Name: Design und Bau eines anpassbaren, einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie den Bau eines anpassbaren einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken. Diese Methode ermöglicht dreidimensionale Bildgebung mit minimaler Photobleichung.

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Diese Arbeit wurde durch den RUI Award (DMR-2203791) der National Science Foundation (NSF) an J.S. Wir sind dankbar für die Anleitung von Dr. Bin Yang und Dr. Manish Kumar während des Ausrichtungsprozesses. Wir danken Dr. Jenny Ross und K. Alice Lindsay für die Zubereitungsanleitung für die Kinesin-Motoren.

Anpassbares Fluoreszenzmikroskop zur Visualisierung von Zytoskelett-Netzwerken

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
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<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen. Alle Untersuchungen wurden in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt, die als Interessenkonflikt interpretiert werden könnten.

Zwei wichtige Details zu diesem Protokoll sind die Gesamtkosten des Systems und die erwartete Bau- und Ausrichtungszeit. Obwohl die genauen Kosten variabel sind, können wir bequem schätzen, dass die Gesamtkosten für dieses SOLS oder ein ähnliches DIY-System im Bereich von 85.000 USD liegen würden. Wir weisen darauf hin, dass diese Schätzung den Verkaufspreis aller Komponenten berücksichtigt, sodass dieser Gesamtpreis durch die Beschaffung gebrauchter Komponenten stark reduziert werden kann. In Bezug auf die Bauzeit wäre es vernünftig zu erwarten, dass ein Benutzer mit wenig Erfahrung in der Optik dieses gesamte SOLS-System innerhalb von 1-2 Monaten baut und ausrichtet, vorausgesetzt, alle Komponenten sind verfügbar und bereit. Trotz der Länge und Komplexität des Protokolls glauben wir, dass die Menge an Details im schriftlichen Manuskript, gepaart mit dem Videoprotokoll, dieses Protokoll einfach und schnell zu befolgen machen sollte.
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Erstens bestimmt die Platzierung des Galvo die Platzierung vieler Linsen, da es Teil von drei separaten 4f-Linsenpaaren ist. Es ist entscheidend, dass der Galvo sowohl mit den hinteren Brennebenen von O1 und O2 konjugiert als auch korrekt zentriert ist, um ein neigungsinvariantes Scannen zu gewährleisten. Zweitens reagiert die Bildqualität extrem empfindlich auf die Ausrichtung von O2 und O3 zueinander. Hier muss darauf geachtet werden, dass erstens der Ausrichtungswinkel von O3 zu O2 mit der Neigung des Anregungslichtblattes übereinstimmt und somit eine maximal flache Ausleuchtung über das ähnlich geneigte Sichtfeld gewährleistet wird. Zweitens muss O3 im richtigen axialen Abstand platziert werden, um ein flaches Sichtfeld mit einer möglichst großen Fläche zu erhalten. Drittens muss O3 im richtigen seitlichen Abstand von O2 platziert werden, um das Signal zu maximieren, das durch die O2-O3-Schnittstelle fließt.

In Bezug auf das nutzbare Sichtfeld erreichte dieses System ein flaches, zuverlässiges Feld mit gleichmäßiger Ausleuchtung über eine Fläche von 80 μm x 80 μm. Dieser Bereich ist kleiner als das von der Kamera bereitgestellte maximale Sichtfeld, daher wird das nutzbare Sichtfeld durch das gelbe Feld in Abbildung 13 angezeigt. In Bezug auf das Auflösungsvermögen erreichte dieses System einen minimalen auflösbaren Abstand von 432 nm entlang der x-Achse und 421 nm entlang der y-Achse, der gemessen wurde, indem die durchschnittlichen Sigma x und y der Gaußschen Anpassungen an Punktverteilungsfunktionen (PSFs) im guten FoV ermittelt und mit zwei multipliziert wurden. Wir stellen fest, dass dieses System nicht in Bezug auf seine Gesamt-NA optimiert wurde, was bedeutet, dass es Raum für erhebliche Verbesserungen gibt, wenn Benutzer ein höheres Auflösungsvermögen wünschen als das, was dieses System erreicht hat. Es gibt eine Vielzahl kompatibler Objektivoptionen für diese Art von SOLS-Build, von denen viele zu einer höheren Systemauflösung beitragen würden, jedoch mit den Nachteilen höherer Kosten, eines kleineren Sichtfelds oder komplizierterer Ausrichtungstechniken an der Relaisschnittstelle 8,11,13,20. Unabhängig davon, falls Benutzer ein größeres Sichtfeld wünschen, würde die Einbeziehung eines zweiten Galvo, um 2D-Scans zu ermöglichen, dieses Ziel erreichen, würde jedoch zusätzliche Optiken und Steuerungsmechaniken erfordern, die in das Designintegriert werden müssten 32. Wir haben weitere Details zu Änderungen am System auf unserer Website-Seite bereitgestellt, zusammen mit Links zu anderen hilfreichen Ressourcen zum Designprozess23.

