Name: Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitmessung von Zn²⁺-Efflux in HEK293T-Zellen und liefert wertvolle Erkenntnisse zur Funktionalität des ZnT-1-Transporters.

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Raz Zarivach wird von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 163/22). Tomer Eli Ben Yosef und Arie Moran werden von der Israel Science Foundation unterstützt (Grant Nr. 2047/20). Wir danken Daniel Gitler und seiner Gruppe an der Ben-Gurion-Universität für die Zusammenarbeit, Unterstützung und Expertise.

1. Zelltransfektion
<ol><li>Kultur HEK293T Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin/Streptomycin (siehe Materialtabelle) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 bis zum Zusammenfluss auf einer 10 cm großen Platte (8,8 x 106 Gesamtzellen).</li>
	<li>Legen Sie ein 13-mm-Deckglas in jede der Vertiefungen einer 12-Well-Platte. Verdünnen Sie 0,44 x 106 trypsinisierte Zellen aus Schritt 1.1 in 12 ml vollständigem DMEM. Mischen Sie gut, indem Sie drei- bis fünfmal auf und ab pipettieren. Füllen Sie jede Vertiefung mit 1 ml der gemischten Lösung. In einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C/5 % CO2 über Nacht anbauen.</li>
	<li>Ersetzen Sie das vollständige DMEM in jeder Vertiefung durch 1 ml serumfreies DMEM (siehe Materialtabelle) in jeder Vertiefung. Legen Sie die 12-Well-Platte wie in Schritt 1.1 wieder in den befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Verdünnen Sie für jede Transfektionsvertiefung 1 μg pAAV2-Plasmid, das das interessierende Protein enthält, das mit dem fluoreszierenden mCherry-Protein markiert ist (Zusatzdatei 1), in 100 μl serumfreiem DMEM in einem 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 3 μg Polyethylenimin (PEI, siehe Materialtabelle) zu 100 μl serumfreiem DMEM pro Transfektion hinzu, wobei jede Transfektion in ein anderes 1,5-ml-Röhrchen gegeben wird. Das Plasmid:PEI-Verhältnis sollte 1:3 (μg:μg) betragen.</li>
	<li>Beide Röhrchen aus Schritt 1.4 und Schritt 1.5 10 s lang vortexen und mindestens 5 Minuten bei Raumtemperatur ruhen lassen.</li>
	<li>Mischen Sie einen Teil (100 μl pro Well) der DNA-Lösung aus Schritt 1.4 mit einem Teil (100 μl pro Well) der PEI-Lösung aus Schritt 1.5. Die endgültige Lösung wird 10 s lang vorgewirbelt und bei Raumtemperatur mindestens 20 Minuten und bis zu 6 Stunden ruhen gelassen.</li>
	<li>Nehmen Sie die 12-Well-Platte aus dem Inkubator. Die endgültige Lösung aus Schritt 1.7 vortexen und 200 μl in jede der Vertiefungen in der 12-Well-Platte aus Schritt 1.3 geben. Legen Sie die 12-Well-Platte wieder in den befeuchteten Inkubator (Schritt 1.1).</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 3 Stunden das Medium in jeder Vertiefung durch 1 ml vollständiges DMEM. Legen Sie die 12-Well-Platte wie in Schritt 1.1 wieder in den befeuchteten Inkubator.</li>
	<li>Nach 2 Tagen wird die transfizierte Zellkultur aus dem 37 °C/5 % CO2 -Inkubator entnommen und mit 10-facher Vergrößerung auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop gelegt.</li>
	<li>Fokussieren Sie mit dem Fokusrad des Mikroskops auf die Zellen, während Sie Hellfeldlicht verwenden.</li>
