Verbrauchsmaterialien (z. B. hochbelastbare Safe-Lock-Röhrchen, Edelstahl-Mahlkugeln, Adapter, Klingen, Handschuhe) und mehrere kostspielige Laborgeräte (z. B. Ultratiefkühlschrank, Gefriertrockner, Gewebepulverisierer, Kryostation mit flüssigem Stickstoff, gekühlte Zentrifuge).
Wie in jeder Branche sind der Anlagenbau und die Automatisierung von Prozessen der Schlüssel, um Kosten zu senken, den Durchsatz zu erhöhen und qualitativ hochwertige, einheitliche Produkte und Dienstleistungen bereitzustellen. Die Zitrusindustrie benötigt kostengünstige Tissue-Verarbeitungsinstrumente, die nur minimale Fähigkeiten erfordern und daher leicht in diagnostische Labore und Feldbetriebe übertragen werden können, um eine hohe Probenverarbeitungskapazität für einen schnellen nachgeschalteten Nachweis von Krankheitserregern zu ermöglichen. Technology Evolving Solutions (TES) und das CCPP entwickelten (d. h. entwerfen und herstellen) und validierten (d. h. getestet mit Zitrusproben und verglichen mit Standard-Laborverfahren) ein kostengünstiges Instrument für die schnelle Verarbeitung von phloemreichem Zitrusgewebe (d. h. Knospenholz) und validierten (d. h. es wurde mit Zitrusproben getestet und mit Standard-Laborverfahren verglichen), das als Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, enthält das HdO eine Basiskomponente für die Stromversorgung und Steuerung sowie eine herausnehmbare Kammer für die Verarbeitung von Zitrusknospenholz. Die HdO-Kammer besteht aus einer Mahlscheibe, die speziell entwickelt wurde, um das phloemreiche Rindengewebe aus dem Zitrusknospenholz zu entfernen. Das zerkleinerte Rindengewebe wird schnell durch einen Schieber in eine Spritze mit Extraktionspuffer ausgestoßen, filtriert und ohne zusätzliche Handhabung oder Vorbereitung für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung vorbereitet (Abbildung 1). Das HdO-System umfasst auch eine papierlose Probenverfolgungsanwendung und eine integrierte Wägeanwendung, die die Informationen zur Probenverarbeitung in Echtzeit in einer Online-Datenbank aufzeichnen.
Das HdO-System hat die labordiagnostische Kapazität des CCPP um über 100 % gesteigert und hat durchgängig Zitrusgewebeextrakte produziert, die für die Aufreinigung hochwertiger Nukleinsäuren und den nachgeschalteten Nachweis von durch Transplantate übertragbaren Krankheitserregern von Zitrusfrüchten mittels PCR-Assays geeignet sind. Genauer gesagt hat HdO die Zeit für die Gewebeverarbeitung von über 24 Stunden auf ~3 Minuten pro Probe reduziert, Laborinstrumente ersetzt, die über 60.000 US-Dollar gekostet haben (Abbildung 2, Schritte 2-4) und die Verarbeitung größerer Probengrößen ermöglicht.