Neben der Verbesserung der spezifischen Komponenten für dieses spezielle Design wäre es sehr gut möglich, diesem Build andere hochauflösende Mikroskopietechniken oder -modalitäten hinzuzufügen. Eine solche Verbesserung wäre die Integration einer Multiwellenlängenbeleuchtung, bei der zusätzliche Anregungslaser auf den ursprünglichen Anregungspfad8 ausgerichtet würden. Da diese Art von SOLS-Design die Probe zugänglich lässt, ist das Hinzufügen zusätzlicher Funktionen zum Mikroskop, einschließlich, aber beschränkt auf optische Pinzette, Mikrofluidik und Rheometrie, relativ einfach 2,33.

Im Vergleich zu den unzähligen veröffentlichten Lichtblatt-Leitfäden bietet dieses Protokoll Anweisungen auf einer Verständnisebene, die ein Benutzer ohne nennenswerte optische Erfahrung hilfreich finden kann. Indem wir einen benutzerfreundlichen SOLS-Build mit traditionellen Probenträger-Montagemöglichkeiten einem größeren Publikum zugänglich machen, hoffen wir, die Anwendungen der SOLS-basierten Forschung in allen Bereichen, in denen das Instrument eingesetzt wurde oder werden könnte, noch weiter auszubauen. Auch wenn die Zahl der Anwendungen von SOLS-Instrumenten schnell zunimmt, glauben wir, dass viele Vorteile und Anwendungen von SOLS-Instrumenten noch unerforscht sind, und sind begeistert von den Möglichkeiten, die diese Art von Instrumenten in Zukunft bietet.

