Name: Ein effizientes Protokoll für die CUT and RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie CUT&RUN-Analyse für Transkriptionsregulation in Maus-Skelettmuskel-Satellitenzellen. Diese FACS-basierte Methode ermöglicht genomweite Analyse von Androgenrezeptor-Bindungsstellen.

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Wir danken Anastasia Bannwarth für ihre hervorragende technische Unterstützung. Wir danken dem IGBMC-Tierstall, der Zellkultur, dem Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankreich), der Bildgebung, der Elektronenmikroskopie, der Durchflusszytometrie und der GenomEast-Plattform, einem Mitglied des "France Génomique"-Konsortiums (ANR-10-INBS-0009).
Diese Arbeit des Interdisziplinären Thematischen Instituts IMCBio im Rahmen des ITI-Programms 2021-2028 der Universität Straßburg, CNRS und Inserm wurde von IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) und vom Projekt SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) und EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) im Rahmen des französischen Programms "Investitionen in die Zukunft" unterstützt. Weitere Mittel wurden von INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), dem AFM-Téléthon Strategic Program 24376 (an D.D.), INSERM Young Researcher Grant (an D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT und einem französischen Staatsfonds bereitgestellt, der von der ANR im Rahmen des Rahmenprogramms Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02) verwaltet wird. J.R. wurde durch das Programm CDFA-07-22 der Université franco-allemande und des Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation und K.G. durch die Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI) unterstützt.

Isolierung von Satellitenzellen aus Gliedmaßenmuskeln der Maus und Durchflusszytometrie-Analyse

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<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
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<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die vorliegende Studie berichtet über eine standardisierte, zuverlässige und einfach durchzuführende Methode zur Isolierung und Kultivierung von Maus-Satellitenzellen sowie zur Beurteilung der Transkriptionsregulation durch die CUT&RUN-Methode.
Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die erste ist der Muskelaufschluss und die Verdauung von Ballaststoffen, um eine hohe Anzahl gesammelter Zellen zu gewährleisten. Trotz der erhöhten Enzymkonzentration wurden mehr lebende Zellen gewon...

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus1. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen2. Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete3. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der Muskelfasern4. Es wurde berichtet, dass sie den Cluster der Differenzierung 34 (CD34; ein hämatopoetischer, endothelialer Vorläufer und mesenchymaler Stammzellmarker), Integrin alpha 7 (ITGA7; ein glatter Marker für Herz- und Skelettmuskeln) sowie den C-X-C-Chemokinrezeptor Typ 4 (CXCR4; ein Lymphozyten-, hämatopoetischer und Satellitenzellmarker) exprimierten5. Unter basalen Bedingungen befinden sich Satellitenzellen in einer bestimmten Mikroumgebung, die sie in einem Ruhezustand hält6. Bei Muskelschäden werden sie aktiviert, vermehren sich und durchlaufen eine Myogenese7. Da sie jedoch nur einen kleinen Teil der Gesamtzahl der Muskelzellen ausmachen, sind ihre genomweiten Analysen eine besondere Herausforderung, insbesondere unter physiologischen Bedingungen (<1 % der gesamten Zellen).
Es wurden verschiedene Methoden zur Chromatinisolierung aus Satellitenzellen beschrieben, die eine Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender massiver paralleler Sequenzierung (ChIP-seq) oder Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT&Tag) beinhalten. Nichtsdestotrotz weisen diese beiden Techniken einige erhebliche Einschränkungen auf, die unangefochten bleiben. In der Tat erfordert ChIP-seq eine große Menge an Ausgangsmaterial, um genügend Chromatin zu erzeugen, von dem ein großer Teil während des Beschallungsschritts verloren geht. CUT&Tag eignet sich besser für eine niedrige Zellzahl, erzeugt aber aufgrund der Tn5-Transposase-Aktivität mehr Off-Target-Spaltstellen als ChIP-seq. Da dieses Enzym eine hohe Affinität zu offenen Chromatinregionen aufweist, könnte der CUT&Tag-Ansatz bevorzugt für die Analyse von Histonmodifikationen oder Transkriptionsfaktoren verwendet werden, die mit aktiv transkribierten Regionen des Genoms assoziiert sind, anstelle von stillgelegtemHeterochromatin 8,9.
Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das die Isolierung von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaßen mittels FACS für die Spaltung unter den Zielen und die Freisetzung mittels Nuklease-Analyse (CUT&RUN)10,11 ermöglicht. Die verschiedenen Schritte umfassen den mechanischen Aufschluss des Gewebes, die Zellsortierung und die Zellkernisolierung. Die Effizienz der Methode in Bezug auf die Herstellung einer lebensfähigen Zellsuspension wurde durch die Durchführung von CUT&RUN-Analysen auf kovalente Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren demonstriert. Die Qualität der isolierten Zellen macht die beschriebene Methode besonders attraktiv für die Herstellung von Chromatin, das den nativen genomischen Belegungszustand originalgetreu erfasst und wahrscheinlich für die Erfassung der Chromosomenkonformation in Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierung an spezifischen Loci (4C-seq) oder auf genomweiten Ebenen (Hi-C) geeignet ist.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Mikroröhrchen</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Röhrchen</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td></td><td>abcam ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM553673</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 & micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431752</tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb 70 &micro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td>431751</tr><tr><td>Zentrifuge 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Zentrifuge 5415 R</td></tr><tr><td>Zentrifuge 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Zentrifuge 5804 R</td></tr><tr><td>Chamber Slide System&nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&egrave; me Nunc&trade; Lab-Tek&Handel; Chamber Slide</td></tr><tr><td>Reinigungsmittel</td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Dosierung&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fixierbarer Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD FACSAria&trade; Fusion Durchflusszytometer</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Genom-Browser&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC-qualifizierte</td></tr><tr><td>Matrix-Bildverarbeitungssoftware</td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Laborfilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Propylgallat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Sequenzer&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelwasserbad</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