In diesem Artikel werden die Validierungsdaten für die Verarbeitung von Zitrusrindengewebe, die Nukleinsäureextraktion und den Nachweis von Krankheitserregern mit Zitrusblütenholzproben von Quellbäumen vorgestellt, einschließlich aller geeigneten Positiv- und Negativkontrollen aus der CCPP Rubidoux Quarantine Facility bzw. der Lindcove Foundation Facility. Außerdem stellen wir die Durchsatz- und Bearbeitungszeitveränderungen im Vergleich zum aktuellen Laborverfahren dar (Abbildung 2). Darüber hinaus bietet diese Arbeit ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für Testlabore für Zitruspathogene und zeigt, wie das HdO-System die Funktionen von Krankheitserreger-sauberen Baumschulbeständen, Erhebungs- und Eradikationsprogrammen unterstützen kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65159/65159fig01.jpg"> Abbildung 1: Knospenholz-Gewebeextraktor. Das HdO enthält eine Basiskomponente für Leistung und Steuerung sowie eine herausnehmbare Kammer für die Verarbeitung von Zitrusknospenholz. Die HdO-Kammer besteht aus einer Schleifscheibe, die speziell entwickelt wurde, um das phloemreiche Rindengewebe von Zitrusknospen zu entfernen. Das zerkleinerte Rindengewebe wird schnell durch einen Schieber in eine Spritze ausgeworfen, filtriert und ohne zusätzliche Handhabung oder Vorbereitung für die Nukleinsäureextraktion und -reinigung vorbereitet. Abkürzung: HdO = Knospenholz-Gewebeextraktor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65159/65159fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65159/65159fig02.jpg"> Abbildung 2: Schritt-für-Schritt-Vergleich zwischen dem konventionellen Handhackverfahren im Labor und der HdO-Verarbeitung. Die HdO-Verarbeitung umfasst die Verarbeitung von Zitrusrindengewebe mit hohem Durchsatz, die Nukleinsäureextraktion und den Nachweis von Krankheitserregern. Die Zeit für jeden Schritt wird in Klammern angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65159/65159fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>0,08" Sechskant-Trimmerfaden</td><td>PowerCare</td><td>FPRO07065</td><td>Zum Wechseln der Klingen erforderlich.</td></tr><tr><td>1 PS, 8 Gallonen Luftkompressor</td><td>California Air Tools</td><td>8010</td><td>Schnelles Trocknen von Kammern nach dem Spülen</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Globe Scientific</td><td>111558B</td><td>Lagern Sie die Probe nach dem Schwenken mit Spritzen</td></tr><tr><td>10 mL Spritzenset</td><td>Technologie Evolving Solutions</td><td>TE006-F1-10A-G1000-E1</td><td>Spritzenmaterial wird eingeschnitten. 1 L Flasche mit Guanidinthiocyanat-Puffer. WARNUNG - enthält Guanidinthiocyanat, Sondermüll Service erforderlich - nicht mit Bleiche</td></tr><tr><td>mischen 12" Lineal</td><td>Westcott</td><td>&lrm; 16012</td><td>Zum Messen des Trimmerfadens vor dem Schneiden</td></tr><tr><td>12% Natriumhypochlorit</td><td>Hasa</td><td>1041</td><td>Desinfiziert die Kammern nach der</td></tr> <tr><td>Verarbeitung-20 C Gefrierschrank</td><td>Insignia</td><td>NS-CZ70WH0</td><td>Lagern Sie die Probe nach der Verarbeitung</td></tr><tr><td>4" x 12" Plastiktüten</td><td>Plymor</td><td>FP20-4x12-10</td><td>Beutel zum Halten von Ästen während des Versands. O-Ringe befestigen den Beutel an der HdO-Kammer zum Versiegeln</td></tr><tr><td>von 6" Wattestäbchen</td><td>Puritan</td><td>806-PCL</td><td>Tupfer zum Entfernen von Verstopfungen</td></tr><tr><td>7-Gallonen-Aufbewahrungstasche</td><td>HDX</td><td>206152</td><td>Hält Natriumhypochloritlösung zur Desinfektion der Kammern und Wasser zum Spülen der Kammern</td></tr><tr><td>Luftblaspistole</td><td>JASTIND</td><td>&lrm; JTABG103A</td><td>Leitet