Die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) stellt eine Familie hochauflösender Fluoreszenzbildgebungsverfahren dar, bei denen das Anregungslicht zu einem Blatt 1,2 geformt wird, einschließlich selektiver Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM), gesweepter konfokal ausgerichteter planarer Anregung (SCAPE) und Schrägebenenmikroskopie (OPM)3,4,5,6,7. Im Gegensatz zu anderen Mikroskopiemodalitäten wie Epifluoreszenz, Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) oder konfokaler Mikroskopie ist die Phototoxizität bei LSFM minimal und Proben können über längere Zeiträume abgebildet werden, da nur die Ebene der aktiv abgebildeten Probe beleuchtet wird 8,9,10. Daher sind LSFM-Techniken äußerst nützlich für die Bildgebung von 3D-Proben über längere Zeiträume, insbesondere auch solche, die für konfokale Mikroskopietechniken zu dick sind. Aus diesen Gründen ist LSFM seit seiner ursprünglichen Entwicklung im Jahr 2004 für viele Physiologen, Entwicklungsbiologen und Neurowissenschaftler zum Bildgebungsverfahren der Wahl für die Visualisierung ganzer Organismen wie lebender Zebrafisch- und Drosophila-Embryonen geworden 3,4,6,11 . In den letzten zwei Jahrzehnten wurden die Vorteile von LSFM genutzt, um Struktur und Dynamik auf immer kleineren Skalen zu visualisieren, einschließlich der Gewebeskala11,12, der zellulären und subzellulären Skala, sowohl in vivo als auch in vitro 13,14,15,17.
Trotz der Berichte über erfolgreiche Anwendungsfälle in der Literatur verhindern die hohen Kosten kommerzieller LSFM-Systeme (~0,25 Millionen USD zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Artikels)18,19 den weit verbreiteten Einsatz der Technik. Um DIY-Builds zu einer praktikablen Alternative für Forscher zu machen, wurden mehrere Build-Leitfädenveröffentlicht 8,13,20,21, einschließlich der Open-Access-Initiative OpenSPIM 22. Bisher können Forscher mit minimaler Erfahrung in der Optik jedoch nur frühere LSFM-Designs verwenden, die mit herkömmlichen objektträgermontierten Proben nicht kompatibel sind (Abbildung 1A). Die jüngste Implementierung von SOLS (Single-Objective, Light-Sheet) verwendet ein einziges Objektiv sowohl für die Anregung als auch für die Detektion (Abbildung 1C), wodurch die Einschränkungen in Bezug auf die Kompatibilität 5,6,8,13,20 überwunden werden. Die Kosten für die Vielseitigkeit des SOLS-Designs sind jedoch eine erhebliche Erhöhung der Komplexität des Builds, da zwei zusätzliche Objektive erforderlich sind, um die Objektebene zur Bildgebung auf die Kamera zu übertragen, zu entkippen und neu abzubilden (Abbildung 1D). Um den Zugang zu den komplexen Setups im SOLS-Stil zu erleichtern, enthält dieses Dokument eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Design, zum Bau, zum Ausrichtungsprozess und zur Verwendung eines folienkompatiblen SOLS-Systems, die für Forscher mit Kenntnissen nur in einem Optik-Einstiegskurs nützlich wäre.
Obwohl das Protokoll selbst kurz und bündig ist, müssen die Leser während der Vorbereitungsschritte auf andere Ressourcen zurückgreifen, um mehr über bestimmte Teile des Designs oder Hardwareüberlegungen zu erfahren. Wenn ein Leser jedoch beabsichtigt, die Spezifikationen dieses Designs zu befolgen, ist es möglicherweise nicht erforderlich zu verstehen, wie bestimmte optische Komponenten ausgewählt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Abbildung 1: Eigenschaften verschiedener LSFM-Konfigurationen. (A) Der Aufbau mit zwei orthogonalen Objektiven, die in frühen LSFM-Designs üblich waren. In dieser Konfiguration wird ein Kapillarröhrchen oder ein Zylinder mit Gel verwendet, um die Probe aufzunehmen, was mit herkömmlichen Objektträgerbefestigungstechniken nicht kompatibel ist. (B) ein Schema eines SOLS-Lichtblattdesigns, das Folgendes zeigt: (C) das einzige Objektiv, das sowohl für die Anregung als auch für die Emissionssammlung in der Probenebene (O1) verwendet wird; Dies ermöglicht die Montage eines herkömmlichen Schlittens auf der Oberseite und (D) des Relaisobjektivsystems im SOLS-Emissionspfad. O2 sammelt das Emissionslicht und verkleinert das Bild. O3 bildet das Flugzeug im richtigen Neigungswinkel auf den Kamerasensor ab. Abkürzungen: LSFM = Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie; SOLS = Ein-Ziel-Leuchtfolie; O1-O3 = Ziele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>1" Plankonkave Linse f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Für Ausrichtungslaser Geschätzte Kosten: $49.5</td></tr><tr><td>1" Achromatisches Dublett f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 und Ausrichtungslaser Geschätzte Kosten: $342.42</td></tr><tr><td>1" Achromatisches Dublett f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Geschätzte Kosten: $114.14</td></tr><tr><td>1" Achromatisches Dublett f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Geschätzte Kosten: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" achromatisches Wams f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Geschätzte Kosten: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" achromatisches Wams f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Geschätzte Kosten: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" achromatisches Wams f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Geschätzte Kosten: 114,14 $</td></tr><tr><td>1" Zylinderlinse f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Geschätzte Kosten: 117,62 $</td></tr><tr><td>1" Zylinderlinse f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Geschätzte Kosten: 111,22 $</td></tr><tr><td>1" Zylinderlinse f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Geschätzte Kosten: 117,62 $</td></tr><tr><td>1" montierte Lochblende, 30 & Mikro; m Lochdurchmesser</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Geschätzte Kosten: 77,08 $</td></tr><tr><td>1" Silberner Spiegel (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, einer für die Ausrichtung Geschätzte Kosten: 168,78 $</td></tr><tr><td>2" Ellipsenspiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Geschätzte Kosten: 179,98 $</td></tr><tr><td>2" Pfostenhalter (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Für kundenspezifische Laserhalterung, ND-Rad, Sicherheitsscheiben Geschätzte Kosten: 98,45 $</td></tr><tr><td>2" Pfosten (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Für kundenspezifische Laserhalterung und optische Komponenten Geschätzte Kosten: 277,3 $</td></tr><tr><td>3" Pfosten (x4) &nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR3</td><td>für M3-Stützen und andere Halterungen Geschätzte Kosten: $ 24.6</td></tr><tr><td>3" Pfostenhalter (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>Geschätzte Kosten: 38,48 $</td></tr><tr><td>30 bis 60 mm Käfigadapter</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Zur Montage von O1 Geschätzte Kosten: 45,42 $</td></tr><tr><td>30-mm-Käfigfilterrad</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Zur Montage von ND-Filtern Geschätzte Kosten: 172,36 $</td></tr><tr><td>30-mm-Käfigplatte (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Zum Bau eines Ausrichtungskäfigs und eines Ausrichtungslasers Geschätzte Kosten: 114,54 $</td></tr><tr><td>30 mm rechtwinklige kinematische Spiegelhalterung (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Zur Montage von M1 und M2 und zum Ausrichten von Laser Geschätzte Kosten: $463.95</td></tr><tr><td>4" Pfostenhalter (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Geschätzte Kosten: $320.1</td></tr><tr><td>561 nm Laser und Netzteil&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Anregungslaser Geschätzte Kosten: $6000</td></tr><tr><td>60mm Käfigplatte (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Zur Montage von TL1 und M3 Halterung Geschätzte Kosten: $88.52</td></tr><tr><td>60mm rechtwinklige kinematische Spiegelhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Zur Montage von M3 Geschätzte Kosten: $187.26</td></tr><tr><td>90&deg; Flip Mount</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>Für Ausrichtungslaser Geschätzte Kosten: 95,5 $</td></tr><tr><td>Adapter mit externen C-Mount-Gewinden und internen SM1-Gewinden</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Zum Verbinden des Objektivtubus mit der Kamera Geschätzte Kosten: $20.96</td></tr><tr><td>Adapter mit externen SM1-Gewinden und internen C-Mount-Gewinden</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Zum Anschließen des Tubusobjektivs an die Objektivhalterung Geschätzte Kosten: 21,82 $</td></tr><tr><td>Adapter mit externen SM1-Gewinden und internen M25-Gewinden (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Zur Montage von O1 und O2 Geschätzte Kosten: 47,06 $</td></tr><tr><td>Adapter mit externen SM1-Gewinden und internen M26-Gewinden</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Zur Montage von O3 Geschätzte Kosten: $22.38</td></tr><tr><td>Ausrichtung Scheibe</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Geschätzte Kosten: 20,45 $</td></tr><tr><td>Ausrichtungslaser</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Geschätzte Kosten: $16.98</td></tr><tr><td>Autoluorescent Plastic Slide, rot&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Geschätzte Kosten: $20</td></tr><tr><td>Beam Shutter&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>zum Blockieren von Laserlicht Geschätzte Kosten: 65,8 $</td></tr><tr><td>Käfigrotationshalterung (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>zur Montage von CL1-3 Geschätzte Kosten: 282,15 $</td></tr><tr><td>Käfigsystemstangen 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>Zur Montage von M3 und O1 Geschätzte Kosten: $44.8</td></tr><tr><td>Käfigsystemstangen 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>Zur Montage von O3 Geschätzte Kosten: $14.28</td></tr><tr><td>Käfigsystemstangen 