	<li>Wechseln Sie zu den fluoreszierenden mCherry-Anregungs- (587 nm) und Emissionswellenlängen (610 nm) und schalten Sie das Hellfeldlicht aus. Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Zellen, um die Expression von ZnT1 mCherry zu bestätigen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Farbstoffbeladungslösung vor.<ol><li>Ein Aliquot von 4 μl Zink-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff (siehe Materialtabelle) in seiner Acetoxymethyl (AM)-Ester-Form, gelöst in DMSO (1 μg/μl), wird aus einem lichtgeschützten Material entnommen, das in einem Gefrierschrank von −20 °C gelagert wird. Diese Form ermöglicht es dem Farbstoff, durch einfache Diffusion durch die Plasmamembran in die Zelle einzudringen.</li>
		<li>4 μl 10%ige Pluronsäure (oder 2 μl 20%ige Pluronsäure, siehe Materialtabelle) werden zu dem Aliquot aus Schritt 1.13.1 gegeben. Mischen Sie die Lösung gut, indem Sie dreimal auf und ab pipettieren, und geben Sie dann alle 8 μl in ein 1,5-ml-Röhrchen.</li>
		<li>750 μl Ringer-Lösung (intern hergestellt, siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung), ergänzt mit 1 mg/ml (~0,1 %) Rinderserumalbumin, in das Röhrchen aus Schritt 1.13.2 geben und kräftig vortexen. Fügen Sie weitere 750 μl derselben Lösung hinzu und wirbeln Sie erneut vor, um eine maximale Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	</ol></li>
	<li>750 μl der endgültigen Lösung aus Schritt 1.13.3 in zwei Vertiefungen in einer neuen 6-Well-Kulturplatte zugeben. Mit Alufolie abdecken. HINWEIS: Um ein Bleichen zu vermeiden, wird die 6-Well-Platte ab diesem Schritt immer mit Aluminiumfolie abgedeckt.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette bis zu vier replizierte Deckgläser von der transfizierten Zellkulturplatte und legen Sie sie in die erste gefüllte Vertiefung (bis zu vier Objektträger pro Vertiefung) der neuen 6-Vertiefungsplatte aus Schritt 1.14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite gefüllte Mulde. HINWEIS: Alle Deckgläser in derselben gefüllten Vertiefung müssen aus demselben Zustand stammen. Jede Bohrung kann jedoch unterschiedliche Bedingungen enthalten.</li>
	<li>Mit Alufolie abdecken und 15-20 Minuten vorsichtig schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie die Farbstoffbeladungslösung und ersetzen Sie sie durch eine neue Waschlösung aus Ringer-Plus-Albumin, wie in Schritt 1.13.3 verwendet. Mit Alufolie abdecken. Nochmals 20 Min. schütteln lassen. Dies ermöglicht die Spaltung des AM-Esters durch die intrazellulären Esterasen.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Mikroskops
<ol><li>Ordnen Sie die erforderlichen Werkzeuge (siehe Materialtabelle) wie erwähnt an: ein inverses Fluoreszenzmikroskop, das GFP- und mCherry-Fluorophore nachweisen kann, ein Perfusionssystem, das den Wechsel zwischen mindestens zwei Lösungen ermöglicht, ein Absaugsystem und eine Perfusionskammer.</li>
	<li>Schalten Sie das Mikroskop, die Lichtquelle und die Kamera ein. Schalten Sie das Absaugsystem ein.</li>
	<li>Waschen Sie das Perfusionssystem. Waschen Sie die erste Kammer mit Ringer-Lösung und die zweite Kammer mit Ringer-Lösung, die 7 μM Zinklösung enthält, ergänzt mit 7 μM Pyrithion (Zinkionophor, siehe Materialtabelle). Um Luftblasen oder Lücken zu vermeiden, lassen Sie etwas Flüssigkeit in jeder Kammer. HINWEIS: Da beide Behälter mit demselben Schlauch verbunden sind, der mit der Perfusionskammer verbunden ist, stellen Sie immer sicher, dass das gemeinsame Segment mit der Ringer-Lösung gewaschen wird.</li>