Luft mit hohem Druck in die Kammern</td></tr><tr><td>Black Sharpie</td><td>Sharpie</td><td>&nbsp; S-19421</td><td>Markieren Sie 1,5-ml-Röhrchen, damit Sie die Probe später identifizieren können</td></tr><tr><td>Flaschenaufsatz-Dispensor</td><td>Marke</td><td>Z627569</td><td>Verstellbarer Flaschendeckel-Dispensator zur Abgabe von Guandin in die Spritze</td></tr><tr><td>BTE-Kammer-Technologie</td><td>Evolving Solutions</td><td>TE002BB-A05-E1</td><td>Wird zur Verarbeitung von Knospenholz verwendet. Enthält O-Ringe, HdO-Schieber, Schiebekolben, Ablassventil, Deckel, Klingensatz und Werkzeug zum Entfernen des Klingensatzes</td></tr><tr><td>Spülmittel</td><td>Dawn</td><td>57445CT</td><td>Surfektivmittel zur Verbesserung des Eindringens von Natriumhypochlorit in die Kammer</td></tr><tr><td>Abzug mit Hepa-Filter</td><td>Air Science</td><td>P5-36XT-A</td><td>Abzug mit Hepa-Filter (ASTS-030) & zur Begrenzung möglicher Kontamination und zum Schutz vor verschütteten Chemikalien</td></tr><tr><td>Isolierter Versandbehälter</td> <td>aus SchaumstoffPolarTech</td><td>261/J50C</td><td>Isolierter Versandbehälter zum Versenden von Proben auf Eis nach der Entnahme</td></tr><tr><td>Laborkittel</td><td>Red Kap</td><td>KP14WH LN 46</td><td>Laborkittel zur Begrenzung möglicher Kontaminationen und zum Schutz vor verschütteten Chemikalien</td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Microsoft</td><td>Surface</td><td>Wifi-fähiger Laptop zum Ausführen der TES-GUI. Wird für die Ersteinrichtung benötigt und bietet detailliertere Informationen über die Gewebeverarbeitungsbasis</td></tr><tr><td>NFC-fähiges Telefon</td><td>Samsung</td><td>Galaxy S9</td><td>Telefon zum Herunterladen und Verwenden der TES-Telefon-App</td></tr><tr><td>NFC-Clip-Tag</td><td>Technologie Entwickelnde Lösungen</td><td>TE005-Clip-E1</td><td>Probenetikett, das mit Bäumen verknüpft werden kann. Kompatibel mit der TES-Telefon-App</td></tr><tr><td>NFC Collar Tag</td><td>Technology Evolving Solutions</td><td>TE005-Collar-E1</td><td>Tag, das an einem Baum befestigt ist. Hergestellt für die Funktion mit der TES-Telefon-App</td></tr><tr><td>Nitrilhandschuhe</td><td>Usa Scientific</td><td>3915-4400</td><td>Handschuhe zur Begrenzung möglicher Kontaminationen und zum Schutz vor verschütteten Chemikalien</td></tr><tr><td>Geräuschreduzierender Kapselgehörschutz</td><td>3M</td><td>90565-4DC-PS</td><td>Schützen Sie die Ohren während des Betriebs Luftkompressor und Gewebeverarbeitungsbasis</td></tr><tr><td>Polyurethan-Rückstoß-Luftschlauch</td><td>FYPower</td><td>&lrm; 510019</td><td>Befestigt die Luftpistole am Kompressor</td></tr><tr><td>Sicherheitsbrille</td><td>Solidwork</td><td>SW8329-US</td><td>Schützt die Augen vor chemischen und physikalischen Gefahren</td></tr><tr><td>Sprühflasche</td><td>JohnBee</td><td>B08QM81BJV</td><td>Sprühbleiche zur Dekontamination von Oberflächen</td></tr><tr><td>Tissue Extractor Base Technology</td><td>Evolving Solutions</td><td>TE001-A-E1</td><td>System zur Verarbeitung von Pflanzengewebe. Benötigt HdO- oder LTE-Kammern, um zu funktionieren. Inklusive Netzkabel, Klingenadapter und 8/32-Zoll-Inbusschlüssel</td></tr> Technologie <tr><td>für die Tissue-Verarbeitungsbasis</td><td>Evolving Solutions</td><td>TE003-A05-200G-01-E1</td><td>Waage mit einer Auflösung von 200 g, Auflösung von 0,01, die mit der Tissue-Processing-Basis verbunden werden kann, um Gewichtsbereiche durchzusetzen und/oder Gewichte mit der Probe zu verknüpfen. Inklusive Waage, Netzkabel, Verbindungskabel, 5-ml-Spritzenhalter, Tower-Luftschild</td></tr><tr><td>Vermiculit</td><td>EasyGoProducts</td><td>B07WQDZGRP</td><td>Wird für den Transport von gefährlichen Abfällen (Guanidinthiocyanat) mit Hilfe eines Entsorgungsdienstes für gefährliche Abfälle</td></tr><tr><td>benötigt Drahtschneider</td><td>Boenfu</td><td>&lrm; BOWC-06002-US</td><td>Drahtschneider zum Schneiden von Trimmerfäden</td></tr></tbody></table>