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Zur Montage von Schlitz Geschätzte Kosten: $30.76</td></tr><tr><td>Käfigsystemstangen 8" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER8</td><td>Für die Ausrichtung der Rohrlinsen Geschätzte Kosten: 25,3 $</td></tr><tr><td>Käfigsystemstangen 12" (x8)</td><td>Thorlabs</td><td>ER12</td><td>Für die Ausrichtung Cage Geschätzte Kosten: 145,36 $</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 sCMOS</td><td>Geschätzte Kosten: ~14.000 $</td></tr><tr><td>Klemmgabel (x35)</td><td>Thorlabs</td><td>CF125</td><td>Zum Festklemmen von Pfostenhalterungen Geschätzte Kosten: 338,8 $</td></tr><tr><td>Abdeckglas, 22 x 22 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td>Für Objektträgerproben Geschätzte Kosten: 265 $</td></tr><tr><td>Dichroitisch&nbsp;</td><td>AVR</td><td>DI01-R405/488/561/635-25x36</td><td>Zur Aufteilung der Exziations-/Emissionspfade Geschätzte Kosten: 965 $</td></tr><tr><td>Schwalbenschwanz-Translationsstufe</td><td>Thorlabs</td><td>DT12</td><td>Zur Verschiebung von Lochblenden Geschätzte Kosten: 90,55 $</td></tr><tr><td>Emissionsfilter</td><td>Thorlabs</td><td>FELHO600</td><td>Geschätzte Kosten: 140,99 $</td></tr><tr><td>Ausrichtungsscheibe aus Milchglas (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1</td><td>Für Ausrichtungskäfig und Zwischenebene Geschätzte Kosten: 75,14 $</td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP 33120A 15 MHz</td><td>Zur Steuerung von Galvo Geschätzte Kosten: 900 $</td></tr><tr><td>Galvanometer - 1D System mit großem Strahldurchmesser</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td>Geschätzte Kosten: 1715,78 $</td></tr><tr><td>Galvanometer-Netzteil</td><td>Siglent</td><td>SPD3303C</td><td>Geschätzte Kosten: 300 $</td></tr><tr><td>Gelrite</td><td>Research Products International</td><td>G35020-100.0</td><td>Gellan-Kaugummi für 3D-Bead-Proben Geschätzte Kosten: 68,25 $</td></tr><tr><td>FIJI Software</td><td>Open-Source-Download</td><td></td><td>von https://imagej.net/software/fiji/downloads Geschätzte Kosten: Kostenlose</td></tr><tr><td>Heizplatte / Rührer</td><td>Corning</td><td>6795-220</td><td>Zur Vorbereitung von Probenlösungen Geschätzte Kosten: $ 550</td></tr><tr><td>K-Cube Brushed Motor Controller</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Drives Z825B Geschätzte Kosten: $ 757.51</td></tr><tr><td>Kinematische Halterung</td><td>Thorlabs</td><td>KM100S</td><td>Zur Montage dichroitischer Geschätzte Kosten: $ 92.01</td></tr><tr><td>Kinesis Software</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td>Download von https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 Geschätzte Kosten: Kostenloser</td></tr><tr><td>Laserlichtblocker</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LB1</td><td>für ND-Filterreflexionen Geschätzte Kosten: 57,65 $</td></tr><tr><td>Laserhalterung</td><td>nach Maß 3D-gedruckt</td><td></td><td> Geschätzte Kosten: N / A</td></tr><tr><td>Laserschutzschirm (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TPS4</td><td>zum Blockieren von Streulaserlicht Geschätzte Kosten: 92,02 $</td></tr><tr><td>Laserscanning-Röhrenlinse</td><td>Thorlabs</td><td>TTL200MP</td><td>TL1 Geschätzte Kosten: 1491 $</td></tr><tr><td>Objektivhalterung (x10) &nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1</td><td>Zur Montage aller Objektive und zusätzlicher Ausrichtungsspiegel. Geschätzte Kosten: 164,7 $</td></tr><tr><td>Magnetisches Lineal</td><td>Thorlabs</td><td>BHM4</td><td>Zur Überprüfung der Ausrichtung Geschätzte Kosten: 52,74 $</td></tr><tr><td>Micro-Manager Software&nbsp;</td><td>Open-Source-Download</td><td></td><td>von https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release Geschätzte Kosten: Kostenlose</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12550400</td><td>Für Objektträgerproben Geschätzte Kosten: 123,9 $</td></tr><tr><td>Mikroskoptisch&nbsp;</td><td>ASI</td><td>FTP-2000 mit kundenspezifischen Teilen</td><td>Zur Feinübersetzung von Proben Geschätzte Kosten: ~$16.000</td></tr><tr><td>Mini-Vortex-Mischer&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10153-688</td><td>Für die Probenvorbereitung Geschätzte Kosten: 152,64 $</td></tr><tr><td>Motorisierter Aktuator</td><td>Thorlabs</td><td>Z825B</td><td>Zur Feinverschiebung M1 Geschätzte Kosten: 729,07 $</td></tr><tr><td>Montierte Standardblende (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>ID20</td><td>Mindestens 2 für Ausrichtung Geschätzte Kosten: 118,02 $</td></tr><tr><td>ND Filterset&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>NDK01&nbsp;</td><td>Um die Anregungsintensität zu reduzieren Geschätzte Kosten: 726,73 $</td></tr><tr><td>Objektiv 1</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Plan Apo 60X/ 1.20 WI</td><td>O1 Geschätzte Kosten: ~15.000 $</td></tr><tr><td>Objektiv 2</td><td>Nikon</td><td>TU Plan Fluor 100X/0,90&nbsp;</td><td>O2 Geschätzte Kosten: ~6.000 $</td></tr><tr><td>Objektiv 3</td><td>Mitutoyo</td><td>Plan Apo HR 50X/0,75</td><td>O3 Geschätzte Kosten: ~6.800 $</td></tr><tr><td>OPM Entzerrungssoftware</td><td>Open-Source</td><td></td><td>Für die Bildverarbeitung. Download von https://github.com/QI2lab/OPM Geschätzte Kosten: Kostenloser</td></tr><tr><td>Photodioden-Leistungssensor</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>S121C</td><td>Zur Messung der Laserintensität Geschätzte Kosten: 379,68 $</td></tr><tr><td>Positives Gitterverzerrungsziel</td><td>Thorlabs</td><td>R1L3S3P</td><td>Brightfield alignment Geschätzte Kosten: 267,87 $</td></tr><tr><td>Leistungsmesser Digitalkonsole</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PM100D</td><td>Zur Messung der Laserintensität Geschätzte Kosten: $1245.48</td></tr><tr><td>Rhodamin 6G</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J62315.14</td><td>Für fluoreszierend beschichtete Objektträgerprobe Geschätzte Kosten: $ 27.7</td></tr><tr><td>Rechtwinklige Klemme für Pfosten</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>RA90</td><td>Für M3-Unterstützung und herunterklappbaren Spiegel Geschätzte Kosten: $32.46</td></tr><tr><td>RMS-Gewindekäfigplatte (x2)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>CP42</td><td>Für Ausrichtungslaser Geschätzte Kosten: 70,56 $</td></tr><tr><td>Scherplatte 2,5-5,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI050P&nbsp;</td><td>Geschätzte Kosten: $182.85</td></tr><tr><td>Scherplatte 5,0-10,0 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI100P</td><td>Geschätzte Kosten: 201,47 $</td></tr><tr><td>Scherplatte 10,0-25,4 mm</td><td>Thorlabs</td><td>SI254P</td><td>Geschätzte Kosten: 236,42 $</td></tr><tr><td>Scherplatten-Sichtschirm</td><td>Thorlabs</td><td>SIVS Geschätzte</td><td>Kosten: 337,74 $</td></tr><tr><td>Scherinterferometer mit 1-3 mm Platte</td><td>Thorlabs</td><td>SI035</td><td>Zur Überprüfung der Kollimation Geschätzte Kosten: 465,85 $</td></tr><tr><td>Slip-On Pfostenkragen (x35)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>R2</td><td>Um die Pfostenhöhe beizubehalten Geschätzte Kosten: 208,25 $</td></tr><tr><td>Schlitz</td><td>Thorlabs</td><td>VA100</td><td>Geschätzte Kosten: 294,64 $</td></tr><tr><td>Geschlitzter Linsentubus, 3"</td> <td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1L30C</td><td>Für die Ausrichtung laser Geschätzte Kosten: 77,45 $</td></tr><tr><td>Quadratischer Spiegel, 1 x 1 "</td><td></td><td></td><td>https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did = 642191768069 & hvpos=& hvne tw=g& hvrand=1336734911900437 4691& hvpone=& hvptwo=& hvqmt= & hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint=& hvlocphy=9031212& hvtargid=pla-1 943952718742& gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB& th=1 Geschätzte Kosten: $14.76</td></tr><tr><td>Stapelbares Objektivrohr 1/2" (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td>Zur Montage von CL1-3 Geschätzte Kosten: $40.86</td></tr><tr><td>Stapelbares Objektivrohr 1"</td> <td>Thorlabs</td><td>SM1L10</td><td>Zur Montage von O3 Geschätzte Kosten: $15.41</td></tr><tr><td>Stapelbares Objektivrohr 2" (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td><td>Für Kamerapfad Geschätzte Kosten: $35.7</td></tr><tr><td>Adapter mit Nieten (x37)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE1</td><td>Zur Befestigung von Pfostenhalterungen an Tisch Geschätzte Kosten: 400,71 $</td></tr><tr><td>Übersetzende Objektivhalterung (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY</td><td>Zur Feinverschiebung von Lochblenden, O2 und O3 Geschätzte Kosten: 441 $</td></tr><tr><td>Übersetzungstisch mit Standard-Mikrometer (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>PT1/M</td><td>TS1-2 Geschätzte Kosten: 647,54</td></tr><tr><td>$ Reisemanueller Übersetzungstisch</td><td>Thorlabs</td><td>CT1A</td><td>O3 Cage Translation Mount Geschätzte Kosten: $497.3</td></tr><tr><td>Tubusobjektiv</td><td>Nikon</td><td>MXA20696</td><td>TL3 Geschätzte Kosten: $359</td></tr> Weiß <tr><td>montierte LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>MNWHL4</td><td>Hellfeld-Lichtquelle Geschätzte Kosten: $171.28</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>GESCHÄTZTE GESAMTKOSTEN: 84.858,98 $</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Die Autoren stellen fest, dass viele Teile gebraucht gekauft wurden. Hier haben wir versucht, den Verkaufspreis aller Artikel widerzuspiegeln, so dass die Gesamtkosten durch den Kauf bestimmter gebrauchter Artikel, insbesondere der teureren, stark gesenkt werden können.</td></tr><tr><td>OPTIONALE KOMPONENTEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper3 USB3</td><td>FLIR &</td><td>nbsp; GS3-U3-23S6C-C</td><td>Für diagnostische Kontrollen während der Ausrichtung. Die Acquisiton-Kamera kann stattdessen verwendet werden, muss aber danach neu ausgerichtet werden. Geschätzte Kosten: $1089</td></tr></tbody></table>