	<li>Schließen Sie die Wasserhähne und füllen Sie die entsprechenden Kammern mit Ringer-Lösung und Ringer-Zink-Lösung, wie in Schritt 2.3 beschrieben.</li>
</ol>3. Probenvorbereitung
<ol><li>Nehmen Sie die Perfusionskammer und platzieren Sie sie mit der schmalen Seite der Rille nach oben. HINWEIS: Die Rille ist ein Loch in der Mitte der Perfusionskammer. Es ermöglicht der Perfusionsflüssigkeit den Zugang zu den Zellen. Eine Seite der Nut ist schmal und die gegenüberliegende Seite breit.</li>
	<li>Tragen Sie ein Dichtungssilikon (siehe Materialtabelle) um die Nut herum auf. Reinigen Sie das Dichtungssilikon mit einer Pipettenspitze von der Nut. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass um die Nut herum genügend Silikondichtung vorhanden ist, um ein 22-mm-Deckglas abzudichten.</li>
	<li>Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette ein Deckglas aus der Waschlösung und legen Sie es mit den Zellen nach unten auf die Rille. Auf diese Weise werden die Zellen während des Experiments der Lösung ausgesetzt, die die Rille durchströmt.</li>
	<li>Legen Sie ein 22-mm-Deckglas auf das 13-mm-Deckglas und ziehen Sie es mit der Pinzette fest. Achten Sie darauf, dass die Deckgläser nicht reißen.</li>
	<li>Drehen Sie die Kammer um und drücken Sie darauf, um alle vorhandenen Flüssigkeiten freizusetzen. Füllen Sie die Nut mit 100 μl der Waschlösung von Ringer und drücken Sie erneut, um sicherzustellen, dass keine Leckagen entstehen. HINWEIS: Wenn eine Leckage festgestellt wird, tragen Sie ein Dichtmittel an der Stelle der Leckage auf und führen Sie einen erneuten Test durch.</li>
	<li>Montieren Sie die Perfusionskammer auf der Plattform und sichern Sie sie. Platzieren Sie die Perfusions- und Saugschläuche, um eine Perfusion über die Zellen in der Rille zu ermöglichen.</li>
	<li>Ändern Sie die Perfusionsrate auf ca. 2 ml/min und schalten Sie die Perfusion der Ringerlösung ein. Stellen Sie sicher, dass das Perfusionssystem ohne Leckagen oder Überschwappen funktioniert.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Messung
<ol><li>Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Materialtabelle) mit einem Doppelklick auf das Symbol. Melden Sie sich mit den entsprechenden Anmeldeinformationen an. Wählen Sie die angeschlossene Kamera aus und drücken Sie OK.</li>
	<li>Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops mit der Taste auf der linken Seite des Mikroskops auf 10x ein.</li>
	<li>Wählen Sie die Live-Ansicht und verwenden Sie den Joystick, um die Plattform zu bewegen, um sich auf die Zellen in der Rille zu konzentrieren.</li>
	<li>Schalten Sie während der Perfusion das Licht aus und ändern Sie die Wellenlänge auf mCherry, indem Sie die entsprechende Taste in der Benutzeroberfläche drücken. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokussierrad des Mikroskops ein.</li>
	<li>Sobald das Mikroskop auf die Zellen fokussiert ist, bewegen Sie die Plattform mit dem Joystick, um die Auswahl der entsprechenden Zellfelder zu ermöglichen. HINWEIS: Ein geeigneter Bereich gilt als Bereich mit mindestens 10 Zellen für eine ROI und einem leeren Bereich für den Hintergrund.</li>
	<li>Wählen Sie das Dropdown-Menü "ROIs ein-/ausschalten" aus, und wählen Sie " Zirkuläre ROIs zeichnen".</li>
	<li>Zeichnen Sie ROIs von Zellclustern mit den mCherry-exprimierenden Zellen (zeigt die Expression von ZnT1 an).</li>