automatisierung der verarbeitung von zitrusblütenholz für den nachgelagerten nachweis von krankheitserregern durch gerätetechnik

Automating Citrus Budwood Processing for Downstream Pathogen Detection Through Instrument Engineering

Durch Transplantate übertragbare, phloembegrenzte Krankheitserreger von Zitrusfrüchten wie Viren, Viroide und Bakterien sind weltweit für verheerende Epidemien und schwerwiegende wirtschaftliche Verluste verantwortlich. Zum Beispiel hat das Citrus-Tristeza-Virus weltweit über 100 Millionen Zitrusbäume getötet, während "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida 9 Milliarden Dollar gekostet hat. Die Verwendung von pathogengetestetem Zitrusknospenholz für die Baumvermehrung ist der Schlüssel zur Bekämpfung solcher Krankheitserreger. Das Citrus Clonal Protection Program (CCPP) an der University of California, Riverside, verwendet Polymerase-Kettenreaktions-Assays (PCR), um jedes Jahr Tausende von Proben von Zitrusblütenbäumen zu testen, um die kalifornischen Zitrusfrüchte zu schützen und dem National Clean Plant Network saubere Vermehrungseinheiten zur Verfügung zu stellen. Ein schwerwiegender Engpass beim molekularen Hochdurchsatznachweis von Zitrusviren und Viroiden ist der Verarbeitungsschritt des Pflanzengewebes.
Die richtige Gewebepräparation ist entscheidend für die Extraktion hochwertiger Nukleinsäuren und die nachgelagerte Verwendung in PCR-Assays. Das Zerkleinern, Wiegen, Gefriertrocknen, Mahlen und Zentrifugieren von Pflanzengewebe bei niedrigen Temperaturen, um den Abbau von Nukleinsäuren zu vermeiden, ist zeit- und arbeitsintensiv und erfordert teure und spezialisierte Laborgeräte. In diesem Artikel wird die Validierung eines speziellen Instruments vorgestellt, das entwickelt wurde, um phloemreiches Rindengewebe aus Zitrusknospenholz schnell zu verarbeiten, das als Knospengewebeextraktor (HdO) bezeichnet wird. Das HdO erhöht den Probendurchsatz um 100 % im Vergleich zu aktuellen Methoden. Darüber hinaus senkt es den Arbeitsaufwand und die Kosten für die Ausrüstung. In dieser Arbeit wiesen die HdO-Proben eine DNA-Ausbeute (80,25 ng/μL) auf, die mit dem Handhackprotokoll des CCPP (77,84 ng/μL) vergleichbar war. Dieses Instrument und das Protokoll zur schnellen Verarbeitung von Pflanzengewebe können mehreren diagnostischen Zitruslaboren und -programmen in Kalifornien zugute kommen und zu einem Modellsystem für die Gewebeverarbeitung für andere holzige mehrjährige Kulturen weltweit werden.

RNA-Extraktion, -Aufreinigung und -Qualität unter Verwendung von HdO-verarbeitetem Knospenholz-Zitrusgewebe und Bewertung der Zeit für die Gewebeverarbeitung Für diesen Test haben wir Knospenholzproben von 255 repräsentativen Zitrusbäumen verwendet, um die RNA-Qualität des HdO mit dem Standardverfahren zu vergleichen. Die Proben wurden mit dem Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) verarbeitet (Protokollschritte 4.1-4.6 und Abbildung 2, rechte Seite, Schritt 1, Schritt 5 und Schritt 6) oder nach der behörd...

Wir haben ein Instrument entwickelt, hergestellt und validiert, das phloemreiches Rindenknospenknospengewebe schnell verarbeitet. Im Vergleich zu aktuellen Methoden hat der Knospenholz-Gewebeextraktor (HdO) den Probendurchsatz erhöht und die erforderlichen Arbeits- und Gerätekosten gesenkt.

Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik

Graft-transmissible, phloem-limited pathogens of citrus such as viruses, viroids, and bacteria are responsible for devastating epidemics and serious ...

Die demonstrierte Technik verwendet ein kostengünstiges Instrument zur schnellen Verarbeitung von phloemreichem Zitrusgewebe, wodurch arbeitsintensive Protokolle und spezielle Laborgeräte überflüssig werden. Dies ermöglicht eine schnelle nachgelagerte Erkennung und Behandlung von Zitrusviroiden, Viren und Bakterien. Diese Methode könnte den Durchsatz erhöhen und die Qualität und Einheitlichkeit der Testdienstleistungen verbessern, was der Zitrusindustrie zugute kommt und möglicherweise bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten in Baumschulen und Feldbetrieben hilft.Zitruspflanzen sind mit Krankheitserregern infiziert, die weltweit erhebliche wirtschaftliche Verluste verursachen. Fortschrittliche Techniken zum Nachweis von Krankheitserregern, wie der Budwood Tissue Extractor (HdO), sind notwendig, um pathogengetestetes Vermehrungsmaterial für die großflächige Baumproduktion herzustellen. Obwohl die Methode mit Zitrusproben getestet und validiert wurde, kann sie in diagnostischen Labors und Feldbetrieben für viele andere Kulturen angewendet werden.Anfänger, die diese Technik anwenden, müssen sich mit dem Protokoll vertraut machen, die Anweisungen genau befolgen und geduldig sein. Verwenden Sie zunächst die Telefon-App Test Tracker, um einen Baum auszuwählen, und halten Sie einen NFC-Halsband-Tag (Near Field Communication) an das Telefon, um die Bauminformationen in den Tag zu laden. Legen Sie drei bis vier Zitrusblütenholzproben in den Budwood Tissue Extractor (HdO), kompatiblen Plastikbeutelträger und verschließen Sie ihn mit dem Clip.Nachdem Sie die Qualität der Probe durch Befolgen der im Text beschriebenen Schritte sichergestellt haben, scannen Sie mit der Telefon-App Test Tracker das NFC-Halsband-Etikett des Baumes und verknüpfen Sie es mit dem NFC-Clip-Tag auf dem Probenbeutel. Legen Sie in einem ordnungsgemäß desinfizierten Abzug den Schalter auf der Rückseite des Gewebeabzugssockels um. Stellen Sie sicher, dass der Schalter auf der linken Seite der Box auf der Oberseite gedrückt ist, und warten Sie, bis die blinkende grüne LED anzeigt, dass die Kammer bereit ist.Um die HdO-Kammer vorzubereiten, befestigen Sie einen leeren Probenbeutel an der Rückseite der Kammer, indem Sie ihn mit einem O-Ring an der hinteren Düse befestigen. Untersuchen Sie die Klinge auf Anzeichen von Verschleiß oder Beschädigungen, wie z. B. Schnitte an der Klinge, die in den Kunststoff eindringt, oder Schnitte an der Spitze. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil auf der Klinge mit dem Symbol für eine einfache Verriegelung ausgerichtet ist und die Luftentlastung am Boden der Kammer in Richtung des O-Symbols gedreht ist.Setzen Sie den durchsichtigen Deckel über die Kammeröffnung. Schieben Sie mit der Schiene auf der rechten Seite der Kammer den durchsichtigen HdO-Schlitten auf die Kammer und schieben Sie die Verriegelung am Boden der Kammer so weit wie möglich in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Kolbenkappe auf der Oberseite des Objektträgers montiert ist.Um die HdO-Kammer auf die HdO-Basis zu laden, stellen Sie die vorbereitete Kammer auf die Basis, wobei die Düse der HdO-Basis in die Rückseite der Kammer hineinragt. Laden Sie die Probe auf die HdO-Basis, indem Sie den weißen Aufkleber auf dem NFC-Clip-Tag in einer langsamen, kreisförmigen Bewegung zu einem Z auf der rechten Seite der Box bewegen, bis