design und bau eines anpassbaren, einobjektiven lichtblatt-fluoreszenzmikroskops zur visualisierung von zytoskelettnetzwerken

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Rekonstituierte Zytoskelett-Komposite haben sich als wertvolles Modellsystem für die Untersuchung von weicher Materie außerhalb des Gleichgewichts herausgestellt. Die originalgetreue Erfassung der Dynamik dieser 3D-dichten Netzwerke erfordert optische Schnitte, die oft mit konfokalen Fluoreszenzmikroskopen in Verbindung gebracht werden. Jüngste Entwicklungen in der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) haben sie jedoch als kostengünstige und manchmal überlegene Alternative etabliert. Um LSFM für Zytoskelettforscher zugänglich zu machen, die mit der Optik weniger vertraut sind, präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für Einsteiger zum Bau eines vielseitigen Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops aus handelsüblichen Komponenten. Um die Probenmontage mit herkömmlichen Objektträgerproben zu ermöglichen, folgt dieses LSFM dem SOLS-Design (Single-Objective Light-Sheet), das ein einziges Objektiv sowohl für die Anregungs- als auch für die Emissionssammlung verwendet. Wir beschreiben die Funktion jeder Komponente des SOLS so detailliert, dass die Leser die Instrumentierung modifizieren und an ihre spezifischen Bedürfnisse anpassen können. Schließlich demonstrieren wir die Verwendung dieses kundenspezifischen SOLS-Instruments, indem wir Astern in Kinesin-gesteuerten Mikrotubuli-Netzwerken visualisieren.