	<li>Klicken Sie in der gleichen Symbolleiste wie in Schritt 4.6 auf die Schaltfläche Hintergrund-ROIs ein-/ausschalten und passen Sie die Position und Größe der Hintergrund-ROI auf einen Bereich ohne Zellen an.<ol><li>Überprüfen Sie die mCherry- und EGFP-Wellenlängen, um sicherzustellen, dass sich keine Zellen im ausgewählten Hintergrund-ROI befinden. ANMERKUNG: Die Wellenlängen wurden so eingestellt, dass mCherry eine Anregungswellenlänge von 520 nm und eine Emissionswellenlänge von 610 nm und EGFP eine Anregungswellenlänge von 470 nm und eine Emissionswellenlänge von 520 nm verwendete.</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie die Unterregisterkarte Wellenlänge (λ) aus. Markieren Sie das entsprechende Kontrollkästchen und stellen Sie sicher, dass die GFP-Wellenlänge vorhanden und das Kontrollkästchen aktiviert ist. Wenn nicht, fügen Sie es hinzu und markieren Sie es.</li>
	<li>Wählen Sie die Unterregisterkarte Dauer aus. Definieren Sie das Messintervall als alle 5 s, und ändern Sie die Anzahl der Intervalle entsprechend der Versuchsdauer.</li>
	<li>Klicken Sie im Abschnitt Fokus auf dem Mikroskoppanel unter dem Okular auf die Schaltfläche Ein , um das perfekte Fokussystem (PFS) zu aktivieren.</li>
	<li>Stellen Sie mit dem PFS-Fokusrad den Fokus ein. Stellen Sie in der Softwareschnittstelle unter ND-Erfassung sicher, dass PFS ein aktiviert ist.</li>
	<li>Klicken Sie auf Jetzt ausführen.</li>
</ol>5. Experimenteller Ablauf
<ol><li>Beginnen Sie mit einer 90-Sekunden-Baseline-Periodenmessung mit der Ringer-Lösungsperfusion.</li>
	<li>Schalten Sie nach Ablauf des Ausgangszeitraums die Perfusion der Ringer-Lösung aus und dann die Zinklösungsperfusion des Ringers ein. Markieren Sie den Wechsel der Lösung, indem Sie auf die rote Flagge unten rechts in der Hauptoberfläche klicken. Es wird erwartet, dass ein Anstieg der Fluoreszenz auftritt.</li>
	<li>Sobald der Fluoreszenzanstieg zu sättigen beginnt, wechseln Sie wieder zur Perfusion mit Ringer-Lösung. Schalten Sie die Perfusion der Ringer-Zinklösung aus und dann die Perfusion der Ringer-Lösung.</li>
	<li>Warten Sie, bis die Testzeit abgelaufen ist. Eine spürbare, aber stetige Abnahme der Fluoreszenz ist zu erwarten, wenn das ZnT1 richtig funktioniert.</li>
</ol>6. Datenexport
<ol><li>Um die Daten mit Basisliniensubtraktion zu exportieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Basislinie subtrahieren und sehen Sie sich die Änderungen im "ND-Erfassungsfenster" an.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren in der Softwareoberfläche im "ND-Erfassungsfenster". Es öffnet sich ein Excel-Datenblatt. Speichern Sie am gewünschten Speicherort.</li>
</ol>7. Datenanalyse
<ol><li>Erstellen Sie für jeden ROI eine durchschnittliche Baseline-Fluoreszenz aus den ersten 90 bis 100 Sekunden.</li>
	<li>Geben Sie die für jede ROI berechnete Fluoreszenz als Prozentsatz des Hintergrunds für diese ROI an.</li>
	<li>Erstellen Sie einen Zeilendurchschnitt aller ROIs, und stellen Sie das Ergebnis als Liniendiagramm dar. Dadurch entsteht ein Durchschnitt aller ROIs in Abhängigkeit von der Zeit.</li>
	<li>Wählen Sie mit der linearen Anpassungsfunktion die Anfangsrate für die Abnahme der Fluoreszenz nach dem Waschen mit der Ringer-Lösung. Der Steigungswert der Gleichung korreliert mit der Transportgeschwindigkeit.</li>
</ol>