das gelbe Licht zu blinken beginnt. Nachdem Sie die Probe an der Basis befestigt haben, stellen Sie sicher, dass der Probenbeutel keine Löcher hat.Legen Sie dann den O-Ring über den Probenbeutel, um ihn an der Vorderseite der HdO-Düse zu befestigen. Um das unbenutzte Spritzenset zu laden, zerreißen Sie zunächst das Spritzenset. Legen Sie dann das unbenutzte Spritzenset auf den Waagenturm.Entfernen Sie das Spritzenset, wenn ein rotes Licht zu blinken beginnt oder die Waage Null anzeigt. Entfernen Sie den Kolben mit dem Filter aus der Spritze und stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit in der Bodenspritze verbleibt. Legen Sie den Kolben auf ein Papiertuch oder den Turm, wo er keine Oberfläche berührt.Zum Schluss befestigen Sie die Spritze an der Austrittsöffnung des Objektträgers, indem Sie die Austrittsöffnung in die Spritze drücken und um 90 Grad drehen. Um mit der Verarbeitung der Knospenholzprobe zu beginnen, drücken Sie die obere schwarze Taste, um die Maschine zu starten. Nimm einen Knospenholzstab aus dem Beutel und stecke ihn durch die Oberseite der HdO-Düse.Greife mit der anderen Hand den Knospenholzstab auf der anderen Seite der Kammer und schiebe ihn langsam in die Klinge. Bewegen Sie das Knospenholz langsam hin und her, während Sie es drehen. Wenn ein leichtes Summen zu hören ist, bewegen Sie den Zweig tiefer in die Maschine, um sich auf das Phloem zu konzentrieren.Nachdem Sie das Gleiche für alle Zweige getan haben, drücken Sie die obere schwarze Taste, um die Verarbeitung zu stoppen, und warten Sie, bis das Licht wieder gelb zu blinken beginnt. Um das Probengewicht zu überprüfen, drehen Sie die Spritze um 90 Grad und ziehen Sie sie nach unten. Setzen Sie den Kolben wieder auf die Spritze und setzen Sie die Spritze auf den Turm.Nachdem die Waage die Probe automatisch erkannt hat, zeigt eine blinkende grüne LED an, dass sich das Probengewicht im richtigen Bereich befindet. Wenn das rote Licht blinkt, was auf ein zu niedriges Probengewicht hinweist, wiederholen Sie die Probenverarbeitung. Wenn das Gewicht zu hoch ist, entfernen Sie einige Proben, und das Blinken der gelben LED wird langsamer.Um die Probe zu homogenisieren, entfernen Sie den Kolben von der Spritze, die die Probe enthält. Drücken Sie die Flüssigkeit in die Spritze und setzen Sie den Kolben wieder ein. Drücken Sie den Kolben, um den Puffer und Pflanzensaft durch den Mesh-Filter über den Gummischlauch in die leere Spritze zu leiten.Mischen Sie die Probe, indem Sie den Puffer und den Pflanzensaft drei- bis viermal von einer Spritze zur anderen hin und her schieben, bis sich die Probe in eine homogene grüne Flüssigkeit verwandelt. Sobald die Probe gut homogenisiert ist, drücken Sie die Pflanzensaftprobe ohne den Siebfilter in die Spritze und lösen Sie den Gummischlauch und die Spritze mit dem Filter davon. Anschließend wird die Pflanzensaftprobe aus der Spritze in ein zwei Milliliter großes steriles Mikrozentrifugenröhrchen ausgestoßen.Nachdem Sie die Probe mit einem Permanentmarker mit der Beutelnummer beschriftet haben, lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Desinfizieren Sie die herausnehmbare HdO-Kammer, nachdem die 10. Probe verarbeitet wurde und die grüne LED weiter blinkt, anstatt blau zu werden. Um die Kammer zu demontieren und alle Verunreinigungen zu reinigen, entfernen Sie die durchsichtige Kunststoffabdeckung, den durchsichtigen Kammerschieber und die Verstopfungsöffnung am Kammerschieber.Drehen Sie dann das Entlüftungsventil am Boden der Kammer auf die Markierung des geöffneten Vorhängeschlosses. Nachdem Sie die Kammerkomponenten