Wir führten volumetrische Scans von 1-μm-Kügelchen durch, die in Gellangummi eingebettet waren. Abbildung 14 zeigt die Projektionen der maximalen Intensität der entzerrten volumetrischen Scans entlang der x-, y- und z-Richtung.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Abbildung 14: Volumetrische Bildgebung von 1 μm fluoreszierenden Kügelchen in Gellangummi. Es werden Projektionen mit maximaler Intensität von entzerrten volumetrischen Scans angezeigt. Maßstabsbalken = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Wir haben die Verwendung des Ein-Objektiv-Lichtblattmikroskops zur Charakterisierung rekonstituierter Zytoskelettnetzwerke demonstriert, indem wir volumetrische Scans von Proben von Mikrotubuli-Astern durchgeführt haben. Kurz gesagt, Rhodamin-markierte, Taxol-stabilisierte Mikrotubuli wurden aus rekonstituierten Dimeren durch GTP polymerisiert; Nach der Polymerisation wurden dann Streptavidin-basierte Kinesin-Motorcluster zusammen mit ATP in Proben gemischt, um Endkonzentrationen von 6 μM Mikrotubuli, 0,5 μM Kinesin-Dimeren und 10 mM ATP zu erhalten. Umfangreiche Protokolle und Leitfäden für die Herstellung von Taxol-stabilisierten Mikrotubuli und Kinesin-Motorclustern finden Sie auf den Websites von Mitchson Lab und Dogic Lab25,26. Die Proben wurden vorsichtig in Objektträger pipettiert, versiegelt und vor der Bildgebung 8 Stunden ruhen gelassen, damit die motorische Aktivität aufhören konnte, so dass die Proben einen stabilen strukturellen Zustand erreichten, der Astern ähnelte.
Studien an rekonstituierten Zytoskelettsystemen verwenden am häufigsten konfokale oder Epifluoreszenzmikroskopie, um markierte Filamente abzubilden. Beide Techniken sind jedoch in ihrer Fähigkeit, dichte 3D-Proben abzubilden, begrenzt27. Während in der In-vitro-Forschung an Zytoskeletten große Fortschritte erzielt wurden, indem Proben auf quasi 2D beschränkt wurden28,29, sind Zytoskelettnetzwerke von Natur aus 3D, und viele aktuelle Bemühungen liegen darin, die Effekte zu verstehen, die nur in 3D-Proben auftreten können29,30, wodurch ein Bedarf an hochauflösender 3D-Bildgebung entsteht.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Abbildung 15: Erleichterung der 3D-Visualisierung von rekonstituierten Zytoskelettproben durch Einzelobjektiv-Lichtblattmikroskopie. (A) Bilder von fluoreszierenden Mikrotubuli-Astern, aufgenommen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica DMi8. Die Bilder zeigen verschiedene Ebenen aus einem Z-Scan. Maßstabsbalken = 30 μm. (B) Entfaltete entzerrte Bilder aus einem volumetrischen Scan, der auf dem Ein-Objektiv-Lichtblatt-Aufbau derselben Probe durchgeführt wurde. Maßstabsbalken = 30 μm. Der entzerrte Bildbereich entspricht hier dem in Abbildung 13B gezeigten nutzbaren Sichtfeld (gelber Kasten). Während sich die konfokale Probe durch die Abbildung einzelner Ebenen in der Nähe des Deckglases auszeichnet, führt die Dichte der fluoreszierenden Probe aufgrund des zusätzlichen Signals von unterhalb der Deckschicht zu Komplikationen bei der Bildgebung in höheren Ebenen. Das Lichtblatt umgeht dieses Problem, indem es nur die Abbildungsebene beleuchtet und so eine gleichmäßig scharfe Abbildung in verschiedenen Ebenen in z ermöglicht. Abkürzungen: SOLS = Single-Objective Light-Sheet; FoV = Sichtfeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
In Abbildung 15 zeigen wir die volumetrische Bildgebung eines rekonstituierten Mikrotubuli-Netzwerks, das von Kinesin-Motorclustern zu asterähnlichen Strukturen zusammengezogen wurde. Wie in früheren Untersuchungengezeigt 28,31, neigen diese 3D-Strukturen dazu, zum Zentrum hin dicht zu werden, was zu hellen Fluoreszenzbereichen führt, die im Signal vorherrschen. In Bildgebungsebenen in der Nähe des Deckglases (niedriges z-Niveau) kann die konfokale Mikroskopie (Abbildung 15A) einzelne Filamente um die Peripherie der Aster herum auflösen, mit zusätzlichem Hintergrund in Richtung Zentrum aufgrund unscharfer Fluoreszenzsignale von oben. Das Verschieben einiger Mikrometer in z verringert jedoch schnell die Qualität der Bilder, da die unscharfen, dichten Abschnitte der Aster im Signal in der Abbildungsebene vorherrschen. Die Einebenenbeleuchtung des Lichtblattes (Abbildung 15B) eliminiert die unscharfen Signale aus den dichten Teilen der Aster über und unter der Abbildungsebene und ermöglicht so eine vergleichbare Bildqualität zwischen den Ebenen. Die Fähigkeit des Lichtblatts, qualitativ hochwertige, zuverlässige volumetrische Scandaten zu erzeugen, eröffnet die Möglichkeit, 3D-Phänomene in rekonstituierten Zytoskelettsystemen zu visualisieren und zu charakterisieren.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie man ein Ein-Objektiv-Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop baut und wie es zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken verwendet wird.