Untersuchung des Zinktransportmechanismus in Säugetierzellen mit dem FluoZin-3-Assay

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die oben beschriebene Methode ermöglicht die direkte Messung der intrazellulären Zinkkonzentration mit hoher zeitlicher Auflösung. Im Vergleich zu anderen Methoden kann diese Methode, bei der Veränderungen des intrazellulärenZn2+ überwacht werden, das Hintergrundrauschen erheblich verringern. Darüber hinaus eliminiert die Selektivität des Farbstoffs für Zink mögliche Kreuzwechselwirkungen mit anderen Metallkationen18,19. Schließlich ermöglicht das Fehl...

Zink ist ein essentielles Spurenelement im zellulären Milieu. Es enthält ein Drittel aller Proteine und ist an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt, wie z. B. Katalyse1, Transkription2 und Strukturmotive3. Obwohl sie redoxinert sind, sind hohe Zinkkonzentrationen für die Zelle toxisch, weshalb kein Säugetierorganismus ohne das Vorhandensein von Mechanismen zur Regulierung der Zinkhomöostase überlebt hat. Bei Säugetieren sind drei Mechanismen für diesen Prozess verantwortlich: (1) Metallothionine, das sind zytosolische Cystein-reiche Proteine, die Zink mit hoher Affinität binden und so einen Überschuss an freiem zytosolischem Zink verhindern4; (2) Zrt/Irt-ähnliche Proteine (ZIPs), bei denen es sich um Zinktransporter handelt, die für den Zinkeinstrom in das Zytosol durch die Plasmamembran oder aus intrazellulären Organellen verantwortlich sind 4,5,6,7,8; und (3) ZnTs, die eine Säugetier-Untergruppe der ubiquitären Familie der Kationen-Diffusions-Facilitatoren (CDF) sind und Zinktransporter sind, da sie Zink aus dem Zytosol über die Plasmamembran oder in die intrazellulären Organellen extrudieren 4,5,6,7,8,9. Aufgrund der Bedeutung von Zink für den Zellstoffwechsel ist es wichtig, die zelluläre Zinkdynamik zu verstehen.
Bisherige Methoden zur Beurteilung der Zinkdynamik beruhten auf der Bewertung der Expressionsniveaus von mRNA unter verschiedenen Zinkbedingungen, indem sie mit zellulären Zinkmessungen von fixierten Geweben oder Zellen korreliertwurden 10,11,12. Zu diesen Methoden gehören der chemische Nachweis und die immunhistochemische Färbung. Diese Methoden liefern jedoch nur indirekte Messungen und bestimmen somit nur eine Offline-Korrelation zwischen der intrazellulären Zinkkonzentration und der Expression von Zinktransportern. Folglich können diese Methoden keine Parameter ableiten, die eine hohe zeitliche Auflösung erfordern.
Für eine direktere Messung desZn2+ -Transports werden radioaktive Isotope von Zink13 verwendet. Diese Methode beruht auf der Messung von radioaktiv markiertem Zn2+ , um den Zinktransport und seine Kinetik zu überwachen. Aufgrund der Bedeutung von Zink für die zelluläre Homöostase regulieren jedoch mehrere zelluläre Prozesse die intrazelluläre Zinkkonzentration. Dazu gehören die extrazelluläre Bindung und mehrere Transportsysteme, die zusammenarbeiten, um eine strenge Kontrolle über den intrazellulärenZn2+ -Spiegel aufrechtzuerhalten. Durch die Kombination dieser Prozesse entsteht ein erhebliches Hintergrundrauschen, das es schwierig macht, einzelne zinkbezogene Transportfunktionen zu testen.
Dieser Artikel demonstriert eine Methode zur direkten Überwachung der Zinktransportrate durch Messung der intrazellulären Konzentration von freiem Zink mit einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3. Der Farbstoff hat eine hohe Spezifität fürZn2+ und geringe Interferenzen durch andere zweiwertige Kationen, wie z. B. Kalzium. Darüber hinaus gelangt es in seiner Esterform durch nichtionische Diffusion in die Zellen und wird dann aufgrund der Aktivität der intrazellulären Diesterase gefangen. Daher korreliert seine Fluoreszenz in erster Linie mit der Konzentration des freien zytosolischen Zinks. Diese Experimente wurden durchgeführt, um die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransporter 1 (ZnT1), einem Mitglied der ZnT-Familie, zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>10 cm Platte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12-Well Zellkulturplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Deckgläser</td><td>Superior Marienfeld</td><td>111530</td><td></td></tr><tr><td>22 mm Deckgläser</td><td>Superior Marienfeld</td><td>101050</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatte</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>bioWorld</td><td>22070008</td><td></td></tr><tr><td>wasserfreies Calciumchlorid, granuliert</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Konzentration in Ringer-Lösung: 1 mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Glentham Life Science</td><td>GC6947</td><td>Konzentration in Ringer-Lösung: 10 mM</td></tr><tr><td>Dubelco' s Modified Eagle Media (DMEM)</td><td>Sartorius</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TI-DH</td><td>Abgekündigt. Ersetzt durch Eclipse Ti2</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Dumont</td><td>0203-55-PS</td><td></td></tr><tr><td>Fluozin-3AM</td><td>Invitrogen</td><td>F24195</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x Lösung</td><td>Cytiva</td><td>SV30010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LED-Beleuchtungssystem</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Merck</td><td>1.05833</td><td>Konzentration in Ringer-Lösung: 0,8 mM</td></tr><tr><td>N[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure] (HEPES)</td><td>Formedium</td><td></td><td>HEPES10 Konzentration in Ringer-Lösung: 10 mM</td></tr><tr><td>Neo 5.5 sCMOS-Kamera</td><td>ANDOR</td><td>DC-152Q-FI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Bildgebungssoftware</td><td>Nikon</td><td>AR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronsäure F-127</td><td>Millipore</td><td>540025</td><td></td></tr><tr><td>Pottasiumchlorid</td><td>Bio-Lab</td><td>163823</td><td>Konzentration in Ringer-Lösung: 5,4 mM</td></tr><tr><td>Pyrithion</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3261</td><td>Konzentration in Ringer-Zink-Lösung: 7 &mu; M</td></tr><tr><td>Silikonfett Kit</td><td>Warner Instruments</td><td>W4 64-0378</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Bio-Lab</td><td>190305</td><td>Konzentration in Ringer-Lösung: 120 mM</td></tr><tr><td>Zinksulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31665</td><td>Konzentration in Ringer-Zink-Lösung: 7 &mu; M</td></tr></tbody></table>