in den Setup-Ultraschallreiniger eingesetzt haben, stellen Sie die Kammer mit dem Deckel darunter in das Bad, um ein Aufschwimmen des Deckels zu verhindern. Lassen Sie den Ultraschallreiniger 15 Minuten lang laufen.Spülen Sie die Kammerkomponenten mindestens 30 Sekunden lang im Wasserbad, bevor Sie die Kammerkomponenten in die Trocknungsstation bringen. Um mit dem Trocknen zu beginnen, positionieren Sie die Luftpistole in einer Linie mit der Rille der oberen Öffnung der Kammer und drücken Sie den Abzug der Pistole, um etwa 30 Sekunden lang Luft abzugeben. Drehen Sie die Luftpistole in Richtung der oberen Düsen der Kammer und ziehen Sie nach dem Drücken des Abzugs langsam drei volle Kreise von jedem Düseneingang.Positionieren Sie das Luftgewehr in der Mitte des HdO-Gewehrs, halten Sie den Abzug vom innersten Punkt aus gedrückt und bewegen Sie sich, bis das Luftgewehr in Richtung des Schlittens zeigt. Lassen Sie schnell Luft über die gesamte Kammer vorne und hinten laufen, um das Oberflächenwasser von außen zu entfernen. Der Vergleich des HdO-Protokolls mit dem konventionellen Laborprotokoll für die Verarbeitung von Zitrusgewebe zeigte, dass die extrahierten Nukleinsäurekonzentrationen, die durch Messung der Absorption bei 260 Nanometern bestimmt wurden, in beiden Fällen vergleichbar waren.Die Reinheit der durch das HdO extrahierten Nukleinsäuren, bestimmt als Verhältnis der Absorptionen bei 260 und 280 Nanometern, war hoch bei geringer Proteinkontamination. Die Nukleinsäureintegrität, die mittels RT-qPCR analysiert wurde, die auf die mRNA des Zitrus-NADH-Dehydrogenase-Gens abzielte, war sowohl für HdO als auch für das manuelle Standardprotokoll sehr ähnlich. Das herkömmliche Laborverfahren erforderte fast sieben bis 10 Minuten für das manuelle Zerkleinern pro Probe und mehr Zeit für die Gewebeverarbeitung, einschließlich Gefriertrocknung, Mahlen und Zentrifugieren.Das HdO verarbeitete jedoch jede Probe für eine Nukleinsäureextraktion in drei Minuten, einschließlich Vorbereitung, Wiegen und Reinigungsschritten. Keine der 72 gesunden Proben aus der ersten HdO-Probenverarbeitung erzeugte Amplifikationskurven für die getesteten Zitruspathogene, wodurch die HdO-Verarbeitung von Zitrusgewebe validiert wurde. In der zweiten HdO-Probenverarbeitung mit zwei eingeführten gemischten infizierten Proben zeigten die extrahierten Nukleinsäuren das Vorhandensein verschiedener Zitrusviren und Viroide in den Chargen eins und fünf.Es wurden jedoch keine Kreuzkontaminationen zwischen den Köpfen oder falsch-positive oder negative Ergebnisse festgestellt. Wenn Sie den Ast während der Verarbeitung zu lange an einer Stelle lassen, kann dies zu tief in den Ast einschneiden, was die Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung erhöht und azelluläres faseriges Material ansammelt. Nach der Verarbeitung ist das Material für die meisten DNA- und RNA-Extraktions- und Reinigungsprotokolle bereit und kann mit jedem molekularen Nachweisassay auf Pflanzenpathogene getestet werden.Die Entwicklung des Knospenholz-Gewebeextraktors öffnete die Tür zu einem flächendeckenden und hainweiten Screening mit hohem Durchsatz. Zusammen mit dem Leaf Tissue Extractor ermöglicht er die Verarbeitung von Pflanzengeweben, die bisher als schwierig zu verarbeiten galten, wie z. B. Wurzeln und Stiele, in großem Maßstab.

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Automatisierung der Verarbeitung von Zitrusblütenholz für den nachgelagerten Nachweis von Krankheitserregern durch Gerätetechnik (Video) | JoVE Journal

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