ein effizientes protokoll für die cut&amp;run-analyse von facs-isolierten maus-satellitenzellen

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genomweite Analysen mit kleinen Zellpopulationen sind eine große Einschränkung für Studien, insbesondere im Stammzellbereich. Diese Arbeit beschreibt ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Isolierung von Satellitenzellen aus dem Gliedmaßenmuskel, einem Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Die präparierten Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen wurden mechanisch durch Zerkleinern in Medium, das mit Dispase und Typ-I-Kollagenase ergänzt wurde, gestört. Nach dem Aufschluss wurde das Homogenat durch Zellsiebe filtriert und die Zellen wurden in FACS-Puffer suspendiert. Die Viabilität wurde mit fixierbarer Viabilitätsfärbung bestimmt, und immungefärbte Satellitenzellen wurden mittels FACS isoliert. Die Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und die freigesetzten Zellkerne wurden an Concanavalin-A-Magnetkügelchen gebunden. Die Zellkern-/Bead-Komplexe wurden mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor oder die interessierenden Histonmodifikationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellkern-/Kügelchenkomplexe mit der Protein-A-Mikrokokken-Nuklease inkubiert und die Chromatinspaltung mit CaCl2 eingeleitet. Nach der DNA-Extraktion wurden Bibliotheken erstellt und sequenziert, und die Profile für die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und kovalente Histonmodifikationen wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die für die verschiedenen Histonmarkierungen erhaltenen Peaks zeigten, dass die Bindungsereignisse spezifisch für Satellitenzellen waren. Darüber hinaus ergab die Analyse bekannter Motive, dass der Transkriptionsfaktor über sein verwandtes Antwortelement an das Chromatin gebunden ist. Dieses Protokoll wurde daher angepasst, um die Genregulation in Satellitenzellen der Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen zu untersuchen.

Satellitenzellen aus der Skelettmuskulatur von Mäusen wurden durch die Kombination der Protokolle von Gunther et al. (im Folgenden Protokoll 1)12 und von Liu et al.23 (im Folgenden Protokoll 2) isoliert. Da nicht verdaute Muskelfasern nach der Verdauung beobachtet wurden, wenn die in Protokoll 1 vorgeschlagene Konzentration von Kollagenase und Dispase verwendet wurde, wurde die Menge der Enzyme erhöht, um die Dissoziation der Muskelfasern zu verbessern, wie in den Schritten...

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&RUN) geeignet ist.

Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Seit mehr als 20 Jahren interessiert sich unser Labor für die pathophysiologische Rolle von nukleären Rezeptoren. Um ihre In-vivo-Funktion zu entschlüsseln, haben wir ein Mausmodell entwickelt, das die räumliche und zeitliche Kontrolle ihrer Expression ermöglicht. Parallel dazu entwickelten wir modernste Techniken, um ihre molekulare Funktion im Mausgewebe zu untersuchen.Unser wissenschaftliches Interesse führte uns kürzlich dazu, die Secosteroid- und Steroidrezeptor-Signalübertragung in verschiedenen Geweben, einschließlich der Skelettmuskulatur, zu bestimmen. Wir haben kürzlich gezeigt, dass der Androgenrezeptor in Myofasern, die Zellen des Skelettmuskels differenzieren, maßgeblich an ihren kontraktilen und metabolischen Funktionen beteiligt ist. Unsere jüngsten Ergebnisse liefern ein tieferes Verständnis der pathophysiologischen Dynamik der Skelettmuskulatur, das für die Entwicklung wirksamer Behandlungen für muskelassoziierte Erkrankungen von entscheidender Bedeutung ist.Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um eine Cistrome-Analyse an Muskelstammzellen in vivo durchführen zu können. Alle früheren Protokolle verwendeten In-vitro-Modale, was die Untersuchung vollständig von einem Gesamtorganismuskontext trennt. Dieses Protokoll ist nicht nur kostengünstig und zeiteffizient, sondern bietet auch eine effektive experimentelle Umgebung, um die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und die Chromatinlandschaft in Vorläuferzellen der Skelettmuskulatur zu untersuchen.Das mit diesem Protokoll hergestellte Chromatin hat die erste genomweite Analyse von AR-Cistrome in Satellitenzellen ermöglicht und wird zukünftige Studien zur Genregulation erleichtern. Unser zukünftiges Ziel wäre es unter anderem, diese Untersuchungen auf andere Oxosteroidrezeptoren auszudehnen und ihre spezifischen Co-Regulatoren in den verschiedenen Zelltypen zu erforschen, die am Regenerationsprozess in der Skelettmuskulatur beteiligt sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Isolierung und Kultur einer reinen Population von ruhenden Satellitenzellen, eine Muskelstammzellpopulation, ist wesentlich für das Verständnis der Muskelstammzelle Biologie und Regeneration sowie Stammzelltransplantation bei Therapien Muskeldystrophie und anderen degenerativen Erkrankungen.

Isolierung, Kultur und Transplantation von Muskel-Satelliten-Zellen

Einzelne Kardiomyozyten aus Wildtyp- und mutierten Mäusen können aus dem Herzen isoliert werden, um ihre Kontraktilität und Kalziumtransienten zu untersuchen. Dies ermöglicht die Charakterisierung des Beitrags zellulärer Dysfunktion zur Herzfunktionsstörung aus beliebiger Ursache.

Isolation und physiologische Analyse von Maus Kardiomyozyten

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Mausmodelle ermöglichen es, Schlüsselmechanismen der Arrhythmogenese zu untersuchen. Zu diesem Zweck sind qualitativ hochwertige Kardiomyozyten notwendig, um Patch-Clamp-Messungen durchzuführen. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Isolierung muriner atrialer und ventrikulärer Myozyten mittels retrograder enzymbasierter Langendorff-Perfusion beschrieben, die simultane Messungen von Calcium-Transienten und L-Typ-Calciumstrom ermöglicht.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

CUT&amp;RUN und seine Varianten können verwendet werden, um die Proteinbelegung auf Chromatin zu bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Proteinlokalisation auf Chromatin mit Hilfe von einzelligem uliCUT&amp;RUN bestimmt werden kann.

Einzelzellfaktorlokalisierung auf Chromatin unter Verwendung von Ultra-Low Input Cleavage Under Targets und Freisetzung mit Nuclease

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Forscher, die neu auf dem Gebiet der Epigenetik sind, werden in CUT&amp;Tag eine deutlich einfachere Alternative zu ChIP-Assays finden. CUT&amp;Tag hat die epigenetischen Studien an seltenen und primären Zellpopulationen enorm begünstigt und qualitativ hochwertige Daten von sehr wenigen Zellen generiert. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von H3K4me1 CUT&amp;Tag-Assays an Mausmyoblasten, die aus den Hintergliedmaßenmuskeln der Maus isoliert wurden.

Verwendung des CUT&#38;Tag-Assays (Cleavage under Targets and Tagmentation) in der Maus-Myoblastenforschung

Dieses Protokoll beschreibt einen extrachromosomalen nicht-homologen Endverbindungs-Assay (NHEJ) und einen homologen Rekombinations-Assay (HR), um die Effizienz von NHEJ und HR in HEK-293T-Zellen zu quantifizieren.

Analyse der nicht-homologen Endverknüpfung und der homologen Rekombinationseffizienz in HEK-293T-Zellen unter Verwendung von GFP-basierten Reportersystemen

Um die Perizyten des Gehirnkortikats der Maus zu erhalten, die den Anforderungen von scRNA-seq entsprechen, stellen wir ein kritisch optimiertes FACS-Protokoll auf Basis der CD13/CD31⁻-Auswahl vor. Unsere wichtigsten Verfeinerungen verbessern die Zelllebensfähigkeit und die RNA-Integrität erheblich und ermöglichen eine zuverlässige transkriptomische Profilierung.

Isolierung von Perizyten aus Mauskortikalgewebe mittels FACS zur Einzelzellsequenzierung

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Lernen Sie CUT&RUN-Analyse für Transkriptionsregulation in Maus-Skelettmuskel-Satellitenzellen. Diese FACS-basierte Methode ermöglicht genomweite Analyse von Androgenrezeptor-Bindungsstellen.

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

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