charakterisierung von zinktransportern in säugetieren mit einem in-vitro-zinktransportassay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Übergangsmetalle wieZn2+-Ionen müssen aufgrund ihrer zellulären Toxizität streng reguliert werden. Bisher wurde die Aktivität von Zn2+-Transportern indirekt gemessen, indem das Expressionsniveau des Transporters unter verschiedenen Konzentrationen vonZn2+ bestimmt wurde. Dies geschah mit Hilfe der Immunhistochemie, der Messung von mRNA im Gewebe oder der Bestimmung des zellulärenZn2+-Spiegels. Mit der Entwicklung intrazellulärerZn2+-Sensoren werden die Aktivitäten von Zinktransportern derzeit hauptsächlich durch die Korrelation von Veränderungen des intrazellulären Zn 2+, die mit fluoreszierenden Sonden nachgewiesen werden, mit der Expression der Zn2+-Transporter bestimmt. Doch auch heute noch beobachten nur wenige Labore die dynamischen Veränderungen des intrazellulärenZn2+ und messen damit direkt die Aktivität von Zinktransportern. Ein Teil des Problems besteht darin, dass von den 10 Zinktransportern der ZnT-Familie, mit Ausnahme von ZnT10 (transportiert Mangan), nur Zinktransporter 1 (ZnT1) an der Plasmamembran lokalisiert ist. Daher ist es schwierig, die Transportaktivität mit Änderungen der intrazellulärenZn2+-Konzentration in Verbindung zu bringen. Dieser Artikel beschreibt einen direkten Weg zur Bestimmung der Zinktransportkinetik mit einem Assay, der auf einem zinkspezifischen Fluoreszenzfarbstoff, FluoZin-3, basiert. Dieser Farbstoff wird in seiner Esterform in Säugetierzellen geladen und dann aufgrund der zellulären Diesteraseaktivität im Zytosol gefangen. Die Zellen werden mit Zn2+ beladen, indem dasZn2+-Ionophor Pyrithion verwendet wird. Die ZnT1-Aktivität wird aus dem linearen Teil der Fluoreszenzreduktion nach der Zellauswaschung beurteilt. Die gemessene Fluoreszenz bei einer Anregung von 470 nm und einer Emission von 520 nm ist proportional zum freien intrazellulären Zn2+. Die Auswahl der Zellen, die ZnT1 exprimieren, die mit dem mCherry-Fluorophor markiert sind, ermöglicht es, nur die Zellen zu überwachen, die den Transporter exprimieren. Dieser Assay wird verwendet, um den Beitrag verschiedener Domänen des ZnT1-Proteins zum Transportmechanismus von humanem ZnT1 zu untersuchen, einem eukaryotischen Transmembranprotein, das überschüssiges Zink aus der Zelle extrudiert.