Design und Bau eines anpassbaren, einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Unsere Arbeit zielt darauf ab, das Wissen über den Zusammenhang zwischen Trans-Work-Dynamik, lokaler Struktur und mechanischen Eigenschaften in Materialien zu erweitern, die weit vom Gleichgewicht entfernt sind. Die Visualisierung von Materialien, die weit vom Gleichgewicht entfernt sind, wie z. B. Zytoskelettnetzwerke, erfordert die Fähigkeit, dichte, dreidimensionale Proben mit vergleichbarer Bildqualität über das gesamte Probenvolumen abzubilden und gleichzeitig minimale Schäden durch Photobleaching zu verursachen, eine technisch anspruchsvolle Aufgabe, für die die Fluoreszenzlichtblattmikroskopie am besten geeignet ist. Fluoreszenzlicht-Blattmikroskopsysteme bieten hervorragende optische Schnittfähigkeiten, die die Abbildung dieser dicken, dreidimensionalen Proben über lange Zeitskalen mit minimalem Photobleaching ermöglichen.Insbesondere das von uns vorgestellte Einzelobjektiv-Lichtblattsystem ist mit herkömmlichen Objektträgerproben kompatibel, was es zu einem sehr vielseitigen Werkzeug macht. Die überwiegende Mehrheit der Einzelobjektiv-Lichtblatt-Leitfäden ist für Benutzer mit umfangreicher Erfahrung in der Optik geschrieben. Um die komplexe Einrichtung eines einzelnen Ziels im Lichtblattstil zugänglicher zu machen, enthält dieser detaillierte Leitfaden Schritte, die ein Benutzer mit einem Einsteigerkurs in den Optikkurs befolgen kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In vielen biologischen und klinischen Situationen ist es vorteilhaft, zelluläre Prozesse zu untersuchen, wie sie sich entwickeln in ihrer Muttersprache Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Montage und die Verwendung eines Low-Cost-Glasfaser-Mikroskop, das Echtzeit-Bildgebung in der Zellkultur, Tierversuche und klinische Patientenstudien bieten kann.

Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Mikroskopische Aufnahmen von Live-Endothelzellen exprimieren GFP-Aktin ermöglicht die Charakterisierung der dynamischen Veränderungen in Zytoskelettstrukturen. Im Gegensatz zu Techniken, die fixierten Proben verwenden, bietet diese Methode eine detaillierte Bewertung der zeitlichen Veränderungen in der Aktin-Zytoskelett in den gleichen Zellen vor, während und nach verschiedenen physikalischen, pharmakologischen oder entzündliche Reize.

Studie des Aktin-Zytoskeletts in Live Endothelial Cells, die GFP-Aktin

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Lichtschnittmikroskop und dessen Umsetzung zur in vivo Bildgebung von C. elegans Embryonen.

Einrichten eines Simple Light Noten Mikroskop für<em&gt; In Toto</em&gt; Imaging von<em&gt; C. elegans</em&gt; Entwicklung

Ein Modul für einzelne Ebene Illumination Microscopy (SPIM) beschrieben, die leicht zu einer umgekehrten Weitfeld-Mikroskop angepasst ist und für 3-dimensionale Zellkulturen optimiert. Die Probe wird in einer rechteckigen Kapillare angeordnet ist, und über ein Mikrofluidiksystem Fluoreszenzfarbstoffe können pharmazeutische Mittel oder Arzneimittel in kleinen Mengen angewendet werden.

Einzigen Ebene Beleuchtungsmodul und Micro-Kapillar-Ansatz für ein Weitfeld-Mikroskop

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung von Motoneuron-Projektion und Axon Arborization in transgenen Hb9::GFP -Maus-Embryonen. Nach Immunostaining für Motoneuronen verwendeten wir Fluoreszenz lichtblattmikroskopie Bild Embryonen für anschließende Quantitative Analyse. Dieses Protokoll gilt für andere Neuron Navigation Prozesse in das zentrale Nervensystem.

Visualisierung von motorischen Axon Navigation und Quantifizierung der Axon Arborization In Mausembryonen mit Fluoreszenz-Lichtblattmikroskopie

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Eine detaillierte Anleitung ist wie ein stark geneigten bauen beschrieben fegte Kachel (HIST) Mikroskop und dessen Nutzung für die Einzelmolekül-Bildgebung.

Eine Anleitung zu einem stark geneigten bauen fegte Fliese Mikroskop für erweiterte Sichtfeld der Einzelmolekül-Imaging

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

Erfahren Sie den Bau eines anpassbaren einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken. Diese Methode ermöglicht dreidimensionale Bildgebung mit minimaler Photobleichung.

Design und Bau eines anpassbaren, einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken

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