ZnT1 ist ein Zinktransporter von Säugetieren, der sich auf der Zellplasmamembran13 befindet. Es ist ein Mitglied der Familie der Kationendiffusions-Facilitatatoren (CDF), die Zink aus dem Zytosol in das extrazelluläre Millieu extrudieren14. ZnT1 hat eine Zwei-Domänen-Architektur: die Transmembrandomäne, die die Ionen durch die Membran transportiert, und eine C-terminale Domäne14. Im Gegensatz zu anderen bekannten CDF-Proteinen besitzt ZnT1 eine erwei...

Die Messung des Zinktransports hat sich aufgrund der schwachen kausalen Verbindungen zur Proteinfunktion und der geringen zeitlichen Auflösung als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Überwachung der Zn2+-Extrusion aus lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung eines Zn2+-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoffs, der eine direkte Messung desZn2+-Ausflusses ermöglicht.

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

Meine Forschung konzentriert sich auf die Struktur-Funktions-Beziehung von Zinktransportern in Säugetieren, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Regulationsmechanismus. Aufgrund der Bedeutung von Zinkionen für die Zellfunktion ist es schwierig, eine genaue Messung der zellulären Zinkdynamik zu erhalten. Unser Protokoll adressiert das niedrige Signal-Rausch-Verhältnis und die geringe zeitliche Auflösung der Zinkdynamik.Diese Methode ermöglicht es, den Zinkeinstrom durch die Zellmembran mit hoher zeitlicher Auflösung und deutlich weniger Hintergrundrauschen und Kreuzwechselwirkungen durch andere zweiwertige Kationen zu testen. Wir fanden heraus, dass die unstrukturierte Verlängerung des Säugetiertransporters ZnT1 um eine C-terminale Domäne nicht an der Zinktransportfunktion beteiligt ist. Dies ermöglicht es den Forschern, sich auf andere Domänen des ZnT1-Proteins für die Regulierung des Zinktransports zu konzentrieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein effizientes Verfahren zur Oligomerisierung Neigung der Single-Pass-Transmembrandomänen (TMD) zu beurteilen ist beschrieben. Chimäre Proteine, bestehend aus dem TMD fusioniert ToxR sind in einer E. coli-Stamm-Reporter zum Ausdruck gebracht. TMD-induzierte Oligomerisierung Ursachen Dimerisierung von ToxR, Aktivierung der Transkription und Produktion von der Reporter-Proteins,-Galactosidase.

Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

Quelle: Maurakis, S., et al. Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae zur Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallaufnahme aus Wirtsliganden. J. Vis. Exp. (2020).Dieses Video zeigt einen metallbegrenzten Bakterienwachstumsassay, um die Rolle von metallresponsiven Genen zu untersuchen. Wildtyp- und mutierte Bakterien, die in metallabgereichertem Medium gezüchtet werden, werden mit Metallliganden inkubiert und ihr Wachstum wird mit einem Plattenleser überwacht. Unter...

Metallbegrenzter bakterieller Wachstumsassay zur Untersuchung der Rolle von metallresponsiven Genen

Wir stellen ein Protokoll für die in vitro Untersuchung der Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines robusten, reversibel und abstimmbare Protonengradienten in der Liposomenmembran und daher sollte anpassungsfähig an jede Membranprotein vom protomotive Kraft erregt werden.

In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

Proteoliposomen werden verwendet, um gereinigte Kanäle und Transporter zu untersuchen, die in einer gut definierten biochemischen Umgebung rekonstituiert werden. Ein experimentelles Verfahren zur Messung des durch diese Proteine vermittelten Ausflusses wird veranschaulicht. Die Schritte zur Präparation von Proteoliposomen, zur Durchführung der Aufzeichnungen und zur Analyse der Daten zur quantitativen Bestimmung der funktionellen Eigenschaften des rekonstituierten Proteins werden beschrieben.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

Zinkfingerdomänen sind eigen zellpermeablen und fähig zur Vermittlung Proteinabgabe in einem weiten Bereich von Säugetierzelltypen. Hier wird eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Durchführung Zinkfinger-Technologie für die intrazelluläre Proteinabgabe dargestellt.

Direkter Protein Lieferung Säugerzellen mit Zellpermeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt; Zink-Finger-Domains

Ein Protokoll für die Gewinnung von periplasmatischen Übergangsmetall Chaperon im Zusammenhang mit seiner nativen Bindungspartner und biophysikalischen Charakterisierung des Inhalts Substrat durch Röntgen-Fluoreszenz und Radiometal Aufnahme dargestellt wird.

Wesentlichen Metall Aufnahme in Gram-negativen Bakterien: Röntgen-Fluoreszenz, Radioisotopen, und Zelle Fraktionierung

Das Ziel dieses Protokolls ist, spektralphotometrisch Trans-Plasma Membran Elektronentransport Nutzung extrazelluläre Elektronen Akzeptoren überwachen und enzymatische Interaktionen zu analysieren, die mit dieser extrazellulären Elektronen-Akzeptoren auftreten können.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Kultivierte Primär-oder etablierte Zelllinien werden häufig verwendet, um grundlegende biologische und mechanistische Fragen als ersten Ansatz anzugehen, bevor tierische Modelle verwendet werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie ganze Zellextrakte und subzelluläre Bruchteile für Studien über Zink (Zn) und andere Spurenelemente mit atomarer Absorbationsspektroskopie vorbereitet werden.

Atomische Absorbance-Spektroskopie zur Messung von intrazellulären Zink-Pools in den Mamänarchalzellen

Dieser Artikel erläutert ausführlich einen systematischen Ansatz zur Bewertung der Verfügbarkeit von Mikromineralien im Atlantischen Lachs. Die Methodik umfasst Werkzeuge und Modelle mit zunehmender biologischer Komplexität: (1) chemische Artbildungsanalyse, (2) In-vitro-Löslichkeit, (3) Aufnahmestudien in Zelllinien und (4) In-vivo-Fischstudien.

Bewertung der Verfügbarkeit von Mineralien in Fischfuttermitteln mit komplementären Methoden, die am Beispiel von Zink im Atlantischen Lachs demonstriert wurden

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Zn2+-begrenzten Medien, Wachstumsgefäßen und Samenkulturen zur Produktion von Zn2+-begrenzten Ribosomen in Mykobakterien. Spuren von Zn2+ führen zu Zn2+-limitierendem Wachstum und wir beschreiben morphogene Merkmale, die als Bioindikatoren verwendet werden, um die Zn2+-Begrenzung in vitro im Modellbakterium Mycobacterium smegmatis und dem humanpathogenen M. tuberculosis zu verifizieren.

Verwendung von Mycobacterium smegmatis als Bioindikator für zinkbegrenzte Wachstumsbedingungen bei Mykobakterien

Erfahren Sie die Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay. Diese Methode ermöglicht die Echtzeitmessung von Zn²⁺-Efflux in HEK293T-Zellen und liefert wertvolle Erkenntnisse zur Funktionalität des ZnT-1-Transporters.

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

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